Programa de corrida (Protocolo en sistema)

Pre incubación Stage 1

1 ciclo
T° Tiempo (s) Optical
1 37°C 300 s Off
2 95°C 600 s Off
Amplificación Stage 2
50 ciclos
1 95°C 5s Off
2 63°C 60s On
3 72°C 60s Off

Cuantitativo
1. Saque el número necesario de tiras de tubo PCR de la bolsa de aluminio. Use tijeras o
bisturí para cortar las tiras. Selle bien la bolsa después y guárdela en las condiciones
recomendadas.
2. Coloque las tiras de tubo PCR que contienen los reactivos liofilizados en un bastidor
de tubo PCR adecuado. Compruebe que los pellets de reactivos están en la parte
inferior de los tubos. Si no es así, centrifugar brevemente o mover los pellets hacia
abajo antes de proceder.
3. Retire las tiras de tubo con precaución y deseche las tiras de la tapa.
Nota: No deje las tiras abiertas durante largos períodos de tiempo. Para evitar la
absorción de líquidos no deseados, abra las tiras sólo poco antes del llenado.
4. Pipet 25 µl de muestra en cada recipiente PCR:
 Para las muestras de interés, agregue 25 µl de muestra de ADN (si utiliza menos
volumen, agregue Control Negativo para alcanzar 25 µl.
 Para el control negativo, añada 25 µl de Control negativo de levadura y moho a
prueba de alimentos® (vial 3, tapa incolora).
 Para la curva estándar, añada 25 µl de cada dilución (por duplicado) de Estándar
de cuantificación de levadura y moho a prueba de alimentos® (vial 2, tapa
púrpura) para generar la curva estándar respectiva (ver tabla a continuación).
Nota: Por lo tanto, un experimento típico consta de 9 reacciones necesarias para los
controles, más n x reacciones necesarias para las muestras de interés, donde (n)
indica el número de muestras de alimentos de interés. Dado que se pueden hacer 96
reacciones con el kit, se pueden analizar hasta 87 muestras cuantitativamente durante
una ejecución de PCR.

Curva de Calibración
La cuantificación del contenido de levadura y moho mediante el procedimiento de curva
estándar requiere la dilución escalonada del estándar de cuantificación de levadura y
moho a prueba de alimentos® (vial 2, tapa púrpura) con él control negativo levadura y
moho a prueba de alimentos® (vial 3, tapa incolora) como se muestra a continuación.
Preparar cada paso de dilución con un volumen final de 100 µl usando 10 µl del paso de
dilución anterior.

5. Selle los recipientes con precisión con las tiras de tapa incoloras.
Nota: Resuspender el pellet después de sellar mezclando las tiras de tubo a fondo.
Para reducir el riesgo de contaminación cruzada, se recomienda preparar una sola tira de
tubo PCR a la vez.
6. Gire brevemente las tiras de tubo PCR en una centrífuga adecuada durante 5
segundos solamente.
7. Ciclo de las muestras como se describió anteriormente.
8. Para utilizar el instrumento LightCycler 480 es necesario un adaptador especial
(Order No. Z 100 24). Para algunos instrumentos PCR, las tiras de PCR deben
colocarse en un orden equilibrado en el bloque del ciclor. Por ejemplo, se pueden
colocar dos tiras en las columnas 1 y 12.
Definir las posiciones de las diluciones del estándar de cuantificación de levadura y moho
a prueba de alimentos® como "estándar" con las respectivas concentraciones dadas en la
tabla anterior para generar una curva estándar. Alternativamente, se puede importar una
curva estándar dada de una ejecución de PCR anterior, si el instrumento de PCR en
tiempo real proporciona esta oportunidad. El estándar de cuantificación de levadura y
moho a prueba de alimentos® se define como GE/reacción. El uso de la curva de
calibración da como resultado un valor para cada muestra analizada. Este valor se puede
convertir en muestra cfu/g de acuerdo con la siguiente ecuación. Se recomienda utilizar el
documento "Plantilla de cuantificación de levadura y moho" de BIOTECON Diagnostics
para el análisis.

Cualitativa detección
1. Saque el número necesario de tiras de tubo PCR de la bolsa de aluminio. Use tijeras o
bisturí para cortar las tiras. Selle bien la bolsa después y guárdela en las condiciones
recomendadas.
2. Coloque las tiras de tubo PCR que contienen los reactivos liofilizados en un bastidor
de tubo PCR adecuado. Compruebe que los pellets de reactivos están en la parte
 inferior de los tubos. Si no es así, centrifugar brevemente o mover los pellets hacia
abajo antes de proceder.
3. Retirar las tiras de tubo con precaución y desechar las tiras de la tapa.
Nota: No deje las tiras abiertas durante largos períodos de tiempo. Para evitar la
absorción de líquidos no deseados, abra las tiras sólo poco antes del llenado.
4. Pipet 25 µl de muestra en cada recipiente PCR:
 Para las muestras de interés, agregue 25 µl de ADN de muestra (si utiliza menos
volumen, agregue Control Negativo para alcanzar 25 µl).
 Para el control negativo, añada 25 µl de ® yeast and Negative Control a prueba de
alimentos (vial 3, tapa incolora).
 Para un control positivo, añada 25 l a prueba de alimentos® estándar de
cuantificación de levadura y moho (vial 2, tapa púrpura).
Nota: Para reducir el riesgo de contaminación cruzada, se recomienda preparar solo una
tira de tubo pcR a la vez.
5. Selle los recipientes con precisión y firme con las tiras de tapa incoloras.
6. Mezclar bien con una centrífuga de vórtice.
Nota: BIOTECON Diagnostics recomienda centrífugas de vórtice Multispin MSC-6000 (D
110 66) para tiras PCR o centrífuga de vórtice CVP-2 para placas PCR (D 110 67).
Protocolos dedicados están disponibles para esta centrífuga.
Nota: Alternativamente resuspender el pellet por mezcla manual. Esto se puede lograr
pipeteando con precaución la muestra hacia arriba y hacia abajo varias veces durante el
paso 4 o volteando las tiras de tubo después de sellar mientras presiona la tapa hacia
abajo.
7. Gire las tiras de tubo PCR durante 30 segundos a 150 – 200 g en una centrífuga
adecuada.
Nota: If your centrifuge exceeds 200 g, do not centrifuge for more than 5 seconds. Avoid
centrifugation at forces exceeding 1000 g!
8. Coloque las muestras en su ciclor PCR y ejecute el programa como se describió
anteriormente.
Nota: Para utilizar el instrumento LightCycler 480 es necesario un adaptador especial
(Order No. Z 100 24). Para algunos instrumentos PCR, las tiras de PCR deben colocarse
en un orden equilibrado en el bloque del ciclor. Por ejemplo, se pueden colocar dos tiras
en las columnas 1 y 12.