CROMATOGRAFIA DE

LIQUIDOS DE ALTA
RESOLUCIÓN (HPLC)
 MÓDULO 4

DETECTORES Y MÉTODOS CLÁSICOS DE

SEPARACIÓN
4.1. DETECTORES EN HPLC
4.1. Sistema de Detección

El detector en HPLC es el dispositivo que

mediante la transfomación de una propiedad física
o química del analito entrega una señal que es
capaz de ser interpretada para fines de
identificación y/o cuantificación.
En su gran mayoría los principios que utilizan
estos detectores son espectrométricos, es decir,
están basados en la interacción de la radiación
electromagnética con la materia, a través de los
fenómenos de absorción o emisión de la
radiación.
4.1. Sistema de Detección

Dentro de los detectores clásicos que

analizaremos están:

• UV-Visible
• Arreglo de Diodos
• Índice de Refracción
• Fluorescencia
• ELSD
4.1. Sistema de Detección

Los detectores de HPLC miden una propiedad física

(ej. índice de refracción), o química, (ej. Absorbancia
UV-visible), propiedad de cada componente de la
muestra que es eluído de la columna, y provee
información cualitativa y cuantitativa. La elección del
detector depende de la naturaleza del analito, y de la
sensibilidad y selectividad del detector. La tabla de
abajo muestra una comparación de las
características de algunos detectores.
4.1.1. Características deseables en un
detector para HPLC

El sistema de detección requiere poseer ciertas

características, tales como:

 Alta sensibilidad
 Bajo ruido de fondo y deriva
 Estabilidad y reproducibilidad
 Amplio intervalo de respuesta lineal
 Corto tiempo de respuesta
 Volumen pequeño de la celda de flujo
 Insensible a cambios de Temperatura, flujo y presión
 Fácil operación

En la figura 1 se muestra una señal típica de un detector

con ruido.
En la figura 2 se muestra una señal típica de un detector
con ruido y deriva de la línea base
En la figura 3 se muestra el efecto del volumen de la celda
de flujo en la eficiencia del cromatograma obtenido.
Figura N° 1: Típica señal de ruido del detector
Figura N° 2: Típica señal de un detector con ruido y deriva de la línea
base.
Figura N° 3: Efecto del volumen de la celda de flujo (celda donde se
produce la detección), donde puede observarse una pérdida de
eficiencia provocada por fenómenos de difusión de la muestra en la
celda.
4.1.1.2 Selectividad y Sensibilidad del detector

Los distintos detectores utilizan principios diferentes y también poseen distintas características en cuanto a su
selectividad y sensibilidad.
En la tabla que se presenta más abajo se compara la selectividad y sensibilidad de distintos tipos de detectores de
uso común en HPLC

DETECTOR SELECTIVID SENSIBILIDAD (CANTIDAD

AD MINIMA DE MASA DETECTABLE)

Indice de Refracción Baja % (g/100g)

Conductividad Baja % (g/100g)
Ultra violeta/Visible Media ppm (mg/100g)
Arreglo de Diodos Media ppm (mg/100g)
ELSD Media ppm (mg/100g)
Electroquímico Alta ppb (ug/1000g)
Fluorescencia Alta ppb (ug/1000g)
4.1.1.3. Características de los detectores más utilizados en HPLC

Más abajo se presenta una tabla que agrupa la principal característica de los
detectores más utilizados en HPLC.

DETECTOR Principal Característica

Indice de Refracción + Universal

Conductividad Sólo para Iones
Ultra violeta/Visible + Utilizado
Arreglo de Diodos Información adicional al Tiempo de Retención
ELSD Universal para compuestos no volátiles
Electroquímico Sólo para compuestos oxidables
Fluorescencia + Sensible
4.1.2. Detector UV- Visible

El detector UV es el más comúnmente usado en HPLC. Es utilizado para detectar componentes de

muestras que contienen grupos cromóforos los cuales absorben la radiación UV o visible ej.
aromáticos, alquenos, C=O, C=N, C=S. se pueden encontrar detectores de longitud de onda fija o
variable. El eluente por sí solo no debe presentar absorbancia en el rango de interés.
4.1.2. Detector UV- Visible
DETECTOR UV- VISIBLE
La radiación de la fuente es directamente enfocada al paso óptico de la celda del detector. El cambio
de la absorbancia del componente de la muestra eluido de la columna pasa a través de la celda de
flujo siendo medida por el detector y la señal es enviada a un sistema de registro ( PC )
4.1.2.1. Detector espectrofotométrico
UV- Vis de longitud de onda variable

En este espectrofotómetro, la longitud de onda

puede ser ajustada ya que esta puede variarse
al cambiar el ángulo de la red holográfica de
difracción y así por la rendija de entrada del
haz de luz a la muestra llegara una longitud de
onda diferente cada vez que se cambia este
ángulo.
Es importante poder cambiar la longitud de
onda, ya que ésta puede influir en la
selectividad del detector, como se puede ver
en la figura 3.
Figura N° 4: Incidencia de la  del Detector sobre la Selectividad

Como puede observarse, el cambio de longitud de onda del detector de 210 a 280 nm
afecta a la selectividad. Por ejemplo, a 280 nm, además de aumentar la sensibilidad de
algunos compuestos, hay otros que pudiendo ser interferentes, no son detectados y se
observa un cromatograma más limpio.
4.1.3. Detector con arreglo de diodos

La radiación proveniente de la fuente pasa a

través de la celda de muestra y luego a la red
de difracción, donde es dispersada y reflejada
en una fila de fotodiodos. Cada fotodiodo
mide una angosta banda de longitud de onda,
por lo que todos los puntos del espectro de
absorción son medidos simultáneamente,
usando adquisición de datos en paralelo. Los
picos en el cromatograma son mostrados a la
absorbancia de la longitud de onda de
elección
4.1.3. Detector Espectrofotométrico de Arreglo de Diodos

Lámpara
deuterio CARACTERÍSTICAS :

Obturador Fila de Diodos

• Permite medir en todo un
Filtro Oxido de rango de 
Holmio SIMULTÁNEAMENTE.
• Permite obtener ESPECTROS
de cada pico sin detener
Lente
flujo de fase móvil.
• Permite verificar “pureza de
pico” (si en un pico eluye un
sólo compuesto y si coincide
Celda de Flujo con el espectro del patrón)
• Permite cuantificar CADA
componente a su  óptima
Red Difracción
4.1.3.1. Datos almacenados por Detector
de Arreglo de Diodos

Los datos almacenados por este detector permiten

realizar varias operaciones una vez que el cromatograma
ha sido almacenado.
Los datos almacenados contienen la información del
espectrograma completo del eluente que va pasando por
la celda de flujo durante todo el proceso cromatográfico.
Por ejemplo, se puede identificar a longitud de onda
óptima para un componente en particular.
Además, puede realizarse comparaciones para ver pureza
espectral entre el espectrograma de un componente en
particular presente en el eluente y el espectro del
compuesto almacenado en una biblioteca de espectros.
En la figura 5 se muestra el procesamiento de datos e
información que se puede obtener de los espectros
almacenados a partir de un detector de arreglo de diodos.
Figura N° 5: Procesamiento de datos con DAD/PDA
4.1.3.2. Análisis de espectros con detector de arreglo de diodos

Es posible generar espectros de absorción en todo el rango de barrido en forma simultánea y en

tiempo real. La figura de abajo muestra, en la línea verde, el espectro de un compuesto que eluye a
los 5 minutos entre 200 y 400 nm.
4.1.3.3. Cálculo de la pureza de un compuesto analizado

Como se puede ver en la figura de abajo, en el lado izquierdo está el espectro obtenido para un
compuesto determinado y al lado derecho, el resultado dado por el software al comparar con el
espectro almacenado en la biblioteca. En este caso la coincidencia es total.
4.1.3.4. Determinación de la longitud de onda máxima de absorción de cada
compuesto
El software también permite visualizar, post cromatografía, en la longitud de onda donde la absorción
es máxima, asegurando así la máxima sensibilidad en las condiciones cromatográficas de trabajo.
4.1.4. Detector de fluorescencia

El detector de fluorescencia puede ser hasta

1000 veces más sensible que el detector UV
para compuestos derivatizados o
fluorescentes. La luz de longitud de onda de
excitación pasa a través de la celda de flujo y
la radiación emitida por la muestra a la
longitud de onda de mayor emisión es
detectada en ángulo recto a la fuente de
excitación. En muchos equipos actualmente
las longitudes de onda de emisión y
excitación pueden ser programadas por
monocromadores, de modo de proveer
mayor selectividad al método de detección
4.1.4. Detector de Fluorescencia

El fenómeno de fluorescencia se produce

en las moléculas que tienen la propiedad
que al estar en su estado fundamental y
recibir una haz de longitud de onda
específica (longitud de onda de
excitación), son capaces de absorber
energía y pasan a un estado excitado.
Luego cuando pueden liberar esta
energía, volviendo a su estado
fundamental, liberando la energía que han
absorbido, como luz de energía inferior
(longitud de onda de emisión)a la de
excitación.
4.1.4. Detector de Fluorescencia
4.1.4. Detector de Fluorescencia

Longitud de onda de Excitación

+ hn1
*
*
hn2+
A* Longitud de onda de Emisión

hn2
hn1
Fluorescencia
A A
4.1.4.1. Características y requerimientos
del detector de fluorescencia

Se caracteriza por:

• Muy alta sensibilidad, si los analitos o sus

derivados son fluorescentes.
• Selectivo para compuestos fluorescentes.

En cuanto a los requerimientos:

• Los componentes fases móviles deben ser

especialmente puros.
• Deben ajustarse las longitudes de onda de
excitación y emisión de manera muy precisa.
4.1.5. Detector de indice de refracción

El detector de índice de refracción mide la diferencia en el índice

de refracción entre el eluente proveniente de la columna y la
solución de referencia, que es el eluente puro. Cualquier tipo de
componente de la muestra puede ser detectado, siempre y
cuando su índice de refracción sea diferente al del eluente. El
detector IR sin embargo no es tan sensible como el detector
UV-Visible, o el detector electroquímico y no puede ser usado
con métodos de elución en gradiente.
Características:
• Universal: responde a todos los analitos cuyo índice de
refracción (n) es distinto que el de la fase móvil
• Sensibilidad moderada a baja, según la diferencia entre
compuesto de interés y fase móvil
• Celda de flujo no resiste presiones elevadas, al conectarlo en
serie siempre debe ser ubicado en último lugar
El principio de operación del detector se puede ver en la figura
6.
En la figura 7 se puede apreciar una aplicación típica del detector
de índice de refracción en la determinación de azúcares.
Figura N° 6: Esquema típico de un detector de Indice de Refracción
Figura N° 7: Aplicación típica del
detector de índice de refracción es la
Cromatografía de Azúcares
4.1.5.1. Características de detector de índice de refracción

• Muy sensible a cambios de temperatura

• La concentración de aire disuelto en fase móvil produce la deriva en la línea
base
• Se debe utilizar un desgasificador de fase móvil
• No puede trabajar con gradiente.
4.1.6. Evaporative Light Scattering
Detector (ELSD)

La transmisión de la radiación a través

de la materia puede representarse como
la retención momentánea de la energía
radiante por átomos, iones o moléculas,
seguida de una emisión de la radiación en
todas las direcciones cuando las
partículas vuelven a su estado inicial.
Con partículas de dimensiones coloidales
la dispersión llega a ser lo bastante
intensa para que el ojo humano pueda
percibir (fenómeno de dispersión)
 4.1.5.1. Principio de detección con Evaporative Light Scattering

Los analitos pasan por la celda de detección y emiten una señal es sólo generada por los
compuestos no evaporables en relacion a todos los compuestos presentes en la muestra, de esta
manera cada vez que un compuesto no volatil pasa por la celda, es detectado .
4.1.5.1. Principio de detección:

El detector posee un sistema de nebulización-evaporación que opera de acuerdo a los siguientes

pasos:
Cabeza
1) Nebulización : Muestra Óptica
 Formación de Gotas
 Supresión de gotas grandes.

EVAPORACIÓN
Tubo
2) Evaporación :
De
 Evaporación de solvente
deriva
 Conservación de la integridad del
soluto.

3) Detección :
Nebulizador
• El haz de luz dispersado es
medido
4.1.5.1.1. Nebulización

La nebulización es realizada usando

un proceso de venturi

Gas de Nebulización

Fase Móvil líquida

Gas de Nebulización
4.1.5.1.2. Evaporación

 El tubo de deriva es usado para

evaporar la fase móvil.

 La temperatura del tubo de

deriva es controlada.

 Los solutos son obtenidos en

forma de micropartículas en la
fase gaseosa.
Tubo deriva

Fase móvil+soluto soluto

MICROGOTA MICROPARTÍCULA
 4.1.5.1.3. Detección
• El haz de luz dispersado es medido.

• El haz de luz es dispersado por particulas

en la fase gaseosa. Fotomultiplicador Background
Ruido
• Un fotomultiplicador es puesto en

Señal (mV)
ángulo de 120° en relación a la fuente de
luz.

Fuente Particulas
de luz suspendidas
Tiempo
4.1.5.1.3. Detección

 La detección de Light Scattering no está basada en una absorción

como lo es la detección espectrofotométrica UV o Visible.

 Cada soluto no volátil que pueda estar presente como una

microparticula en el cabezal óptico puede ser detectado.
4.1.5.2. Usos del Detector LT-ELSD
En la figura 8 y 9 se muestran aplicaciones del LT-ELSD
LT-ELSD

Farmacéutica Cosmética

Moléculas Técnicas
Glicéridos Detectores en serie o paralelo :
Compuestos Naturales UV + LT-ELSD, MS + LT-ELSD,…
Amino Ácidos (noderivatizados)
Péptidos Desarrollo de Métodos
Carbohidratos & Gliceroles Micro HPLC
Surfactantes
Lípidos y Fosfolípidos
Figura N° 8: Análisis de Triglicéridos por LT-ELSD v/s Indice de Refracción y UV-Vis
Figura N° 9: Análisis de Aminoácidos tilizando LT-ELSD

Análisis completo de 27 amino Column: Purospher RP-18e (125 x 4) 5mm

Mobile phase: A: 0.1% Heptafluroheptanoic acid in water
acidos sin derivatizar Detección B: Acetonitrile
LT-ELSD Gradient: 0 > 2 min 0% B, 2 > 17 min 30% B, 17 > 20 min 30% B
Comparación de ELSD con otros métodos de
detección

Método de detección Ventajas de ELSD Desventajas de ELSD

FLUORESCENCIA No requiere derivatización Menor sensibilidad para

Tiempo de analisis y prepa-ración
Compuestos fluorescentes
de muestra menor

- Elección de solvente
DETECCIÓN
independiente de propiedades
UV-VISIBLE espectrales Los compuestos deben
- Respuesta similar para todos los ser menos volátiles que la fase
compuestos móvil
- No se requiere derivatizaciones
Para los analitos sin cromóforos

ÍNDICE DE Mejor sensibilidad

REFRACCIÓN Compatible con gradiente
NINGUNA
Linea base estable
No hay picos de solvente
4.2. MODOS CLASICOS DE
SEPARACIÓN
EN HPLC
4.2.1. Clasificación de los métodos de HPLC

Los métodos en HPLC pueden ser clasificados en relación al volumen de la columna Vc

el cual puede ser considerado que está compuesto por 3 componentes principales:

Vs : El volumen que ocupa la matriz sólida del material de empaque

Vp : El volumen del líquido dentro de los poros
Vo : El volumen del líquido en los espacios entre partículas

Los métodos cromatográficos se pueden clasificar en 2 tipos:

1.- Métodos en los cuales los analitos eluyen a volúmenes menores a Vc (exclusión molecular)
2.- Métodos en los cuales el analito eluye a volúmenes mayores que Vc (Todos los otros métodos).
4.2.1.1. LA SÍLICA COMO SOPORTE
DE FASE ESTACIONARIA
El soporte para al fase estacionaria mas
comúnmente usado es la sílica.

Las ventajas de la sílica son:

-Es relativamente económica de fabricar

-Posee tamaño de partículas y formas variadas
-Tiene tamaño de poro y estructura variado
-Contiene grupos silanoles y siloxanos activos
-Es ionizable y derivatizable
Su principal y clásica desventaja es su solubilidad
en agua.
4.2.1.2. Modificaciones químicas de la sílica –
derivatizaciones

La silica gel se puede utilizar directamente

como fase estacionaria y sirve para trabajar
con HPLC en fase normal, dado que es una
fase estacionaria polar.
Sin embargo, debido a sus grupos silanólicos,
puede ser derivatizada transformándose de
esta manera en una sustancia muy versátil y
que puede ser transformado en fases
estacionarias de variadas propiedades y
aplicaciones como se verá a continuación.
4.2.1.2. Modificaciones químicas de la sílica - derivatizaciones

Sílica derivatizada NEUTRA HIDROFÓBICA

Sílica derivatizada NEUTRA HIDROFÍLICA

Sílica derivatizada BÁSICA HIDROFÍLICA

4.2.1.2. Modificaciones químicas de la sílica - derivatizaciones

Sílica derivatizada INTERCAMBIADORA DE CATIONES

Sílica derivatizada INTERCAMBIADORA DE ANIONES

4.2.2. Cromatografía de adsorción o
en Fase Normal

Como ya se mencionó anteriormente,

la silica gel puede ser utilizada
directamente como fase estacionaria,
aprovechando las propiedades
hidrofílicas que le otorgan los grupos
silanoles.
Cuando la silica se utiliza en estas
condiciones, la modalidad de
cromatografía que se desarrollase
denomina cromatografía en Fase
Normal.
4.2.2. Cromatografía de adsorción o en fase normal

Se caracteriza porque la fase estacionaria es polar y la fase móvil apolar. Abajo se presenta una figura
que describe de manera general esta técnica y otras fases estacionarias que se utilizan además de la
silica gel.
4.2.2. Cromatografía de adsorción o en fase normal

La sílica como un adsorbente

Las propiedades de adsorción de la sílica son atribuidas a la

presencia de grupos silanoles y siloxanos libres en su
superficie.
Las moléculas de la muestra interactúan con los grupos
polares -SiOH y son separadas de acuerdo a sus polaridades y
un factor estérico (mientras más polar sea la molécula,
más fuertemente es retenida).

Los Isómeros son moléculas que se pueden separar por

cromatografía de adsorción.

La principal desventaja de la cromatografía de adsorción es la

disminución de la actividad en la superficie de la sílica debido a
que esta cambia durante la vida útil de la columna por la
adsorción irreversible de agua y la introducción de otras
moléculas polares.
4.2.2. Cromatografía de adsorción o en fase
normal

La cromatografía de adsorción usando sílica gel

como fase estacionaria es también conocida como
cromatografía líquido sólido. La fase estacionaria es
polar y el eluente no polar. Las moléculas del eluente
y las moléculas del soluto compiten por los sitios de
adsorción discretos, en la superficie de la columna y
una molécula del soluto puede ser adsorbida solo si
su interacción es más fuerte que la que tiene con las
moléculas del eluente. La elección del eluente es
muy importante. La tabla que se muestra en pantalla
indica la fuerza de la adsorción de algunos
compuestos orgánicos.
4.2.2.1. Aplicaciones de la cromatografía de adsorción

La cromatografía de adsorción es particularmente utilizada para la separación de moléculas no

ionizables insolubles en agua. Estas moléculas pueden ser isómeros o compuestos
estrechamente relacionados. Sin embargo debido a la irreversible adsorción de contaminantes polares
como el agua, las fases unidas son más comúnmente utilizadas.
4.2.3. Fase reversa en HPLC

Sobre el 80% de los métodos de análisis

por HPLC publicados se realizan usando
columnas en fase reversa. En este
método, la fase estacionaria es de
polaridad menor que el eluente y los
componentes de la muestra son eluídos
en orden de polaridad, el componente
más polar eluye primero. La retención y
la selectividad puede ser alterada por
cambio de la polaridad de la fase
estacionaria o, (más fácilmente) el
eluente.
4.2.3. 1. Fase reversa en HPLC- Ventajas

-Puede separar muestras de un amplio

rango de polaridades.
-Existe una amplia variedad de fases
estacionarias para elegir
-Usa fases móviles relativamente
económica por la incorporación de
Buffer.
-Hay un rápido equilibrio entre la fase
móvil y la fase estacionaria (poco tiempo
de equilibrio).
-Provee una separación rápida, simple y
reproducible.
4.2.3. 1. Fase reversa en HPLC-
Limitaciones

-Muchas fases unidas a la sílica son estables

sólo entre pH 1,5 y 9,5.
-La presencia de grupos silanoles en la
superficie de la sílica pueden causar colas
en los picos, incrementar los tiempos de
retención y causar irreproducibilidad en
análisis entre columnas.
4.2.3.2. Cromatografía en Fase Reversa Se caracteriza porque la fase
estacionaria es apolar y la fase móvil es polar. Abajo se presenta una figura que
describe de manera general esta técnica y otras fases estacionarias que se
utilizan. Muestra
F. Estacionaria F. Móvil DISTINTAS POLARIDADES
HIDROFOBICA ACUOSA
<polaridad
Si-O-R H2O/CH3-OH >retención
< polaridad
> poder eluyente

Mecanismo: Reparto o partición

Nombre: Cromatografía en fase INVERSA

Fases enlazadas apolares:

 Dimetilsilil O-CH3
Si
(C2, RP-2) O-CH3

 Octilsilil
(C8, RP-8) Si O-(CH2)7-CH3

 Octadecilsilil
(C18, RP-18, ODS) Si O-(CH2)17-CH3
4.2.3.3. Fases estacionarias unidas

La fase estacionaria más comunmente usada es

OCTADECILSILANO (ODS), la cual tiene grupos
alquílicos C-18, químicamente unidos. Otras fases
estacionarias tienen cadenas alquílicas más cortas, C-8, o
grupos fenólicos y ciclohexílicos. Los tiempos de
retención aumentan cuando aumenta el número de
átomos de carbono unido en la fase estacionaria.
En las figuras 10, 11 y 12 se presentan cromatogramas
obtenidos con fases estacionarias metil, octil y
octadecilsilano, donde se puede observar que los tiempos
de retención se van incrementando a medida que
aumenta el número de carbonos en la fase estacionaria.
Figura N° 10: Cromatograma utilizando Fase Estacionaria Metilsilano
Figura N° 11: Cromatograma utilizando Fase Estacionaria Octilsilano
Figura N° 12: Cromatograma utilizando Fase Estacionaria Octadecilsilano
4.2.3.4. Eluentes en fase reversa

Los solventes usados en fase reversa generalmente son mezclas acuosas o soluciones Buffer. Los
solventes orgánicos miscibles en agua más frecuentemente usados son metanol, acetonitrilo y
tetrahidrofurano (THF). El poder de elución del solvente incrementa disminuyendo su polaridad.
Cuando se desarrolla una separación, es una práctica normal comenzar con un solvente fuerte, (ej.
90%Metanol:10% Agua), luego se incrementa la cantidad de agua hasta llevar a cabo la separación.
Algunas veces esto no es posible con la elección de los solventes originales, y puede ser necesario
cambiar la fuerza del solvente. Adicionalmente un tercer solvente puede ayudar. Más abajo se presenta
una tabla de equivalencia de fuerza entre distintas mezclas de solventes
4.2.3.5. Aplicaciones de HPLC en fase reversa

La HPLC de fase reversa es frecuentemente usada para el análisis de

soluciones acuosas como formulaciones farmacéuticas, muestras
biológicas, muestras ambientales, alimentos y bebidas.
Ver video comparativo: HPLC Fase Normal vs Fase Reversa
4.2.4. Cromatografía de Supresión de Iones

Las especies iónicas pueden ser cromatografiadas

por partición en una columna de fase reversa
usando un buffer para suprimir la ionización del
analito. Las interacciones entre la muestra iónica y
la fase estacionaria son minimizadas, resultando una
reducción en la cola del pico. Esta técnica de
supresión iónica es ampliamente usada entre rangos
de pH 3-8. El ejemplo que se muestra a
continuación muestra la separación del Paracetamol
( acetaminofeno ), pKa 9,5 y Aspirina (acido acetil
salicílico ), pKa 3,5, en una columna C-18, eluyente
30% Metanol/70% agua. Los componentes no son
retenidos y eluyen con el frente del solvente.
En las figuras 13 y 14 se puede observar el efecto de
la supresión de ionización mediante la adición de
ácido acético como agente supresor.
Figura N° 13: Cromatograma utilizando Fase Móvil Metanol/Agua, 30/70. Los
analitos no son resueltos y eluyen en el frente de solvente.
Figura N° 14: Cromatograma utilizando Supresión de Iones Fase Móvil
Metanol/Agua, 30/70/1% Acido Acético (pH 2.5). Los analitos son resueltos y
eluyen a los 2 y 5 minutos gracias a la inhibición de la ionización.
4.2.5. Cromatografía de pares Iónicos

La cromatografía de pares Iónicos puede ser usada

para la separación de ácidos débiles, bases e iones
inorgánicos, ( ambos, cationes y aniones ). Un
componente iónico soluble en agua puede ser
convertido en un compuesto afín a la fase orgánica
por adición de un contra ion, ( el reactivo de par
iónico ), para formar un par iónico neutro. La adición
de un reactivo de par iónico al eluente alterará
substancialmente la retención de un compuesto
iónico. No obstante esto, un compuesto no iónico se
verá relativamente sin alteraciones . Las sílicas
químicamente modificadas, como se ilustran a
continuación, pueden ser usadas en el modo de par
iónico para análisis de algunas especies iónicas.
En la figura 15 y 16 se puede observar tipos de fases
estacionarias para análisis de especies catiónicas y
aniónicas, respectivamente.
Figura N° 15: Ejemplo de tipo de fase estacionaria utilizada en cromatografía
de pares de iones para análisis de especies cargadas positivamente (cationes),
en este caso se utiliza un ligando sulfónico.
Figura N° 16: Ejemplo de tipo de fase estacionaria utilizada en cromatografía
de pares de iones para análisis de especies cargadas negativamente (aniones),
en este caso se utiliza un ligando nitrogenado.
4.2.5.1.Reactivo de par iónico

Los reactivos de pares iónicos más utilizados generalmente son los alquil sulfonatos. La longitud de la cadena del
grupo alquílico es la variable más importante en la cromatografía de pares iónicos. A medida que la longitud de la
cadena del reactivo de par iónico aumenta, la retención del compuesto pareado también aumenta, como se
puede apreciar más abajo, los tiempos de retención son menores en el caso del pentanosulfonato de sodio, en
relación a cuando se utiliza heptanosulfonato de sodio como reactivo de par iónico.
4.2.6. Cromatografía de Intercambio Iónico

La cromatografía de Intercambio Iónico separa los componentes de una mezcla de acuerdo a las bases de
las ionizaciones características de los grupos funcionales presentes. Una mezcla ionica puede ser separada
si existe diferencia entre las fuerzas de interacción entre los iones del soluto en el eluente y los sitios de
intercambio en la fase estacionaria.
4.2.6.1. Propiedades de la silica como Intercambiador Iónico

La silica puede actuar como un intercambiador catiónico con un solvente apropiado en un

amplio rango de pH y es muy usada particularmente en la región de pH 7 a 10. Puede esta ser
químicamente modificada a la forma aniónica o catiónica con un empaque adecuado.
En la figura de más abajo se visualiza cromatograma con análisis de fármacos utilizando silica gel
como fase estacionaria en intercambio iónico.
4.2.6.1.1. Mecanismo de Intercambio
Iónico utilizando silica gel como fase
estacionaria

El mecanismo de intercambio iónico puede ser

ilustrado considerando a la sílica como un material
intercambiador de cationes conteniendo sitios
cargados negativamente.

Cuando un analitio positivante cargado Ej. R-NH3+,

toma contacto con la sílica de la fase estacionaria, se
produce un intercambio iónico entre el ión del analito
y H+. La fuerza iónica del eluente es un factor
importante en el proceso de intercambio iónico, es
El contraión del eluente compite con el
así como al aumentar la concentración del contraión analito por el sitio de intercambio en la
aumenta la competencia por los sitios de intercambio superficie de la sílica
de la fase estacionaria.
4.2.6.2. Fuerza Iónica del eluente

La separación en la cromatografía de intercambio iónico es llevada a cabo a través del control

de las atracciones electrostáticas de los sitios iónicos en la fase estacionaria. La retención de los
componentes de la muestra puede ser variada por modificación del pH o la fuerza iónica del
eluente. El efecto del pH es considerado en la página siguiente. Incrementando la fuerza iónica
del eluente, aumenta la competencia por el contra ion en la fase estacionaria. Los iones de la
muestra son, sin embargo, más fácilmente desplazados y los tiempos de retención disminuidos.
4.2.6.3. Efecto del pH del eluente
El pH controla el grado de ionización de la muestra y de los sitios iónicos en la fase estacionaria. Un
intercambiador iónico fuerte como un amonio cuaternario retendrá un ácido fuerte y débil
diferentemente dependiendo del pH. En general los ácidos débiles eluyen en orden disminuyendo el pK.
Acidos fuertes serán más ionizados y por lo tanto más retenidos.
Acido Benzoico : ácido débil con pKa 4,2
Acido Fosfórico : pKa 2,13
4.2.6.4. Resumen de las variables que
controlan la retención en cromatografía
de Intercambio Iónico.

Cuando se está desarrollando un método por

cromatografía de Intercambio Iónico, las siguientes
variables deben ser consideradas:
-Para intercambiadores iónicos débiles, el pKa y pKb
del analito es importante.
-pH del eluente
-pKa y pKb de los componentes de la muestra
-Fuerza iónica del eluente
-Generalmente los tiempos de retención disminuyen
con un incremento de la temperatura. Chequee con su
proveedor las temperaturas máximas permitidas.
-Tipo de contraión usado, contraiones fuertemente
absorbentes eluirán la muestra más rápidamente que
contraiones débiles
4.2.7. Cromatografía de Exclusión Molecular
Cromatografía de Exclusión es un término general usado para describir los modos de separación:
-Cromatografía de Permeación de geles (eluente orgánico); y
-Cromatografía de Filtración de Geles (eluente acuoso)
En cada caso, las moléculas son separadas de acuerdo al tamaño. Las moléculas de mayor tamaño no pueden
penetrar al interior de los poros del material de empaque y eluyen primero; las moléculas más pequeñas pueden
penetrar en los poros y son retenidas por tiempo mayor. (Ver figura de más abajo)
4.2.7. Cromatografia de exclusión molecular

La cromatografía de exclusión molecular se caracteriza

por:
• Es utilizada para masas moleculares elevadas

• Relleno de la fase estacionaria: partículas poliméricas

con una red de poros uniforme en los que pueden
difundir moléculas del soluto y del solvente.
• Tiempo de residencia depende del tamaño efectivo de
las moléculas.
• Moléculas más grandes no son retenidas y eluyen
primero. (Ver figura del lado derecho)
• Separación por tamaño, no implica interacciones
química con el relleno.
• Cuando se utilizan rellenos de sílice, éstos retienen por
adsorción y catalizan descomposiciones. Se modifican
por sustituyentes orgánicos (sililación).
• Normalmente se utilizan rellenos de copolímeros
estireno-divinilbenceno:hidrofóbicos.
4.2.7.1 Propiedades de los rellenos típicos utilizados en cromatografía de
exclusión molecular.
En la tabla de más abajo se muestran las propiedades más relevantes de los rellenos más
utilizados en cromatografía de exclusión, tales como: tamaño de partícula, tamaño de poro y
límite de exclusión de peso molecular, que es el tamaño del analito a partir del cual éste no
será retenido por la fase estacionaria.
4.2.7.2. Curvas de calibración en
cromatografía de exclusión molecular

La cromatografía de exclusión molecular permite

predecir el peso molecular de los analitos.
Para predecir la habilidad de una columna particular
para separar los componentes de una mezcla en un
rango dado de pesos moleculares, una curva de
calibración del logM, versus volumen (tr) es
graficado, usando un estándar de peso molecular
conocido.
Las moléculas más grandes no penetran en los
poros de la fase estacionaria y tienen volúmenes de
retención Vo; las moléculas pequeñas pueden
penetrar completamente en los poros y tendrán un
volumen de retención mayor o igual a Vo + Vp. as
moléculas intermedias que penetrarán parcialmente
a los poros tendrán volúmenes de retención entre
los valores Vo y (Vo+Vp) y en la gráfica el log de sus
pesos moleculares responde linealmente en relación
al tr. (Ver figura de la derecha).
4.2.7.3. Aplicaciones de la Cromatografía de Exclusión Molecular

La silica, sin modificar, o con fase unida, puede ser usada para cromatografía de exclusión por tamaño, con
ambos, eluentes orgánicos o acuosos. Normalmente un solvente fuerte es seleccionado para evitar la
retención por cualquier otro proceso cromatográfico.
Originalmente la exclusión por tamaño fue usada para la caracterización de polímeros, pero ahora puede
ser usado para un amplio rango de muestras ej. para separar pequeñas moléculas de matrices interferentes
ej. en industria farmacéutica, alimentos y análisis ambientales.
4.3. RESUMEN métodos Clásicos de Separación
en HPLC
 4.3.1. RESUMEN FASE REVERSA

1 TÉCNICA FASE REVERSA

2 MECANISMO PARTICIÓN O REPARTO
3 FASE ESTACIONARIA HIDROFÓBICA
AGUA/
4 FASE MÓVIL
SOLVENTE ORGÁNICO
5 MUESTRA APOLAR-SEMI POLAR-POLAR
6 PRINCIPIO MUESTRA MENOS POLAR - MÁS RETENCIÓN
7 PRINCIPIO ELUYENTE MENOS POLAR - MAYOR ELUCIÓN
8 AUMENTO DE K AUMENTO %B
C-2/C-4/C-8/C-18/C-
30/FENIL/FENILHEXIL
BUFFER ACETATO/FOSFATO
/METANOL/ACN/THF
AROMÁTICO SUBSTITUIDO
ALIFÁTICOS/ORGÁNICOS EN
GENERAL
AUMENTO SOLVENTE MÁS POLAR
 4.3.2. RESUMEN FASE NORMAL

1 TÉCNICA FASE NORMAL

2 MECANISMO ADSORCIÓN

3 FASE ESTACIONARIA HIDROFÍLICA SÍLICA - ALUMINA

4 FASE MÓVIL SOLVENTE ORGÁNICO

5 MUESTRA POLAR TAMBIÉN ISÓMEROS

6 PRINCIPIO MUESTRA MENOS POLAR - MENOS RETENCIÓN

7 PRINCIPIO ELUYENTE MÁS POLAR - MAYOR ELUCIÓN
8 AUMENTO DE K AUMENTO %B AUMENTO SOLVENTE MENOS POLAR
 4.3.3. RESUMEN FASE HILIC

1 TÉCNICA FASE REVERSA IÓNICA

2 MECANISMO ADSORCIÓN

3 FASE ESTACIONARIA HIDROFÍLICA HILIC

AGUA/ BUFFER ACETATO/FOSFATO

4 FASE MÓVIL
SOLVENTE ORGÁNICO /METANOL/ACN/THF
AROMÁTICO SUBSTITUIDO
5 MUESTRA SEMI POLAR-POLAR ALIFÁTICOS/ORGÁNICOS EN
GENERAL
6 PRINCIPIO MUESTRA MÁS POLAR - MÁS RETENCIÓN
7 PRINCIPIO ELUYENTE MÁS POLAR - MAYOR ELUCIÓN
8 AUMENTO DE K AUMENTO %B AUMENTO SOLVENTE MAS POLAR
 4.3.4. RESUMEN INTERCAMBIO IÓNICO

1 TÉCNICA INTERCAMBIO IÓNICO

2 MECANISMO INTERTCAMBIO IÓNICO
CATIÓNICA O ANIÓNICA FUERTE O
3 FASE ESTACIONARIA AMINO - SULFÓNICO
DÉBIL
AGUA/ BUFFER ACETATO/FOSFATO
4 FASE MÓVIL
BUFFER/SALES METANOL/ACN/AGUA
AZÚCARES-AC ORGÁNICOS-
5 MUESTRA CATIÓNICAS O ANIÓNICAS CATIONES-ANIONES-MOLÉCULAS
IÓNICAS
6 PRINCIPIO MUESTRA MÁS CARGADA - MÁS RETENCIÓN
7 PRINCIPIO ELUYENTE MÁS CARGADO - MAYOR ELUCIÓN
AUMENTO SOLVENTE MENOS
8 AUMENTO DE K AUMENTO %B
CARGADO
 4.3.5. RESUMEN EXCLUSIÓN MOLECULAR
1 TÉCNICA FILTRACIÓN O PERMEACIÓN

2 MECANISMO SEPARACIÓN POR TAMAÑO

3 FASE ESTACIONARIA SÍLICA O POLÍMEROS SÍLICA / ESTIRENO DIVINILBENCENO

AGUA/
4 FASE MÓVIL METANOL / THF / AGUA
SOLVENTE ORGÁNICO

POLÍMEROS – PROTEINAS-
5 MUESTRA APOLAR-SEMI POLAR-POLAR
MACROMOLÉCULAS
6 PRINCIPIO MUESTRA MÁS PEQUEÑA - MÁS RETENCIÓN
7 PRINCIPIO ELUYENTE NO PARTICIPA, SOLO DISUELVE
8 AUMENTO DE K SELECCIÓN DE TAMAÑO DE PORO
 4.3.6. RESUMEN CROMATOGRAFÍA QUIRAL
1 TÉCNICA CROMATOGRAFÍA QUIRAL
2 MECANISMO ADSORCIÓN
POLISACÁRIDOS/MOLÉCULAS
3 FASE ESTACIONARIA QUIRAL
SINTÉTICAS
AGUA/ BUFFER/AGUA
4 FASE MÓVIL
SOLVENTE ORGÁNICO /METANOL/ACN/THF

5 MUESTRA ISÓMEROS FÁRMACOS/MOLÉCULAS QUIRALES

6 PRINCIPIO MUESTRA AFINIDAD POR EL CENTRO QUIRAL

DISUELVE LA MUESTRA Y LA
7 PRINCIPIO ELUYENTE Ajusta pH
TRANSPORTA