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Técnicas Histológicas

y Microscopía
Histología
Griego histos: tejido logos: estudio
Se refiere al estudio morfológico (anatómico)
auxiliándose del microscopio.
En otras palabras histología es sinónimo de
“anatomía microscópica”
Breve Historia
Siglo XVII
 Robert Hook y Marcello Malpighi utilizaron lentes simples.
 Hook denominó“célula” a las celdas observadas e identifico su
núcleo.
 Malpighi es considerado “padre de la histología”

Siglo XVIII Leeuwenhoek desarrolla lentes compuestos

Siglo XIX
 Invención del micrótomo, de las técnicas histológicas y
microscopios compuestos mas avanzados.
 Teoría celular por Schleiden y Schwann.
 Virchow distingue los 4 tejidos básicos
Elementos a considerar para el estudio de los tejidos

 Preparación del tejido


 Para observación de células VIVAS
 Ventajas: observación directa de procesos fisiológicos in vivo
 Desventajas: Difícil manejo y poca duración
 Tipos de tinción utilizadas
 Vital (inyectando colorantes inocuos directo al animal)
 Supravital (inyectando colorante a células luego de su extracción del organismo)
 Para observación de células MUERTAS (conservadas)

 Uso del microscopio


Técnicas histológicas
Son las diversas maneras en que se pueden preparar lo
cortes.

También se puede definir como


“Pasos secuenciados con el fin de preparar un corte
histológico para que pueda observarse a través del
microscopio”
Pasos de la Técnica Histológica
1- Obtención de la Muestra
2- Fijación
 Lavado, Deshidratación y Aclaramiento

3- Inclusión
4- Corte
5- Tinción o Coloración
6- Montaje
1) Obtención de la muestra
Capturar un corte histológico o espécimen de un
animal anestesiado o después de la muerte. En
humanos es posible en cirugías al extirpar tejidos
enfermos
2) Fijación
El propósito es CONSERVAR el protoplasma
con el menor grado de alteración posible. Evita
la autolisis por enzimas liberadas por el propio
tejido.

 Detiene procesos celulares dinámicos


 Conserva intacta la estructura lo mas posible
 Aumenta la afinidad por determinados colorantes
 Confiere cierta rigidez al tejido
Formalina (formaldehido)*
Alcohol
Bicloruro de Mercurio
Bicromato de potasio
Simples
Ácido Pícrico – Acético – Ósmico
Glutaraldehido (Microscopia
FIJADORES electrónica)
Líquido de Bouin
ácido pícrico + ácido acético +
formalina
Compuestos Líquido de Zenker
ácido pícrico + bicloruro de
mercurio + bicromato de potasio
 Lavado, Deshidratación y Aclaración:
Previo a la inclusión se LAVA el tejido, luego se pasa por
concentraciones CRECIENTES de alcohol etílico hasta llegar a
concentración máxima (100%) para DESHIDRATARLO y
luego se ACLARAR consiste en eliminar el agente
deshidratante y sustituirlo por un liquido que se mezcle con el y
con el medio de inclusión .

ACLARADORES:
 Xilol
 Cloroformo
 Benceno
 Aceite de cedro
3) Inclusión (embebimiento)
Se coloca el tejido en medio de inclusión
(embebimiento) y luego se prepara el bloque
dejando solidificar el medio de inclusión para
tener una masa homogénea firme que contiene
el tejido incluido.
Finalidad de la inclusión:
Proporcionar un soporte rígido (bloque de tejido)
para facilitar el corte.
Medios de inclusión:
 Parafina
 Celoidina
5) Tinción (coloración)
Requisitos:
1) Aclarar (eliminar parafina) con XILOL,
TOLUOL u otro agente aclarador
2) Pasar por concentraciones DECRECIENTES
de alcohol
Propósito:
Destacar el contraste natural y hacer más
evidentes los componentes celulares y tisulares
del CORTE
6) Montaje
- Se quita el exceso de colorante lavando con agua o
alcohol (según solvente del colorante)
-Se deshidrata (alcohol en concentraciones
CRECIENTES)
-Se aclara: pasar el corte por una solución con el
aclarador.
-se coloca una gota de medio de montaje, esta posee
INDICE DE REFRACCIÓN IGUAL AL VIDRIO
Medio de montaje:
 Bálsamo de Canadá

- Se coloca un cubreobjetos encima de la preparación, se


deja secar. Estando el corte listo para su observación
microscópica y su almacenamiento.
Colorantes
Sustancias químicas orgánicas complejas
utilizadas para colorear componentes
celulares o extracelulares del corte
Se pueden considerar como “Sales
neutras con radicales tanto ácidos
como básicos”
Clasificación
 El criterio más simple es basar la clasificación
en el uso con respecto a los componentes
celulares y tisulares.
 Uso general: identifica núcleo y citoplasma

 Uso especifico: identifica componentes


particulares.
 Uso de Sales Metálicas : Precipitan en el Tejido y
forman depósitos metálicos.
Los colorantes de uso general son sales neutras que tienen
radicales tanto ácidos como básicos
 Por sus radicales (que donan)
 Ácidos  cuando la propiedad de tinción esta en el
radical ácido (acidofilas). Los colorantes ácidos tienen
carga negativa

 Coloración ROJO-ROSADO

 Básicos  cuando la propiedad de tinción esta en el


radical básico (basofilas). Los colorantes básicos tienen
carga positiva

 Coloración AZUL-VIOLETA
Colorantes ácidos Colorantes básicos para
para teñir teñir núcleo y algunas
citoplasma: organeras
 Eosina  Hematoxilina
 Ácido pícrico
 Hematoxilina férrica
 Ácidos azoicos
 Colorantes de anilina
 Cromotropo  Azur A
 Ácidos diazoicos  Azul de toluidina
 Azul de trípano  Azul de metileno
 Rojo de tripano  Azul brillante de cresilo

 Rojo neutro

 Verde de Janus
Los colorantes de uso específicos:
 Distinguen componentes de la matriz
extracelular
 Orceina o resorcina (fibras elásticas)
 Tricrómico de Masson (fibras colágenas de verde)
 Tricrómico de Mallory (fibras colágenas de rosa
intenso)
 Tricrómico de Mallory Azán (fibras colágenas de
azul)
 Sales metálicas que se precipitan en los tejidos
(impregnación argéntica)
 Sales de plata
 Sales de oro
Clasificación por su origen
 Sintéticos
 Eosina
 Naturales
 Animales: carmín
 Vegetales: hematoxilina, orceína

Clasificación por el color que adoptan


 Ortocromático: adopta el mismo color del colorante
 Metacromático: adquiere color diferente al utilizado
Métodos de Coloración
Coloración Directa
Afinidad entre el colorante y el objeto.
Coloración Indirecta
Requiere la intervención de intermediarios o mordientes para que
la coloración tenga lugar.
Coloración Progresiva
Se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto óptimo.
Coloración Regresiva
Se realiza primero una sobrecoloración y luego se elimina el resto
del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo
denomina Diferenciación.
Coloración Simple
Se colorean solamente algunos elementos del preparado (núcleo,
fibras elásticas, etc.).
Coloración Combinada
Se tiñen los elementos nucleares y citoplasmáticos
recurriéndose, generalmente, al empleo sucesivo de colores
básicos y ácidos que contrastan por sus colores. Ej.: H y E
Coloración Panóptica
Es una coloración combinada realizada sucesivamente por
colorantes neutros (May- Grünwald-Giemsa).
Coloración Pancrómica
En un solo baño colorante actúan todos los colorantes neutros
que se necesiten.
Histoquímica
Campo de la investigación cuyo objetivo es la localización de
compuestos químicos ya conocidos en regiones especificas o
componentes celulares por análisis bioquímico, que producen
sustancias coloreadas insoluble. Gracias a las propiedades
químicas o físicas inherentes del tejido.

componente: Metodo:
Iones hierro  Azul de Prusia (adaptación)
ADN  Reacción de Feulgen
Proteoglucanos  Reacción del ácido peryódico de Schiff (PAS)
Lípidos  Sudán III, IV, B negro
Enzimas in vivo  Sustrato + enzima = Producto coloreado
Glucógeno  Carmín de Best o PAS
Métodos más modernos
Inmunocitoquímica
Basada en inmunoflourescencia de complejos antigeno-
anticuerpo
Histoquímica con lectinas
Para observacion de hidratos de carbono
Radioautografia
Sustitución de una molécula determinada por su isótopo
radioactivo
Hibridación in situ
Para ácidos nucleicos. Se marcan con isótopos
radioactivos cadenas monocatenarias que se unen a
segmentos de las cadenas de ácidos nucleicos.
Artefactos
 Debido a la manipulación del tejido durante la técnica
histología no todos los cortes son perfectos. Una mala
manipulación durante la preparación puede llevar a
alteraciones que se llaman artefactos. Las cuales le
quitaran calidad al corte dificultando su interpretación.
• Encogimientos
• Precipitados
• Pliegues y arrugas
• Defectos de cuchilla
• Manejo poco cuidadoso
• Degeneración post-morte
Microscopio
Instrumento mas importante de la histología que mediante
un sistema óptico de lentes aumenta varias veces una imagen
Utilidad depende de:
Poder de resolución (capacidad del microscopio de separar
dos puntos que están muy unidos. Es el mas importante
porque de este depende que se vean mejor los DETALLES
Aumento: relación entre el tamaño de la imagen y el objeto
en valores lineales. No mejora los detalles con su incremento
oMicroscopio óptico
oMicroscopio de polarización

Microscopios de luz visible oMicroscopio de contraste de fases


oMicroscopio de interferencia
oMicroscopio de campo oscuro

oME de
transmisión
oMicroscopio electrónico (ME)

Microscopios de luz invisible oME de barrido

oMicroscopio de luz UV
Microscopia óptica (luz visible)
 Es el más utilizado
 Trabaja en dos etapas
 Primer aumento: OBJETIVO
 Segundo aumento: LENTE DEL OCULAR
 El haz de luz de la fuente se concentra en un punto por el CONDENSADOR
que lo dirige a la muestra que es atravesada y llega hasta el OBJETIVO (1era
etapa)
 Generalmente son 4 objetivos
 Pequeño aumento x 10
 Mediano aumento x 25
 Gran aumento x 40
 Inmersión en aceite x100
 Se multiplica por el aumento que brinda el LENTE (generalmente x 10)

ENTONCES

Pequeño aumento 10 x 10 = 100 veces


Mediano aumento 25 x 10= 250 veces
Gran aumento 40 x 10= 400 veces
Inmersión en aceite 100 x 10= 1000 veces
Microscopio de polarización
Utiliza dos primas (analizador y polarizador) para la observación de muestras
birrefringentes como fibras musculares, fibras del tejido conectivo.

Microscopio de contraste de fases


El contraste es una variación de intensidad de la luz y se puede observar con la
colocación de placas ópticas en el condensador y el objetivo para convertir
diferencia de fases en diferencias de amplitud de onda

Microscopio de interferencia
Se envían dos haces de luz que se unen en la muestra, provocando un retraso que
permite medir el grosor del espécimen

Microscopio de campo oscuro


Utiliza un condensador especial que no permite que la luz llegue directamente al
centro del lente, sino OBLICUO por lo que se verá oscuro y las pequeñas
partículas se visualizaran como “polvo que entra por una ventana en un
cuarto oscuro”. Útil para observar quilomicrones
Microscopios de luz invisible
Microscopio de luz UV
Utiliza lentes de cuarzo y registra imágenes que absorben
radiación ultravioleta en fotografías. Posee un subtipo
que es la microscopia por fluorescencia
Microscopio Electrónico de transmisión
Su fuente de iluminación es un haz de electrones
acelerados al vacío que pasa a través de la muestra y se
observa en una pantalla. Mayor poder de resolución
(0.2 – 0.3 nm)
Microscopio Electrónico de centelleo
Haz de electrones son bombardeados en la superficie de la
muestra de la que se desprenderán electrones primarios
y secundarios que se recogen en un punto registrado
por video.
Microscopio electrónico
Diseñado por David A. Terrero S.

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