Fundamentos y aplicaciones de la citometría de flujo

Diego Alignani, PhD

Laboratorio de Citometría de Flujo
CIMA LAB DIAGNOSTICS – UNAV
Citometría de Flujo

La citometría de flujo es una tecnología que permite determinar las

características de partículas o células suspendidas en un líquido que
pasan gran velocidad a través de la luz de un láser

•Parámetros físicos como el tamaño o la complejidad celular interna

•Cualquier componente o función celular que pueda ser detectado

mediante un compuesto fluorescente

•Múltiples parámetros simultáneamente de manera rápida y

cuantitativa en células individuales

Parámetros físicos de las células
Morfológicamente las células difieren en:
•Tamaño
•Complejidad celular
Citometría de Flujo
Fuente de Luz: Forward Scatter
Láser (405, 488, 633nm) Tamaño celular
(488 nm)
Side Scatter
Complejidad celular
(488 nm)
Forward Scatter (FSC) Side Scatter (SSC)
Se mide a lo largo del eje de Se mide a 90º del eje de incidencia
incidencia de la luz de la luz
Es directamente proporcional al Es directamente proporcional a la
tamaño de la célula o partícula complejidad (granularidad) de la
célula o partícula
 Citometría de Flujo

Diferenciación por tamaño y complejidad mediante citometría

de flujo
Debris
Granulocitos
Side scatter SSC

Monocitos

Linfocitos

Forward scatter FSC

 Citometría de Flujo
Detección de fluorocromos

f-
λy
nm
FITC
λ= 488nm λ= 530nm λx
e-
nm

λx nm < λy
nm

Fluorocromos:
•Absorben energía de la fuente de luz (láser de
determinada longitud de onda)

•Liberan la energía absorbida mediante la

emisión de fotones de menor energía (mayor
longitud de onda)
 Citometría de Flujo

FITC
(488nm) (520nm)

PE
(488nm) (578nm)

APC
(633nm) (650nm)

Anticuerpos monoclonales dirigidos contra diferentes moléculas y conjugados a fluorocromos

con diferentes espectros de absorción y emisión de luz pueden ser utilizados simultáneamente
 Citometría de Flujo

Intensidad de Fluorescencia
101 102 103 104
Número de células

101 102 103 104 101 102 103 104

Intensidad de Fluorescencia Intensidad de Fluorescencia

•La señal de fluorescencia medida es proporcional a la cantidad de

moléculas de fluorocromo unidas a las células
 Citómetros de Flujo
OPTICA EXCITACIÓN FL1 FL2 FL3 FL4
LÁSERES LASER AZUL (488 nm) 520
530/30 578 695 785
585/42
>670
780/60

Software análisis
SISTEMA OPTICA DETECCIÓN FL5 FL6
FLUIDOS 660
FOTOMULTIPLICADORES
LASER ROJO (640 nm)
ESPEJOS/FILTROS
660/20 785
780/60

ELECTRONICA
DIGITAL LASER VIOLETA (405 nm) FL7 FL8

491
450/50
502-525
 Citómetros de Flujo
Sistema de fluidos

Cytoflex LX FACS Canto II

Muestra Buffer de arrastre Muestra Buffer de arrastre

(Low) (High)

Transportar y enfocar la muestra en el punto de interrogación.

 Citómetros de Flujo
Sistema óptico

Miltenyi Biotec and/or its affiliates

Láseres
 Citometría de flujoCitómetros de Flujo
Detectores
Detector FSC
TAMAÑO CELULAR

Detector SSC
COMPLEJIDAD CITOPLASMÁTICA

Anchura (W)
Altura (H): Área (A):
intensidad máxima de fluorescencia cantidad total de fluorescencia
que emite la célula que emite la célula

Anchura (W):
duración señal fluorescente
 Citómetros de Flujo
Detectores

Introduction to Flow Cytometry: A Learning Guide. BD

 Citómetros de Flujo
Detectores

VOLTAJE/GANANCIA
DETECTORES
 Citómetros de Flujo
Detectores
SENSIBILIDAD
RESOLUCIÓN
DETECTORES Q B DETECTORES

CITÓMETRO B CITÓMETRO E
DETECTOR G560 DETECTOR G560

Q < 0,005 Q = 0,29

fotoelectrones/molécula PE fotoelectrones/molécula PE

Voltaje Voltaje
Perfetto et al.
Cytometry A. 2014 85(12):1037-48.
doi: 10.1002/cyto.a.22579
 Calibración voltajeCitómetros
detectores de Flujo

Detectores

Perfetto et al.
Cytometry A. 2014 85(12):1037-48.
doi: 10.1002/cyto.a.22579

Dentro del rango lineal del detector.

Mínima contribución del ruido electrónico a las poblaciones
más débiles.

Máxima separación entre población positiva y negativa.
 Calibración voltajeCitómetros
detectores de Flujo

Detectores
Compensación electrónica
 FITC PE

FL1 FL2 FL3 FL4 FL5 FL6 FL7 FL8 FL1 FL2 FL3 FL4 FL5 FL6 FL7 FL8

PCP-Cy5.5 PE-Cy7

FL1 FL2 FL3 FL4 FL5 FL6 FL7 FL8 FL1 FL2 FL3 FL4 FL5 FL6 FL7 FL8

APC APC-H7

FL1 FL2 FL3 FL4 FL5 FL6 FL7 FL8 FL1 FL2 FL3 FL4 FL5 FL6 FL7 FL8

V450 V500

FL1 FL2 FL3 FL4 FL5 FL6 FL7 FL8 FL1 FL2 FL3 FL4 FL5 FL6 FL7 FL8
 Compensación electrónica

Spectrum Viewer at www.bdbioscience.com

 Compensación electrónica

Spectrum Viewer at www.bdbioscience.com

 Compensación electrónica

Spectrum Viewer at www.bdbioscience.com

 Compensación electrónica

Compensation

Spectrum Viewer at www.bdbioscience.com

 Compensación electrónica
PE

FL1 FL2 FL3 FL4 FL5 FL6 FL7 FL8

PCP-Cy5.5 – PE: 0 PCP-Cy5.5 – PE: 30.2

943 119

145 122
 Compensación electrónica
PE

FL1 FL2 FL3 FL4 FL5 FL6 FL7 FL8

PCP-Cy5.5 - PE: 30.2 PCP-Cy5.5 - PE: 32 PCP-Cy5.5 - PE: 34

119 74 18

122 121 119

 Compensación electrónica
Spillover Spreading

APC - PCP-Cy5.5 PE - PCP-Cy5.5

Compensación electrónica
Compensación electrónica
Diseño de Paneles

DISEÑO

PANEL

ROBUSTO

Definir objetivo: qué queremos medir

SS value

Nguyen et al. Cytometry A. 2013 Mar; 83(3): 306–315. doi: 10.1002/cyto.a.22251

 Adquisición

DISEÑO

PANEL MUESTRA
TASA FLUJO
14,000

12,000
Flujo (ev/seg)

10,000

8,000

6,000

4,000
Flujo = 623,3 + 1087 x Abortos

2,000

0
0 2 4 6 8 10 12
Abortos electrónicos
 Adquisición

DISEÑO

PANEL MUESTRA nº células a adquirir

SENSIBILIDAD CITOMETRÍA

Nº de células Sensibilidad Nº de células Poisson

CV = 100 /√n
totales analizadas diana detectadas
100 50 20
CV 10% 14% 22%
CUANTIFICACIÓN DETECCIÓN

1 millón 10-4 0.01% 0.005% 0.002%

5 millones 10-5 0.002% 0.001% 0.0004%

10 millones 10-6 0.001% 0.0005% 0.0002%

 Adquisición

DISEÑO

PANEL MUESTRA

CALIBRACIÓN

1 VOLTAJE 3 Q/B 6 7-AAD 8 LAVADO 9 TASA FLUJO

2 COMPENSACIÓN 4 SPILLOVER 7 Nº CEL

SPREADING
MONITORIZACIÓN
5 FLUOROCROMOS