“IV CURSO INTERNACIONAL DE

PATOLOGIA QUIRURGICA Y MEDICINA

DEL LABORATORIO”

Aplicación de la Citometría de flujo

en Hematología

DRA. PAOLA CABRERA F

Loja, 25 de julio de 2012

 TÉCNICAS DE ESTUDIO
CELULAR
MICROSCOPIA  

Técnica:  
Sencilla  y  Barata  
Información:  
Morfología:  Buena  
Número  de  funciones:  Escaso  
Número  de  células:  Escaso  
Individualidad  celular:  Mantenida  
 TÉCNICAS DE ESTUDIO
CELULAR
MICROSCOPIA   GENOMICA   PROTEOMICA   METABOLOMICA  

Técnica:   Técnica:  
Sencilla  y  Barata   Compleja  y  Cara  
Información:   Información:  
Morfología:  Buena   Morfología:  No  
Número  de  funciones:  Escaso   Número  de  funciones:  Elevado  
Número  de  células:  Escaso   Número  de  células:  Elevado  
Individualidad  celular:  Mantenida   Individualidad  celular:  No  
 TÉCNICAS DE ESTUDIO
CELULAR

  Análisis multiparamétrico
  Técnica que permita medir
miles de células
individualizadas por
segundo.

Experiencia  en  estructuras  y  funciones  celulares  

 Citometría de flujo

“ Es la tecnología que permite

cuantificar de manera objetiva,
características físicas y biológicas
de las células, bajo el principio
célula por célula a gran velocidad”
PARÁMETROS SE PUEDEN ANALIZAR POR
CITOMETRÍA DE FLUJO
Parámetros Nucleares
Enzimas

Proteinas
Pared celular

Moléculas de superficie

Proteinas Enzimas

Moléculas de superficie Enzimas

Parámetros de Superficie Parámetros

Citoplasmáticos
Proteinas secretadas

Extracelular Parámetros
 ACUTALMENTE
  Clínica
  Investigación básica y/o avanzada
 APLICACIONES DE CITOMETRÍA DE
FLUJO

  Hematología

  Oncología

  Farmacología

  Inmunología

  Microbiología

  Genética
¿REQUISITOS PARA TRABAJAR
EN CITOMETRÍA DE FLUJO?
  Suspensión celular
  Citómetro de flujo

  Técnicas de inmunofluorescencia

  Conocimiento amplio de la hematopoyésis

 TIPOS DE MUESTRAS
  Fuentes biológicas
Sangre Periférica.
Aspirado de médula ósea.
Líquidos corporales (cavidades,
lavados).
Tejidos sólidos (piel, ganglios
linfáticos, otros.
 COMPONENTES DEL CITOMETRO

FL1
530/30
SSC
488/10

FL2
585/42 90/10 Beam Splitter
SISTEMA DE FLUIDOS

FL4
661/16 DM 560SP
Laminar  
Flow   SISTEMA OPTICO.
DM 640LP

670LP Half Mirror

Fluorescence
Collection Lens
FL3

Beam Combiner
Flow
Sheath   Sheath   488 nm . Flow
Cell
Cell
Red Diode Laser
Blue Laser FSC Diode
488/10
Sample   ~635 nm

Voltage Pulses

SSC
Signal Out
Time
Photon

SSC
In
Voltage LOG
LOG   FL1
In
Parameter
Time FSC
SSC
Levels 150–999
FL2
FL1 Volts
FL2
FL3 Time
FL4
FL5 SISTEMA ELECTRONICO

 Low Differential Pressure

Low Sample
Pressure
12µl/min
Laminar
Flow

Sheath Sheath Sheath Sheath

Sample Sample
 CÁMARA
DE FLUJO

Fluido  envolvente  
 INFORMACIÓN QUE SE OBTIENE

•  Propiedades al atravesar la luz

•  Propiedades fluorescente ( FL-1,......)
PROPIEDADES DE LAS
CÉLULAS
PROPIEDADES DE LAS
CÉLULAS
PROPIEDADES DE LAS
CÉLULAS
PROPIEDADES DE LAS
CÉLULAS
 FL1
530/30

SSC 488/10

FL2
585/42 90/10 Beam Splitter

FL4 661/16 DM 560SP

DM 640LP

670LP Half Mirror

Fluorescence
Collection Lens

FL3

Beam Combiner
Flow
Flow
. Cell
Cell
488 nm
Blue Laser Red Diode Laser FSC Diode
488/10
~635 nm
Focusing
Lens
 DISCRIMINACIÓN DE SEÑALES DEBIDAS A DOBLETES
(PROCESO DE PULSOS)

  Señal analógica (V)

  Altura de señal (H)
  Anchura de señal (W)
  Área de señal (A)
 DISCRIMINACIÓN DE SEÑALES DEBIDAS A DOBLETES
(PROCESO DE PULSOS)

  Señal analógica (V)

  Altura de señal (H)
  Anchura de señal (W)
  Área de señal (A)
 DISCRIMINACIÓN DE SEÑALES DEBIDAS A
DOBLETES (PROCESO DE PULSOS)
•  Señal  analógica  (V)  
•  Altura  de  señal  (H)  
•  Anchura  de  señal  (W)  
•  Área  de  señal  (A)  

•  En   base   a   la   información   de  
área   y   anchura   se   pueden  
detectar   dobletes   (dos  
células  que  pasan  juntas).  
 DISCRIMINACIÓN DE SEÑALES DEBIDAS A
DOBLETES (PROCESO DE PULSOS)
•  Señal  analógica  (V)  
•  Altura  de  señal  (H)  
•  Anchura  de  señal  (W)  
•  Área  de  señal  (A)  

•  En   base   a   la   información   de  
área   y   anchura   se   pueden  
detectar   dobletes   (dos  
células  que  pasan  juntas).  
 ¿QUÉ PUEDE DECIRNOS DE LAS
CÉLULAS?

  Su tamaño relativo ( FSC )

  Granularidad o complejidad relativa (SSC)
SANGRE PERIFÉRICA
SANGRE PERIFÉRICA
SANGRE PERIFÉRICA
SANGRE PERIFÉRICA

Linfocitos
SANGRE PERIFÉRICA

Linfocitos
SANGRE PERIFÉRICA

Linfocitos
SANGRE PERIFÉRICA
SANGRE PERIFÉRICA

Monocitos
SANGRE PERIFÉRICA

Neutrófilos
SANGRE PERIFÉRICA

Neutrófilos
SANGRE PERIFÉRICA
 ¿QUÉ PUEDE DECIRNOS DE LAS
CÉLULAS?

  Su tamaño relativo ( FSC )

  Granularidad o complejidad relativa (SSC)

  Propiedades biológicas en relación a una expresión

fluorescente ( FL-1,......)
ANTICUERPOS COMO HERRAMIENTAS EN
INVESTIGACIÓN
Ventaja
  Capacidad de reconocimiento muy específica

  Detección muy sensible picomolar

Inconveniente
  Son invisibles
  Conjugación con moléculas “reporter”
 Radioisótopos: RIA, Rosalyn Yalow 1977
 Enzimas: ELISA, inmunohistoquímica

 Moléculas fluorescentes:
inmunofluorescencia, citometría de flujo.
INMUNOFLUORESCENCIA
¿CÓMO SE EMITE LA FLUORESCENCIA?

λ ≅ 530 nm
λ = 488 nm

Energía de Energía de Luz

Luz Fluorescente
Incidente Emitida
300 nm 400 nm Wavelength
500 nm 600 nm 700 nm

400 nm 500 nm 600 nm 700 nm

Láseres 350 457 488 514 610 632
comunes 300 nm 400 nm 500 nm 600 nm 700 nm
SUPERPOSICIÓN DE ESPECTROS DE
EMISIÓN
TC  
PerCP   Cy5  
QR   APC  

Fundamento    
  Parte   de   la   señal   de  
emiVda   por   un  
fluorocromo   es   leída  
por   el   detector   de  
otro  color  

FL-­‐1   FL-­‐2   FL-­‐3   FL-­‐4  

SUPERPOSICIÓN DE ESPECTROS DE
EMISIÓN
TC  
PerCP   Cy5  
QR   APC  

Sustracción   de   una  
parte   de   la   señal  
medida  en  un  color  a  la  
señal   medida   en   otro  
color  

FL2  -­‐  %FL1  

FL-­‐1   FL-­‐2   FL-­‐3   FL-­‐4  

 PROCESO DE LA INFORMACIÓN
GENERADA

1.  Representación de la información

2.  Selección de la información

3.  Reducción de la información

4.  De la célula a la población celular

 REPRESENTACIÓN MULTIPARAMÉTRICA DE
DATOS

APS
 PROCESO DE LA INFORMACIÓN
GENERADA

1.  Representación de la información

2.  Selección de la información

3.  Reducción de la información

4.  De la célula a la población celular

 PROCESO DE LA INFORMACIÓN
GENERADA

1.  Representación de la información

2.  Selección de la información

3.  Reducción de la información

4.  De la célula a la población celular

 ESTADÍSTICAS/REDUCCIÓN DE LA
INFORMACIÓN
  Análisis
gráfico ofrece
información numérica
sobre las poblaciones
estudiadas.
 ESTADÍSTICAS/REDUCCIÓN DE LA
INFORMACIÓN
  Análisis gráfico ofrece
información numérica
sobre las poblaciones
estudiadas.
  Esta información
numérica de una
muestra se representará
en una fila de una
matriz de datos
ANÁLISIS CITÓMICO
 RELACION ESTRUCTURA/FLUORESCENCIA
COMPLEJIDAD  

LONGITUD  DE  ONDA  DE  EXCITACIÓN  

Patrones de colores usados para valorar
coexpresiones.

A A A
b b b
2 2 1

Ab1 Ab3 Ab3

A b1 A b2 A b3 color A b1 A b2 A b3 c olor
ne
eg.(-) ne g.(-) ne g.(-) gr ey ne g.(-) ne g.(-) p os.(+) r u st
os.(+) ne g.(-) ne g.(-) yellow p os.(+) ne g.(-) p os.(+) blu e
ne
g .(-) p os.(+) ne g.(-) cya n ne g.(-) p os.(+) p os.(+) violet
no
s.(+) p os.(+) ne g.(-) g r ee n p os.(+) p os.(+) p os.(+) r ed
 Tipo de expresión antigénica
Ab2 A B C

Ab2

Ab2
Ab1 Ab1 Ab1

D E F
Ab2

Ab2

Ab2
Ab1 Ab1 Ab1
InmunofenoMpaje  aplicación  
clínica  
GENERACIÓN DE LOS LINAJES
HEMATOPOYÉTICOS
 HEMATOPOYESIS
Hematopoietic Stem Cell
(Bone Marrow)

Erythroblast Megakaryocyte

Lymphoid Myeloid
Progenitor Progenitor

Erythrocyte
(Red Blood Cell) Platelets
B-Cell T-Cell Basophil Neutrophil
(Antibodies) (Viruses, Eosinophil Monocyte
Mutated
Genes)

Mast Cell Macrophage Dendritic Cell

(Antigen
Presentation)
 Hematopoyesis  
•  Antígenos pasan a ser expresados…
 Hematopoyesis  
•  Antígenos dejan de ser expresados…
 Hematopoyesis  
•  Antígenos aumentan su expresión….
 Hematopoyesis  
•  Antígenos disminuyen su expresión….
4 estadíos maturativos
M. O. normal
M. O. paciente

LMA M4
LMA M5
Mononucleosis

 FRECUENCIA ABSOLUTA DE
POBLACIONES CELULARES

Absolute
Count
Beads

# of events in quadrant
containing cell population total # of beads per test

# of events in Absolute Count bead region

x test volume
= # CD4 cells/µL
 INMUNOFENOTIPAJE DE
POBLACIONES CELULARES
 VENTAJAS DE LA CITOMETRÍA DE
FLUJO

  Sensibilidad

  Especificidad
  Técnica multiparamétrica
  Reproducibilidad
  Archivo Digital

  Velocidad en entrega de resultados

GRACIAS
CK18+ BREAST CANCER CELLS