Instituto Politécnico de la salud

POLISAL-UNAN – Managua
Departamento de Bioanálisis Clínico
Carrera de Microbiología
Tema
Protocolo de BLEE

Autores:

 Hansell Tomas Reyes Mejía

Docente: Oscar Arvizu

Fecha: 13/03/2022
Objetivos
Desarrollar y evaluar un ensayo de detección molecular para la identificación de cepas
productoras de CTX-M β-lactamasa.
Investigar si los genes codificadores de las enzimas están presentes en las cepas
productoras de BLEE de E. coli y K. pneumoniae.

Introducción

Amplificación de PCR para la detección de genes de -lactamasa. Todos los aislamientos

fueron criados para los genes de resistencia SHV, TEM, CTX-M y OXA mediante un
ensayo de multiplexPCR utilizando primers universales (3, 8, 12, 15). La DNA extracción
bacteriana se realizó en un sistema de LC Magna Pure (Roche DiagnosticsGmbH,
Mannheim, Alemania) utilizando un kit de aislamiento de ADN de LC Magna Pure I.

Las reacciones de amplificación de PCR se realizaron en un volumen de 25 l con 12,5 l de

mezcla maestra de PCR multiplex Qiagen 2 (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania),
concentraciones de 0,2 M de cada imprimador y 2 l de plantilla de ADN.

Proceso en el PCR
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que permite la amplificación
exponencial de un fragmento específico de genoma (un gen o una determinada secuencia de
ADN) o ADN complementario (ADNc). Ambas hebras del ADN blanco son duplicadas o
replicadas mediante la síntesis enzimática dirigida por una ADN polimerasa termoestable,
que es cebada por 2 oligonucleótidos, y cuyo sustrato son los dNTPs en un medio
amortiguador adecuado. Se pueden amplificar fragmentos comprendidos entre 100 y 10000
pb, aproximadamente. Se utiliza con diversos propósitos, como, por ejemplo, realizar la
identificación de un microorganismo por presencia o ausencia de una secuencia específica
de género o especie, seleccionar clones por la presencia de ciertos genes asociados a
virulencia, resistencia a antibióticos, establecer relaciones entre cepas durante brotes o en
estudios epidemiológicos.

Electroforesis

La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica cuya magnitud depende del pH
del medio en el que se encuentran; como consecuencia, pueden desplazarse cuando se ven
sometidas a un campo eléctrico hacia el polo de carga opuesta al de la molécula. A
diferencia de las proteínas, que pueden tener una carga positiva o negativa, los ácidos
nucleicos sólo poseen carga negativa, debido a su esqueleto de fosfatos. Por lo tanto, en una
electroforesis, los ácidos nucleicos migrarán hacia el polo positivo; es decir, el ánodo. En el
caso de las proteínas se realiza pretratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de
sodio (SDS), que les confiere carga negativa; con ello se homogenizan las proteínas de la
muestra y todas migrarán hacia el polo positivo, y sólo se separarán por tamaño.

El principio de la electroforesis consiste en la migración proporcional de las moléculas a

través de un gel u otro tipo de matriz porosa, según su peso molecular o tamaño;
movimiento generado por el campo eléctrico.

Procedimiento

Se procede a elaborar el gel de agarosa al 2%, para elaborarlo se utiliza 2gr de agarosa que
se disuelve en un matraz ex profeso con 100ml de Buffer TAE 1X; luego, se coloca a
calentar la mezcla en un microondas por 30 segundos unas 4 veces hasta que esta hierva,
pero sin dejar que se derrame. Se debe tratar de obtener una mezcla homogénea. Se procede
a agregar la mezcla en la cámara, al colocar la mezcla se tiene que tener cuidado en no
provocar la formación de burbujas, luego se colocan los peines. Se deben esperar 30
minutos para que la mezcla de agarosa se solidifique, luego se agrega buffer de manera que
este cubriera toda la superficie del gel.

Transcurridos los 30 minutos, se retiran los peines y al ser retirados se pueden notar los
pozos que quedan en el gel. Se procede a preparar la mezcla que serán mezcladas con el
ADN y luego incorporado esto al gel, combinando en un eppi, loudy y gel red en una
proporción de 9:1. En una cinta estéril colocada encima de la mesa, se procederá a realizar
una mezcla destinada a la monta de la muestra, en la cual, con una pipeta se tomarán 2 µl
de la mezcla poniéndolos en la cinta, luego se agregó 6 µl de la muestra y se procede a
mezclar con la pipeta tres veces.

Al momento de montar la muestra, se lleva la pipeta con la mezcla hacia el respectivo pozo
del gel situado en la cámara, para montarla con éxito se debe tener mucho cuidado al
posicionar la punta de la pipeta, teniendo en cuenta el ángulo de esta y que la punta no
toque el fondo del pozo, al estar seguros de la posición se procede a expulsar la muestra
presionando el embolo de la pipeta hasta sacarla del medio para que la misma no succione
la muestra nuevamente y finalmente se descarta la punta.

La cámara se conecta a la máquina que transmite cargas positivas y negativas, la cual, se

deja actuar a 120 volts por 45 minutos. Transcurridos los 45 minutos, se procede a sacar el
gel y se pasa al transluminador UV para observar las bandas todo esto solo es posible con
los siguientes parámetros:

Los parámetros de ciclo fueron los siguientes: Una desnaturalización inicial a 95°C durante
15 min; seguida de 30 ciclos de 94°C durante 30 s, 62°C durante 90 s y 72°C durante 60 s;
Y con una extensión final a 72 °C durante 10 min. Los productos de PCR amplificados se
sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,5%

Se incluyeron como referencias cepas con tipos conocidos de lactamasa. Estas fueron cepas
de E. coli con blaCTX-M-1, blaCTX-M-2, blaCTX-M-9, J62-blaTEM-1, J53-blaTEM-2,
J53-blaSHV-1, J53-blaSHV-2, y J53-blaOXA-1 y K. pneumoniae 1204-blaSHV-2 (12),
amablemente proporcionados por D. Livermore, Health Protection Agency, Londres, Reino
Unido. Los aislamientos detectados como genes CTX-M positivos en la PCR múltiple se
identificaron mediante primers diseñados internamente para el grupo CTX-M-1, el grupo
CTX-M-2 (CM21, 5-GGA GAA AAG TTC GGG AGG TC-3; CM22, 5-GCT TAT CGC
TCT CGC TCT GT-3), y el grupo CTX-M-9 (CM91, 5-ACG TGG CTC AAA GGC AAT
AC-3; CM92, 5-CGG CTG GGT AAA GGT CA-3), respectivamente, en PCRs con una
temperatura de recocido a 55°C.

Materiales

 Matraz de 250 ml
 Probeta 100 ml
 Micropipetas  Parafina
 Microondas  Buffer de carga
 EPP (Equipo de Protección personal)  GelRed
 Puntas plásticas  Loudy
 Trasiluminador UV  Marcador molecular
 Balanza en MG  Camara y peines
 TBE 1X
 Agarrosa al 1.5X
 Protocolo de PCR para la detección de los genes SHV, TEM,
CTX-M y OXA codificadores de BLEE
Nombre del primer Gen Secuencia 5´--- 3´

BlaSHV F Bla SHV CTT TAT CGC CCC TCA CTC AA

BlaSHV R AGG TGC TCA TCA TGG GAA AG
BlaTEM F Bla TEM CGC CGC ATA CAC TCT CAG AAT GA
BlaTEM R ACG CTC ACC GGC TCC AGA TTT AT
BlaCTX-M F Bla CTX-M ATG TGC AGY ACC AGT AAR GTK ATG GC
BlaCTX-M R TGG GTR AAR TAR GTC ACC AGA ATC AGC GG
BlaOXA F Bla OXA ACA CAA TAC ATA TCA ACT TCG C
BlaOXA R AGT GTG TTT AGA ATG GTG ATC

GEN Tamaño del amplicón Ciclado

BlaSHV 222 pb Desnaturalización Inicial = 95ºC por 15 minutos
BlaTEM 445 pb Ciclado = 30 ciclos a 94ºC por 30 segundos, 62ºC por
BlaCTX-M 593 pb 90 segundos y luego a 72ºC por 60 segundos.
BlaOXA 813pb Extensión Final = 72ºC por 10 minutos.

Reacción de PCR -> Vol.Final = 25 µl

Reactivo Volumen
Buffer 10X 2.5 µl
MgCl2 (50 mM) 1 µl
dNTPs (10 mM) 1 µl
Taq Polimerasa 1 µl
Primer Forward (SHV) 0.5 µl
Primer Reverse (SHV) 0.5 µl
Primer Forward (TEM) 0.5 µl
Primer Reverse (TEM) 0.5 µl
Primer Forward (CTX-M) 0.5 µl
Primer Reverse (CTX-M) 0.5 µl
Primer Forward (OXA) 0.5 µl
Primer Reverse (OXA) 0.5 µl
Agua sigma 13.5 µl
ADN molde 2 µl
Buffer 10X 2.5 µl
Vol. Final 25 µl
 Referencias
Molecular Epidemiology of Extended-Spectrum -Lactamases among
Escherichia coli Isolates Collected in a Swedish Hospital and Its
Associated Health Care Facilities from 2001 to 2006 Hong Fang, Ferda Ataker, Go ̈ran
Hedin, and Kathrine Dornbusch
Department of Clinical Microbiology, Karolinska University Hospital Huddinge,
Karolinska Institute, SE-141 86 Stockholm, Sweden