Generalidades de Citometría

de Flujo y Microscopia
Confocal

BQ. Karina Godoy S.

BIOREN-UFRO
 CITOMETRÍA DE FLUJO

FACS Canto II by BD, Becton Dickinson USA

 ¿Qué es la Citometría de Flujo?

La Citometría de Flujo es un método

automatizado, mutiparamétrico y
cuantitativo que analiza las señales
dispersadas y fluorescentes producidas
por una célula al pasar por un haz de luz.

El principio se basa en células

suspendidas en un liquido son pasadas
individualmente frente a un fuente de luz
intensa (laser) y los datos de luz refleja y
en la mayoría de los casos de la
fluorescencia son recogidos y organizados
en un archivo.
Principio de la CMF
Citometría de Flujo
Equipamiento BIOREN Citometría de
Flujo
PMTs (filtros) : 6 canales
fluorescencia + 2 parámetros
de dispersión (FSC y SSD)

Tamaño muestras: 0,2 a 100µm

Densidad celular 105 a 107

células

10.000 ev/segundo

Laser lines: Blue Laser (488nm), Red Laser (633nm), Violet (405nm)

Software: FACs DiVa (Acquisition dot plot, countour plot and histograms). FCS
2.0-3.0, PDF image format.
Propiedades ideales de un fluorocromo

Los fluorocromos ofrecen un método sensible para obtener información

acerca de la estructura, función y vitalidad de las células.

Características Generales

1. Alto coeficiente de extinción a la ʎ excitación (probabilidad de absorber

la luz).

2. Alto rendimiento cuántico (emisión)

3. Elevada fotoestabilidad

4. Corto estado de excitación

Fluorocromos utilizados en CMF
Aplicaciones de la Citometría de Flujo
Aplicaciones de la Citometría de Flujo
 Aplicaciones de la Citometría de Flujo:
discriminación por FSC y SSC

Granulocitos

Linfocitos
R1

Monocitos
Aplicaciones de la Citometría de Flujo:
marcaje superficial
Aplicaciones de la Citometría de Flujo:
marcaje superficial
Aplicaciones de la Citometría de Flujo:
cantidad de DNA en células

G0/G1
S
M1 G2/M
M3
M2

2n 4n
Aplicaciones de la Citometría de Flujo:
Apoptosis
Apoptóticas
tardías
Necróticas

Viables Apoptóticas
tempranas
CONFOCAL LASER SCANNING
MICROSCOPY, CLSM

FV1000 Olympus, JAPON

 ¿Qué es Microscopía Confocal?

Es un tipo de microscopía de fluorescencia que permite el estudio de

muestras de organismos marcados fluorescentemente
tridimensionalmente gracias a la capacidad de seccionamiento óptico
del equipo utilizado.

Su éxito se debe a las indudables ventajas que ofrece frente a la

microscopía tradicional (nitidez, contraste, resolución)
Principio de la Microscopia Confocal
“Se basa en la existencia de 2 diafragmas (pinhole), uno entre la fuente
de luz –objetivo y otro entre objetivo-detector”

Luz procedente de la fuente de

iluminación atraviesa el primer
diafragma , es reflejada mediante un
espejo dicroico y se enfoca en un
punto del espécimen mediante el
objetivo.

La señal emitida por el punto

iluminado vuelve por el mismo camino
óptico, pasa a través del espejo
dicroico y es enfocada en un detector.

Un segundo diafragma o pinhole es

colocado delante del detector para
eliminar señales procedentes de la
zona fuera de foco.
EQUIPAMIENTO BIOREN MICROSCOPIA CONFOCAL

Laser lines: Multi Argon Laser (458nm, 488nm, 515nm), HeNe(G) Laser (543nm), LD Laser (405nm,
635nm)

Objectives: Olympus UPLANFL 4x, Olympus UPLANFL 10x, Olympus UPLANFL 20x, Olympus UPLSAPO
40x, Olympus UPLSAPO 60x (Water immersion), Olympus UPLSAPO 100x (Oil immersion)

Software: FV10-ASW 2.0 (Acquisition, 3D preview, line analysis, etc). OIB, OIF and TIFF image format.
The image of the left shows a multinucleated osteoclast cultured on dentine, stained identically to
the osteoclast in the top image. Sytox green and Alexa Fluor-488 have closely overlapping
emission spectra (both detected in the FITC ‘green’ channel).
Image: macrophages immunostained for Rab6 (Alex Fluor-488; green). Golgi apparatus stained using
wheat germ agglutinin-633(red). Bottom right panel shows colocalisation of these fluorophores in an
overlay of these images with Nomarski.
Literatura

•Howard M. Shapiro “Practical Flow Cytometry”. Fourth Edition

WILEY.LISS 2003. ISBN 0-471-41125-6.

•J.Paul Robinson & col. “ Current Protocols in Cytometry”.

WILEY.LISS – International Society for Analytical Cytology. Vol 1.

•Rafael Fgonzalez & Richard Woods. “Digital Image Processimg”.

Rentice Hall 2ª Ed. 2002.