CLONACIN ACELULAR: REACCIN EN
CADENA DE LA POLIMERASA, PCR
Dr. Benjamn Paz Aliaga
BIOTECNOLOGA MDICA
Ing. Cinthia Crdova Barrios
INTRODUCCIN GENERAL A LA
CLONACIN
Conjunto de elementos genticamente idnticos entre s y a su precursor.
Clonacin es una amplificacin gentica
CLONACIN
CLONACIN DE MOLCULAS
CELULAR:
Con clulas, es la
amplificacin de un
inserto, asistida por
vectores en clulas
anfitrionas en cultivo.
Tecnologa del DNA
recombinante
ACELULAR: Clonacin de
molculas sin la
intervencin de clula
alguna, amplificacin in
vitro de molculas de
DNA y RNA mediante la
reaccin en cadena de la
polimerasa.
PCR
Amplificacin directa de un gen
o un fragmento de DNA o
cDNA, presentes en mezclas de
muy diversas fuentes.
Amplificacin
Deteccin
APLICACIONES
Clonacin acelular de fragmentos de DNA.
Deteccin de secuencias.
Secuenciacin de cido nucleicos.
Establecimiento de polimorfismos de secuencia.
Rastreo de mutaciones.
Tipado de DNA para transplante.
Diagnstico de enfermedades genticas.
Resolucin de problemas forenses.
Resolucin de problemas arqueolgicos.
Estudios evolutivos.
Deteccin de clulas tumorales.
Deteccin de microorganismos infecciosos.
PCR: REQUERIMIENTOS:
Oligonucletidos
sintticos de cadena
sencilla de 18 a 30 nt.
Sus secuencias son
complementarias a
los dos extremos 3
de la regin diana. La
posicin donde
hibridan los
cebadores define la
longitud del
fragmento.
DNA polimerasa
Sustratos para la
sntesis de las
innumerables copias
de DNA y el cofactor
(Mg de 1-4 mM)
Cebadores o primers
dNTPs y Mg
Termociclador
Termoestable y activa
a temperaturas
relativamente altas
(95C).
Polimerasa taq
(Thermus aquaticus)
Enfriamiento
rpidos por debajo
de Tm. Hibridacin
de las hebras
sencillas del DNA
con los cebadores.
Tiempo:10-120 s.
Temperatura: 37-65
C
Elongacin
Calentamiento para
la separacin de las
dos hebras del
DNA.
Tiempo: Incubacin
(30-120 s).
Temperatura: 68-97
C
Templado o hibridacin
Desnaturalizacin
PCR: ETAPAS DEL PROCESO
Amplificacin, DNA
pol elonga los
cebadores,
empleando como
molde ambas
hebras originales
Tiempo: Incubacin
(1-3 min).
Temperatura: 72-75
C
S e aade una etapa previa y una final al conjunto de todos los ciclos.
Previa antes de la desnaturalizacin para inactivar proteasas y nucleasas
ltima, prolongacin de la ltima elongacin, que permita que se
completen todos los fragmentos.
PCR: ETAPAS DEL PROCESO
PCR: ETAPAS DEL PROCESO
PCR: ETAPAS DEL PROCESO
PCR: ETAPAS DEL PROCESO
PCR: AMPLIFICACIN GLOBAL
N de ciclos
realizados
N total de
copias
N de copias
largas
N de copias
dianas
Dianas/total
25%
16
50%
32
10
22
69%
10
1024
20
1004
98%
20
~ 106
40
~ 106
99.996%
40
~ 1012
80
~ 1012
100%
2X
2X
2X- 2X
Alta, puede
detectar una
nica molcula
de DNA
N= nmero de copias.
N0= nmero de molculas iniciales.
R= rendimiento de cada ciclo (0.7 o 0.8)
X= nmero de ciclos
Fidelidad
Elevada,
determinada
por la
secuencia de
los cebadores
y las
condiciones
del templado.
Capacidad de deteccin
De cada etapa,
debe
optimizarse
dependiendo
de la secuencia
concreta que
se quiera
amplificar
Especificidad
Los productos
de cada ciclo
sirven de
molde para el
siguiente, la
acumulacin de
copias es
exponencial.
Duracin
Rendimiento
CARACTERSTICAS DEL PROCESO
Capacidad de
copiar
secuencias con
precisin, sin
introducir
mutaciones
AUTOMATIZACIN DE LA PCR
Se utiliza termocicladores, para programar los cambios de
temperatura segn el carcter cclico del proceso.
Permite la realizacin de un nmero elevado de ciclos.
Se aumenta la precisin del proceso.
VARIANTES DEL MTODO:
PCR larga o
L-PCR
Supera los lmites de la PCR convencional
Amplifica con fidelidad regiones diana de gran tamao
Se aade otra enzima.
PCR anidada
Realizar una segunda reaccin de PCR con dos
cebadores nuevos que hibridan dentro del fragmento
diana amplificado por el primer par
PCR inversa
Clonar regiones desconocidas de un DNA, situadas en
posicin vecinal a secuencias diana conocidas.
Amplificar la regin externa que flanquea a los
cebadores.
VARIANTES DEL MTODO: PCR ANIDADA
VARIANTES DEL MTODO: PCR INVERSA
VARIANTES DEL MTODO: PCR INVERSA
VARIANTES DEL MTODO:
PCR con
adaptadores.
PCR asimtrica
RT-PCR
Puede amplificarse una regin de DNA de
secuencia desconocida ligando a sus fragmentos de
restriccin unos adaptadores.
Se generan copias de hebra sencilla de un DNA.
Se aaden cantidades muy diferentes de ambos
cebadores.
Amplificacin de RNA a travs de la sntesis previa
de su cDNA, que despus se amplifica por PCR.
VARIANTES DEL MTODO: PCR CON
ADAPTADORES
VARIANTES DEL MTODO: RT-PCR
VARIANTES DEL MTODO: RT-PCR
VARIANTES DEL MTODO: PCR REAL
TIME
Amplificar y simultneamente cuantificar de forma absoluta el producto.
Requiere de molde de ADN, cebadores, dNTPs, polimerasa
termoestable y fluorforo
Se requiere de un termociclador termociclador con capacidad de hacer
incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda
determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo
excitado.
