PRÁCTICA 3: EXTRACCIÓN DE ADN EN SANGRE (U.D.

3)

Toma de muestras
La extracción de ADN se puede realizar a partir de cualquier célula o tejido de un ser vivo. En
esta práctica realizamos la extracción de ADN genómico a partir de los leucocitos de una
muestra de sangre.

1. Recoger la sangre en tubos que contengan 15 % EDTA para reducir la degradación del ADN y
coagulación (otros anticoagulantes como el citrato de sodio o heparina también funcionan
bien).

2. Muestras frescas pueden conservarse a 4ºC por no más de 5 días.

3. Muestras congeladas son estables a -80ºC por dos años.

Material y equipo
1. Microtubos estériles tipo Eppendorf de 1,5 mL y gradillas.
2. Baño de agua a 37ºC.
3. Vortex
4. Microcentrífuga
5. Micropipetas
6. Puntas de pipeta con filtro
7. Tiras de papel absorbente estéril.

Reactivos necesarios
Solución de Lisis RBC

Solución de Lisis (si la solución de lisis contiene un precipitado debido a las bajas temperaturas,
incubar a 37ºC y mezclar para disolver el precipitado)

Solución de Precipitación de proteínas

Solución de Hidratación

Isopropanol

Etanol 70%

Procedimiento
1. Añadir 300 l de sangre en un microtubo que contenga 900 l de Solución Lisis de RBC.
Mezclar e incubar durante 10 minutos a Tª ambiente. Invertir el tubo varias veces durante la
incubación.

2. Centrifugar durante 20-30 segundos a 13.000-16.000 x g. Eliminar el sobrenadante con

pipeta sin dañar el pellet visible de células y dejar 10-20 l de líquido residual.
3. Mezclar con un vortex el microtubo para resuspender el pellet, lo cual ayudará a la lisis
celular del paso 4.

4. Añadir 300 l de Solución de Lisis y resuspender mediante pipeta para lisar las células. Es
muy importante observar la solución homogénea sin grupos celulares, se recomienda la
incubación a 37ºC durante 5 minutos o hasta que se observe la solución homogénea.

5. Enfriar la muestra a Tª ambiente.

6. Añadir 100 l de Solución de Precipitación proteica al lisado celular. Mezclar vigorosamente

con un agitador tipo vórtex a máxima velocidad durante 20-30 segundos.

7. Centrifugar a 13.000-16.000 x g durante 3-5 minutos. Se formará un precipitado marrón

oscuro. Si se observan partículas flotando volver a centrifugar después de incubar 5 minutos
en hielo.

8. Traspasar el sobrenadante que contiene el ADN a un microtubo nuevo que contenga 300l
de Isopropanol.

9. Mezclar por inversión unas 50 veces.

10. Centrifugar a 13.000-16.000 x g durante 2 minutos. El ADN será visible como un pellet
blanco.

11. Eliminar el sobrenadante y secar el tubo de forma breve en papel absorbente. Añadir 300
l de Etanol 70% para lavar el ADN.

12. Centrifugar a 13.000-16.000 x g durante 1 minuto. Cuidadosamente eliminar el

sobrenadante sin tocar el pellet de ADN.

Se puede volver a centrifugar brevemente para recoger con una micropipeta las últimas gotas
de etanol residual evitando tocar el pellet de ADN.

13. Invertir el microtubo en un papel absorbente y dejar secar durante unos 15 minutos. (El
tubo se puede dejar secar abierto en el interior de una cabina de flujo laminar)

14. Añadir 100 l de la Solución de Hidratación y resuspender con micropipeta.

15. Conservar a 2-8ºC. Para almacenajes largos conservar a -20ºC o - 80 ºC.

Observaciones

Realizar la cuantificación del ADN extraído (nanodrop) y valoración de los resultados.

Identifica las diferentes fases en la extracción y purificación del ADN que acabamos de realizar.

¿Qué método de purificación hemos empleado?

1) Realizar cuantificación del ADN extraído (nanodrop) y valoración de los resultados.

Concentración (ng/µl): 2.2

A260/A280: 2.33
A260/A230: 0,64

Podemos concluir que la concentración obtenida tras la extracción y purificación del no ADN tiene
el grado de pureza adecuado dado que en la A260/A280 ha sido superior, lo que nos indica una concentración
de ARN elevada.
El el cociente A60/A230, nos indica la presencia de contaminantes, por lo que seria conveniente precipitar y
lavar nuevamente el acido nucleico.

2) Identifica las diferentes fases de la extracción y purificación que acabamos de hacer:

Extracción: Pasos del 1- 4 donde nos encontraremos con la lisis celular y liberación de los ácidos nucleicos al medio

Precipitación proteica al lisado celular: Pasos del 6 - 7 salting-out

Precipitación ADN: Pasos 8 -13 Traspaso del sobrenadante y precipitación del ADN con isopropanol, y lavados para
eliminar impurezas con etanol.

Resuspensión ADN y conservación: Paso 14-15 con solución de hidratación

3) Que método de purificación hemos empleado.

Purificación con sales (salting-out)