Unidad 03

1. Tema:

➢ CITOMETRÍA DE FLUJO
➢ CITÓMICA
Curso: Fundamentos de la Robótica en equipos
Automatizados
Practica 10:
➢ CITOMETRÍA DE FLUJO
➢ CITÓMICA

Docente: Haydee Ana Guadalupe Gómez

• Conocer los principios básicos de la citometría de
flujo
• Identificar las partes del citómetro de flujo.
• Conocer los diferentes tipos de citómetros y sus
respectivas tecnologías.
• Aplicación en las diferentes áreas del laboratorio
clínico.
 Fluídica

Cámara de
fluído

LASER

y
Tanque Líquido de Tanque de Deshechos
arrastre (WASTE) Muestra (suspensión
(SHEATH) celular)
 Fluídica
La cámara de flujo:
Cámara de
■ determina las características del-flujo Fiujo

■ permite el ENFOQUE
Líquido de
HIDRODINÁMICO arrastre

■ se produce la intercepción entre el

Células
láser y la muestra, PUNTO DE
LASER
INTERSECCION Muestra
11
1>
"1
{
1>
 Fluídica
♦ Enfoque hidrodinámico permite el paso individualizado de las
células a través de la cámara de flujo.
♦ La disminución de la presión y el aumento de la velocidad en el
centro del flujo provoca la focalización (Bernoulli, 1738).
 Fluídíca

La velocidad del líquido de arrastre viene determinada por la presión a

la que está sometido, no modificable en la mayoría de citómetros
analizadores.

La diferencia de presiones entre el líquido de arrastre y la muestra,

determina la velocidad del paso de células por la cámara de flujo
(low/med/high).
 Componentes de un citómetro de flujo
Fluídica * Flujo laminar (sistema presurizado).
• Cámara de flujo (enfoque hidrodinámico).
• LASER (Light Amplification by Stimulated Emission of
Radiation.
• Luz dispersada y fluorescencia.
• sistema de filtros para la recolección de la señal.
Electrónica

Informática
 Óptica

velocidad de muestra baja velocidad de muestra alta

Máxima iluminación Iluminación variable

CV bajos CV altos
 Óptica
• Cada célula (evento) que atraviesa la fuente de luz (láser) genera una señal
(dispersión de la luz, fluorescencia) que es recogida por espejos y filtros
ópticos.

• La especificidad de la detección está controlada por la selección de

longitudes de onda por parte de espejos y filtros ópticos.
 Óptica
• Los filtros ópticos absorben o reflejan determinadas longitudes de
onda.
|FL1|
>3C(/30

53C
□
í SSC I 488/10
• Tipos de filtros: FL2
585/42
Ö 90/10 Beam
Splitt«
• Paso largo (Long Pass) 661/16 I ' DM 560SP

• Paso corto (Short Pass) FL4

• Paso de banda (Band Pass) Fluorescence

Collection
• Espejos Dicroicos Lens

• Neutros Red Diode

Laser -635 nm "H I
488 nm 488/10
Blue Lase Focusing
Lens
FSC Diode
 Óptica

Combinando los distintos filtros podemos detectar los distintos fluorocromos que
presente la muestra simultáneamente.
 CITOMETRO DE FLUJO INFORMACION

1. Tamaño celular (Forward scatter, FSC).

2. Complejidad o granulosidad celular
(side scatter, SSC).

3. Fluorescencia (FL).
 1. Tamaño celular (FSC)
Difracción. Recogida entre 0.5 y 2 °. Proporcional al tamaño celular.

Refracción. Entre 2-15°. información sobre la estructura celular externa.

Depende del Índice de refración entre el medio y las
células. Disminuye en las células muertas.

LASER
 Complejidad o granulosidad celular (ssc)
Luz dispersada lateralmente. Nos
informa sobre la estructura celular
interna.
Complejidad o granulosidad celular (SSC)
 3. Fluorescencia (FL)
• El fluorocromo absorbe la energía del
láser, vibra y emite fotones de una
longitud de onda mayor que la del
láser.
Muestra Líquido de
arrastre

• La fluorescencia emitida por cada

fluorocromo o colorante debida a la
excitación del láser es dispersada
SSC
Fuente de luz Fluorescencia

FSC
 3. Fluorescencia (FL)

La especificidad de la detección está controlada por la selección de las

longitudes de onda mediante espejos y filtros ópticos.
 3. Fluorescencia (FL)

Las células negativas también son detectadas.

 3. Fluorescencia (FL)
EXITACION EMISION
Fluoresceína (FITC) 519 nm
488 nm
Ficoeritrina (PE) Ficoeritrina-Cianina5 578 nm
(PECy5) Peridinín-clorofilla (PerCP) 670 nm
675 nm

633 nm Aloficocianina (APC) - 660 nm

Aloficocianina H7 (APC-H7) - 785 nm
Aloficocianina-Cianina7 (APC-Cy7) 767 nm

405 nm Alexa405 421 nm

Alexa430 540 nm
Pacific 455 nm
Blue
365 nm 460 nm
Hoechst33342 461 nm
DAPI 401 nm
Indo1
 FLUORESCENCIA (FL)

Intensdad
relativa

Fluoresceina (FITC)
Ficoeritrina (PE)
 Fluorescencia (FL).
FCS Filename Gate Y

Ejemplo Arithmetic
Mean

CD3 FITC.002 UL 32,01

CD3 FITC.002 UR BL.35
LL
CD3 FITC.002 3^42\
CD3 FITC.002 LR \ 21,19/

Solamente deberíamos
FÜ-H
detectar fluorescencia en
FL2-%FÍTC(FL1) el canal del fitc (FL1).
10 FCS Filename Gate Y
Seleccionamos la 10 Arithmetic

población de interés OJ 2 -i
10
Mean

CD3 FITC.002 UL 0,0

CD3 FITC.002 UR 75.61
LL
CD3 FITC.002 3,31 \
CD3 FITC.002 LRI 3,44j
•■M/i

Una vez compensada solamente tenemos fluorescencia en el

detector que nos interesa.
 Fluorescencia (FL)
Cómo compensamos?
• Para compensar lo que hacemos es restar señal de un detector a
otro.
• Se necesitan controles positivos con una sola fluorescencia conocida.
• Los equipos analógicos restan la señal antes de procesarla y por lo tanto,
no se puede recuperar.
• Los equipos digitales procesan la señal entera y después aplican
matrices.
%FL2 compensación= Median FL2pos-Median FL2neg x 100
Median FLipos-Median FLineg
 Fl uorescencia (FL)

Comprovacion de la compensation

Too Much Compensation Too Little

Bc Compensation
 Fluorescencia (FL)
Qué fluorocromos escogemos y porqué?
Fluorocromos más brillantes para los marcajes "dim" evitando el solapamiento de
los espectros con la población brillante!

Como se define y se mide el brillo de un fluorocromo?

Por su capacidad de discriminar Células DIM de les Negativas así como

las, células Negativas del’Background

Esta capacidad está influenciada por el Cv, el ruido electrónico, backgound,

autofluorescencia celular....
Por lo tanto, una medida de Sensibilidad de resolución de un fl uorocromo es el
ÍNDICE DE TINCIÓN.
 3. Fluorescencia (FL)
Índex de Tincíón (Stain Index)
Es una medida del brillo

D= Distancia de la población
positiva de la negativa
W= Anchura de la población
negativa

1. Interesan fluorocromos con elevados Índices de Tinción.

2. Interesa minimizar las compensaciones.
 Fluorescencia (FL)
Table 1. Stain index of various anti-CD4 fluorochrome
conjugates on a BD LSR II flow cytometer.
Reagent Filter Stain Index
PE 585/40 356.3
'Alexa Fluor® 647 660/20 313.1
'APC 660/20 279.2
PE-Cy7 780/60 278.5
2PE-Cy5
695/40 222.1
7PerCP-Cy5.5
695/40 92.7
*Alexa Fluor© 488 530/30 75.4
3FITC
530/30 68.9
'PerCP 695/40 64.4
APC-Cy7 7801/60 42.2
Alexa Fluor® 700 720/45 39.9
Pacific Blue™ 440/40 22.5
AmCyan 525/50 20.2
,J1 Fluorochromes listed with the same superscript number are
read in the same detector, and thus would not normally be
used in combination.
 Fluorescencia (FL)

Creación de paneles multicolor

1. Seleccionar los florocromos de acuerdo al instrumento que vamos a usar.
2. Adecuar el brillo de los florocromos al nivel de expresión del antigeno.
• Fl orocromos Brillantes - Antígenos poco expresados
• Fl orocromos débiles - Antígenos muy expresados

3. Minimizar el solapamiento de espectros de emisión en marcadores que se expresan

en la misma célula.

4. Evitar combinaciones que generen falsos positivos en caso de degradación del

florocromo.

5. Intentar, dentro de lo posible, usar fl orocromos excitados por el LASER rojo en

antígenos que se expresen en células con alta auto-florescencia.
 Componentes de un citómetro de flujo

Fluídica • Flujo laminar (sistema presurizado).

• Cámara de flujo (enfoque hidrodinámico).

Óptica • LASER .
• Luz dispersada y fluorescencia.
• sistema de filtros para la recolección de la señal.

Electrónica • Amplificación mediante PMTs.

Conversión a valores digitales.
Informática
 Electrónica

La fluorescencia generada por cada célula es recogida por diversos detectores

fotomultiplicadores de la señal (PMTs).
PMTs convierten la señal luminosa recibida en pulsos eléctricos.
 Electrónica

De cada señal podemos obtener la altura, anchura y área,

Intensidad i

Área Pulso (A)

 Electrónica

♦Estas señales eléctricas son amplificadas y digitalizadas mediante los ADCs

(Analog to Digital Converters).

♦A cada señal de fluorescencia generada por cada evento se le asigna un

canal de intensidad de fluorescencia, en función de la señal detectada por los
PMTs, en un histograma de 1 o 2 parámetros.

♦Cada evento está correlacionado de manera individual con todos los

parámetros analizados (FSC, SSC, y fluorescencias).
 Electrónica
Células /
apoptóticas

Células
Eje Y grandes

o
<
Célules
0
vivas
<
4
Células Eje X FSC
muertas
 Componentes de un citómetro de flujo

Fluídica • Flujo laminar (sistema presurizado).

• Cámara de flujo (enfoque hidrodinámico).

Óptica • LASER .

• Luz dispersada y fluorescencia.

• sistema de filtros para la recolección de la señal.

Electrónica • Amplificación mediante PMTs.

• Conversión a valores digitales.

Análisis en un sistema informático.

 Análisis de datos
El citometro nos da datos de la muestra que adquirimos:

• Formato Estándar (FCS 2.0, FCS 3.0).

• Archivo de Texto.
• Información de cada célula.
• Necesidad de compartir y comparar datos entre diferentes laboratorios y
equipos.
Celi 1 FSC-A SSC-A FITC-A PE-A PerCP-CyS-f APC-A
1 91&25 117731 3260 1064 95 96
2 91261 125190 115 136 3214 1018
3 93Ü:: 112909 70 116 114 17308
4 924::; 128917 95 110 150 11776
5 1 LILIALI 115243 84 7388 890 92
6 £&&1Ci 151105 62 136 2957 590
7___________ 9S170 126448 3260 1141 67 3
______j
8 53fiy7 124832 89 35 43 58
9 bHÍC 100535 31 50 98 12314
10 9375? 120241 152 184 113 119
11 95666 102580 96 36 156 151
12 34435 124264 97 163 3198 812
13 99: CC 134495 142 3425 757 99
14 97278 110935 28 47 80 12283
• Distinguimos 3 tipos de archivos:

o Documento o Protocolo o Plantilla: es exclusivo del software. Nos permite

visualizar los datos y escoger la información que deseamos guardar.

o Instrumentsettings: es un archivo de la configuración de los detectores. Nos

permite guardar Las condiciones de adquisición para poder adquirir muestras en
las mismas condiciones.

o Data:archivo FCS. Contiene la información sobre la muestra y es estándar. Eso

nos permite analizar estos datos con otros softwares distintos al de
adquisición.
 Software

Las diferentes formas de representar los datos en el software son, en general:

o
Gráficos de puntos biparamétricos:

Dispersión Densidad Contorno

 Software
¿Cómo estudiamos la población que nos interesa?
• utilizamos Regiones y "Gates". Eso nos permite estudiar poblaciones concretas.

SSC-
H
 Esquema de un citómetro Separador

Lase

Laser 633nm

Muestra
 Aspectos a tener en cuenta en el planteamiento
de un experimento de citometría de flujo
htp://www.inV'itrogen.com/site/us/em/home/support/Research-
Tools/Fluorescence-spectraviewer.html
http://www.bdbiosciences.com/external_files/media/spectrumviewer/
indexÁsp
Fluorescence Spectrum Viewer a Multicolor Tool

Options Curves. 4 v Cytomeler: Any Cylometer v Láser 488 v 0 Show Em Onty when Ex % > 5 Cursor Location:

100-
80¬60¬4
1—
0¬20¬0

300

Fluorochrome % 0 Ex 0 Em 0 Filters
- - -
FITC V 88 la ¡a 530/ V 0
30
- - -
PE V 62 il m 585/ V 0
42
- - -
PerCP-Cy5 V 98 la a 695/ V 0 --

5 40
- -
PE-Cy7 V 62 la a 780* V 0 - -

0
 Aspectos a considerar

• El equipo da valores absolutos.....pero no sabe si una

muestra presenta fluorescencia o no. Es necesario referenciarla a
un control.
• Aumentar la velocidad de paso de la muestra (aumentando el diferencial de
presiones) dificulta la resolución de las

• El software nos permite ver los datos de una forma estadística. Nos
muestra los datos de manera que los podamos interpretar.
 Plataforma de Citómica
Citómetro Facscalibur de BD. Los citómetros disponen de 2 LASERS.
• LASER Azul que emite luz a 488nm de longitud de onda.
• LASER Rojo que emite luz a 633nm.
Detección de 4 fluorescencias simultáneamente. 3 en el laser Azul y 1 en el LASER
Rojo.
 Plataforma de Citómica
Citbmetre Fortessa de BD. Disposa de 4 lasers.

• LASER Blau que emet llum a 488nm de longitud de onda.

• LASER vermell que emet llum a 633nm.
• laser violeta que emet llum a 405nm.
• LASER Groc-verd que emet llum a 560 nm.

Detección de 11 fluoresclncies simultbniament. 5 en el Blau, 5 en el Groc-verd, 3 en el

vermell i 3 en el violeta.
 Plataforma de Citómica

• Separador celular que disponen de 4 LASERES (488 nm, 633 nm, 405 nm ,
561 nm) y 9 detectores de fluorescencia.
• Citómetro separador de última
generación.
Dispone de 3 láseres (su carácter
modulable, hace que según las
necesidades, este número pueda
verse aumentado), láser rojo
(633 nm), azul (488nm) y Violeta
(405nm). Posee una unidad
automatizada de deposición
celular (ACDU),mediante la cual
se pueden realizar separaciones
en placas de pocillos e incluso en
portaobjetos, y un dispositivo de
control de temperatura que
permite mantener la temperatura
óptima durante todo el proceso
de separación.
Este equipo permite separar
hasta 4 poblaciones de forma
simultanea.
Citómetro de flujo para el análisis
multiparamétrico de moléculas en
soluciones líquidas
Bio-Plex es un citómetro de flujo
especializado que permite detectar
y cuantificar hasta 100 moléculas
diferentes (proteínas, péptidos o
ácidos nucleicos) de una muestra
en un solo pocillo. Se basa en la
tecnología xMAP de Luminex, y la
configuración en microplacas
permite el análisis automático de
placas de 96 pocillos con una gran
velocidad y precisión. Es una
alternativa a los ELISAs
tradicionales y está especialmente
adaptado para utilizar los kits
comercializados por Bio-Rad.
 VIDEOS

• https://youtu.be/f1Eiexfqi4w

• https://youtu.be/uvh_f0T-4oU