Métodos en Biología, Seminarios

Curso 2009/10
Aplicaciones generales
 Observación
 Examen
 Descripción
 Comparación

 Representación
 Gráfica
 Fotográfica/Vídeo
 3-D
Rango de
resolución
de los
microscopios
 Lupa
estereoscópica

Microscopio
electrónico
óptico

Rango de
resolución
de los
microscopios
 Usos de la lupa estereoscópica
 Observación macroscópica
 Reconocimiento taxonómico
 Disecciones

 Ventajas:
 Preparación sencilla
 Trabaja a bajo aumento
 Con amplitud de campo
 Crea imágenes tridimensionales
 Usos del microscopio óptico
 Observación de órganos, tejidos, células y orgánulos
Tipo de Microscopio Fundamento
Campo claro Observación directa ampliada de la
muestra. Se visualiza según las
diferencias de absorción
Campo oscuro Observación de luz dispersada por la
muestra
Contraste de fases Basado en los cambios del índice de
refracción de la luz al atravesar una
muestra. Convierte diferencias de fase
en diferencias de intensidad
Contraste diferencial Basado en la interferometría. Ofrece
de interferencia una imagen en relieve, de acuerdo a los
(Nomarsky) cambios de absorbancia de la muestra
Polarización Basado en la birrefringencia,
consecuencia de la organización de
algunas moléculas
Fluorescencia Basado en la absorción de luz por un
fluoróforo y su emisión en otra longitud
de onda
Uso
El más sencillo y más utilizado. Permite ver colores originales y
tinciones histológicas. Se pueden incluir filtros para aumentar el
contraste
Muestras transparentes y/o vivas. Hay que iluminar mucho la
muestra. Útil para análisis cuantitativos
Muestras transparentes y/o vivas. Observación de ciclos celulares y
orgánulos (mitocondrias, lisosomas, cromosomas, nucléolos, etc.). Si
hay pared celular, se debe incluir la muestra en un medio con índice
similar
Como anterior, pero se intensifica el contraste, al evitarse el halo que
rodea la muestra. Se puede medir el índice de refracción de un
material
Estructuras moleculares largas, paralelas o apiladas, con una
orientación (células musculares, colas de espermatozoides,
cloroplastos, bastones, cadenas de ADN, huso mitótico)
Detección de cantidades mínimas de algún material (anticuerpos,
histonas, actina, miosina); visualización de componentes de difícil
observación y determinación de su orientación (ácidos nucleicos);
detección de anomalías (bandas cromosómicas)
 Usos de diversos microscopios ópticos
Microscopía de campo claro Microscopía de contraste de fases

Microscopía de interferencia Microscopía de campo oscuro

Preparación de muestras permanentes
 Fijación:
 El fijador inmoviliza, mata y preserva las células, las hace más
permeables a los colorantes y establece puentes cruzados entre sus
moléculas, de manera que quedan estabilizadas y bloqueadas en su
posición original.
 Fijadores: alcohol, aldehídos activos (formaldehído, glutaraldehído).
 Inclusión
 Se incluyen en un medio que ofrezca consistencia (ceras, resinas).
 Sección
 Los tejidos suelen ser cortados en finas rebanadas (secciones). Por
ejemplo, con un microtomo (10-5-10-6m).
 Se suelen extender en un portaobjetos.
 (Sección por congelación: utiliza un criostato - microtomo en cámara
fría. Evita los pasos anteriores).
 Extensión
 Sobre un portaobjetos.
 El uso de cubreobjetos evita la desecación, el abarquillamiento de la
muestra y que la superficie líquida actúe como lente.
Microscopio de campo claro
Alga verde filamentosa
Spirogyra Link, 1820

Ojo de hámster

Amoeba proteus (Pallas, 1766)

Larva nauplius
de balano
 Microscopio de campo claro
 Tinción
Conductos colectores de la orina, riñón
 Colorantes orgánicos
(verde malaquita, negro (hematoxilina y eosina)
Sudán, azul de
Coomassie). Algunos
tienen una afinidad
específica por ciertos
componentes celulares
(p.e. hematoxilina con
moléculas con carga
negativa).
 Colorantes cada vez más
específicos, según se ha ido
conociendo la química
celular.
 Colorantes cualitativos,
fluorescencia. Por ejemplo,
Sección de raíz
fluoresceína, rodamina.
(safranina y verde rápido)
Microscopio de campo oscuro
Amoeba proteus (Pallas, 1766)

Larva nauplius
de balano

Foraminíferos

Células
sanguíneas
humanas
 Microscopio de campo oscuro
 Se puede producir un pseudo-
campo oscuro sin necesidad de
tener los accesorios apropiados;
sólo moviendo el diafragma y el
condensador.

Pluma de ave
 Microscopio de contraste de fases
Célula epitelial

Amoeba proteus (Pallas, 1766)

Alga
diatomea
Microscopio diferencial de interferencia

Rotífero
Amoeba proteus (Pallas, 1766)

Miocito de corazón
de ratón adulto
(contraste de fase y
diferencial de
interferencia)
Microscopio de polarización
Rodilla de vaca,
red de
colágeno en
cartílago
Perforaciones en
membranas
externas de la
diatomea
Triceratium favus
Ehrenberg, 1840

Piel de cebolla

Pelo de mamífero
 Microscopio de Tinciones

fluorescencia fluorescentes

Proteínas celulares
fluorescentes
Célula en mitosis
Se han observado tres elementos
fluorescentes: microtúbulos en
verde, centrómeros en rojo, ADN
en azul
 Microscopio de Nanopartículas fluorescentes
o puntos cuánticos
fluorescencia (cristal)

Tinciones fluorescentes y nanopartículas

Proteína nuclear en verde (Alexa 488) y microtúbulos en rojo
(nanopartículas con estreptavidina)
 Microscopio de fluorescencia
Inmunofluorescencia

Anticuerpo primario

Anticuerpos secundarios
 Microscopio de fluorescencia

Célula endotelial de arteria pulmonarde vaca

Núcleo en azul (DAPI), microtúbulos en
Célula cancerígena humana en división verde (anticuerpo unido a FITC),
ADN en azul, proteína del centrómero en verde, filamentos de actina en rojo (faloidina
microtúbulos en rojo unida a TRITC)
 Microscopio de fluorescencia

Microscopio electrónico de Microscopio de fluorescencia

transmisión (Antitubulina fluorescente)
 Usos del microscopio electrónico
 Observación de órganos, tejidos, células, orgánulos y moléculas
 Reconocimiento de patologías, virus, nanopartículas, etc.

Tipo de Microscopio Inglés Fundamento Uso

Transmisión Transmission La imagen es formada por Muestras <2·10-7 m
(MET) (TEM) los electrones que atraviesan
la muestra
Transmisión Barrida Scanning Como MET, pero se va Muestras <2-7·10-8 m
(METS) Transmission barriendo una cuadrícula
(STEM)
Bajo Voltaje Low Voltage Como MET, pero, al trabajar Muestras <2·10-8 m
(MEBV) (LVEM) con un voltaje menor, se
mejora de forma significativa
el contraste de los elementos Lámina de oro
más claros Átomos a 0.2·10-9m
Barrido Scanning La imagen es formada por Cualquier tipo de
(MES) (SEM) los electrones emitidos por la muestra. Ofrece
muestra tridimensionalidad,
pero menor resolución
 Preparación de muestras para ME
 Muestras grandes (órganos, tejidos, células)
 Fijación:
 Glutaraldehído (une proteínas)

 Tetróxido de osmio (une bicapas lipídicas y

proteínas)
 Alternativamente, criofijación

 Inclusión: Polimetacrilato de metilo

 Resina monomérica (metacrilato de metilo)

 Alternativamente, inclusión de resina en frío

(criosustitución)
 Sección:
 Ultramicrotomo (secciones inferiores a 2·10-7m)

 Alternativamente, criofractura
 Preparación de muestras para ME
 Muestras grandes (órganos, tejidos, células)
 Réplica o sombreado metálicos
 Usos del MET
Sistema nervioso,
axones de
neuronas con
mielina (células
de Schwann)

Sección de corazón de rata

Arriba, MET; Abajo, MEBV
Usos del MES

Estereocilios de una célula pilosa del oído interno de la rana toro

A: MES; B: Microscopio diferencial de interferencia; C: MET
Preparación de muestras para ME
 Muestras pequeñas
(macromoléculas, moléculas)
 Réplica metálica
 Tinción negativa o contraste
negativo:
 Sal de metal pesado (p.e. sal de
ácido fosfotúngstico, yoduro de
cadmio, uranil acetato).
 La imagen es el resultado de la
intensidad relativa del haz
electrónico en cada punto, que es
proporcional al grosor de la
película opaca.
 Empleado con éxito en
bacteriófagos, virus y proteínas. Cadenas helicoidales de moléculas
globulares de actina
 Preparación de muestras para ME
 Muestras pequeñas
(macromoléculas, moléculas)
 Crio-electromicroscopía
 Campo oscuro
Hibridos de ARN
y ADN en
disolución

Crio-EM de GroEL
Filamentos de ADN extraídos del
(Escherichia coli
bacteriófago T4
Migula, 1895)
 Preparación de muestras para ME
 Muestras pequeñas
(macromoléculas, moléculas)
 Immunogold (puntos
negros / nanopartículas)

Localización de cuatro proteínas del cuerpo

polar del huso en levadura
Representación gráfica
 Mano alzada
 Cámara lúcida o tubo de dibujo
Representación fotográfica/vídeo
 Cámaras
 Objetivos digitales
 Pantallas de vídeo (ME)
Representación fotográfica/vídeo
 Falso coloreado (ME)

Arteria con células

sanguíneas

Bacilo Vibrio vulnificus

Farmer, 1980

Polen de Amaranthaceae
 Representación 3-D
 Microscopio óptico
 Deconvolución

Cromosomas politenos de
Drosophila Fallen, 1823
 Representación 3-D
 Microscopio óptico
 Confocalización (fluorescencia)

Estado de gástrula de
Drosophila Fallen, 1823

Grano de polen de
flor de la pasión
 Representación 3-D
 Microscopio óptico y electrónico
 Reconstrucción a partir de secciones
 Reconstrucción de única partícula (ME)

Reconstrucción de una
mitocondria de levadura

Reconstrucción de la
cápsula proteínica del
virus de la Hepatitis B
 Representación 3-D
 Microscopio electrónico
 Tomografía electro-microscópica (EM),
o crio-electrónica (CE)

Complejo
proteínico
de la
cubierta
de un
retrovirus Complejo de Golgi
Aplicaciones de
Microscopía en
Biología
Métodos en Biología, Seminarios
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