Western blot

Macias Izquierdo Andy

Grupo 5

Principio de la tcnica
1. Separacin de los antigenos de lisado
viral con sulfato de sodio dodecil (SDS).
2. Transferencia (absorcion) de los
antigenos separados a papel de
nitrocelulosa, y
3. Prueba de la muestra del suero
desconocido directamente en la
membrana absorbente utilizando una
tcnica similar a la E.L.I.S.A

Materiales
Suero problema del paciente
Bandeja Pocillo
pipeta de Pasteur
Kit de western blot :

TAMPON DE LAVADO DILUIDO ( 1: 19 )

TAMPOM BLOTTING DE TRABAJO ( 1: 9)
CONJUGADO
SUSTRATO
TIRAS DE NITROCELULOSA
SUSTANCIA CONTROL

Procedimiento de la tcnica
1. Aada 2 ml de Tampn de lavado diluido a
cada pocillo.
2. Coloque cada tira en su pocillo con el
nmero hacia arriba (incluir tiras para los
tres controles).
3. Incubar durante 2 minutos a temperatura
ambiente en un plato basculante (12-16
ciclos/min). Extraiga el tampn por pocillo.
4. Aada 20 micro litros de suero del paciente
o de control en cada uno de los pocillos.

5. Cubra la bandeja e incube 1 hora a

temperatura ambiente en la plataforma
basculante.
6. Incline la bandeja para aspirar la mezcla
de los pocillos.
7. Lave tres veces cada tira con 2 ml de
Tampn de trabajo diluido dejando que se
empapen durante 5 min en la plataforma
durante los lavados.
8. Aspire el sustrato y aclare las tiras 3 veces
con agua de calidad reactivo para detener
la reaccin.

9. Dejar secar las tiras dentro de los

pocillos o en toallas de papel.
10.Coloque las tiras en una hoja de trabajo,
observe las bandas y califique los
resultados

INTERPRETACION DE LOS
RESULTADOS
POL: ENZIMAS - transcriptasa reversa
GAG: CAPSIDE
ENV: ENVOLTURA

Peso molecular

Gen

Antgeno

Descripcin

gp 160

ENV

Forma polimrica
de la gp 41

Ancha y difusa de
glucoprotena

gp 120

ENV

Membrana
externa

Difusa de
glucoprotena

P 66

POL

Transcriptasa
inversa

Banda discreta

P 55

GAG

Protena
precursora

Banda discreta

P 51

POL

Transcriptasa
inversa

Banda discreta
justo por debajo
de p 55

P 39

GAG

Fragmento de p
55

Banda discreta

gp 41

ENV

Transmembrana

Difusa de
glucoprotena

P 31

POL

endonucleasa

Doblete

P 24

GAG

Protena central

Banda ancha

P 17

GAG

Protena central

Banda ancha

ORGANIZACIN

CRITERIO DE POSITIVIDAD

ASTPHLD/CDC

Cualquiera par: p24, gp 41 gp120/160

FDA

Presencia de: p24 , p31 y gp41

Gp120/160

Standardizacin Serologa Al menos dos bandas: p24 p31 y gp41 o

Consorcio de Retrovirus
gp 120/160
(CRSS)

American Red Croos

Tres bandas, una de cada producto.

Del genoma: env, gag y pol.

NTERPRETACIN

PERFIL

POSITIVO

2 ENV + GAG + POL

INDETERMINADO

1 ENV + GAG + POL

GAG + POL
GAG
POL

NEGATIVO

Ninguna banda
Bandas no significativas