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TEMA 10 - Citometría DE Flujo

CULTIVOS CELULARES (Universidad Pablo de Olavide)

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TEMA 10 (I) – CITOMETRÍA DE

FLUJO
JA no tiene mucha idea, lo importante es para qué sirve la citometría, las aplicaciones.

La citometría de flujo es una técnica de análisis que permite la caracterización fenotípica celular mediante el
estudio de la dispersión de la luz y de la fluorescencia emitida cuando a la célula le atraviesa un rayo láser.

La citometría de flujo consiste en un láser que incide sobre un capilar por donde van pasando células en fila,
de forma ordenada e individualizada, de manera que se puedan identificar y almacenar cada una de sus
características. La incidencia de esta luz sobre las células provoca una serie de señales que es recogida por
unos detectores y nos da información. El láser lo podemos elegir, debemos decidir qué láser cogemos para
que incida sobre las células y hagamos las detecciones. El láser que vayamos a usar a su vez depende del
fluorocromo que pongamos dentro de las células, tenemos que poner un láser que excite al fluorocromo que
he puesto. Los citómetros de última generación viene con varios tipos de láser.

La estructura básica de un citómetro de flujo es la siguiente:

Es importante decir que la selección de determinadas longitudes de onda se hace por cristales dicroicos. Lo
que permite detectar varias longitudes de onda.

Los parámetros que siempre se miden de las células en un citómetro de flujo y que nos permiten construir
gráfico son:

-Forward Scatter: se trata de la sombra que da la célula en el receptor a consecuencia de la incidencia de luz.
Esta sombra es proporcional al tamaño de la célula.

-Side Scatter: difracciones de la luz al pasar por la célula que son detectadas por receptores. Mientras mayor
sea la complejidad mayor será difracción y mayor el Side Scatter.

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También se puede medir opcionalmente la excitación de un fluorocromo que estés usando. Aunque se
clasifica por colores, el citómetro también es capaz de discernir entre distintas intensidades de color.

En caso de que tengas un fluorocromo y no sabes qué láser usar, para ello haces un espectro de absorción.
Donde absorba más será la región del láser que debes usar.

Se trata de una técnica muy preciada porque no tienes porque matar a las células para verlas, puedes
recogerlas después; mide una gran cantidad de células (o eventos) y es capaz de visualizar muchísimas
estructuras (depende de los fluorocromos que uses, a que se unan). También se usa ampliamente para medir
apoptosis. Hay un compuesto DEVD, que cuando se activan las caspas, lo cortan y una vez roto emite
fluorescencia. Hasta puedes usar unos específicos de cada tipo de caspasa (por ejemplo la caspasa 3).

En el examen puede preguntarnos que le dibujemos una estructura básica de un citómetro de flujo. Quiere
que sepamos el siguiente esquema:

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El esquema muestra un citómetro de flujo ortogonal. Hay que tener presente donde pongamos la fuente
luminosa y la fuente de flujo. El detector de Forward scattering está en el mismo eje que la fuente. El de Side
scatter no, porque ve la dispersión. Hay que decirle que los espejos son dicroicos

Esquema de un espejo dicroico:

Refleja una longitud de onda y deja pasar otra. Son muy útiles en el citómetro de flujo.

Detectores de un citómetro de flujo

Los detectores lo que hacen es transformar los fotones de la luz a unidades de voltios que se pueden medir.
Es importante que elijamos el sistema de detectores adecuado, teniendo en cuenta de cuantos fotones
disponemos. Existen dos sistemas:

 Fotodiodos de silicona o fotodiodos:

o Se prouce una corriente cuando los fotones llegan.
o No requiere de ninguna fuente externa de energía para funcionar.
o El pico de sensibilidad está entorno a 900 nm, con una “respondibilidad” de 0,5 A/W.

 Fotomultiplicadores:
o Los fotones golpean una placa de metal. De ésta salen electrones que golpean otra y salen
más electrones. Así se va amplificando la señal (hasta 10 7 electrones por fotón) y finamente
llegan al ánodo.
o En este caso si que se requiere una fuente externa de energía
o Se puede apreciar mayor cantidad de ruido

Sólo ha dicho: hay dos sistemas, y ha explicado la amplificación de electrones y ya.

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1. FLUOROCROMOS

Los fluorocromos son moléculas que cuando son excitadas a una longitud de onda, emiten a una superior,
siendo esta fluorescencia. Ofrecen un método sensible para obtener información acerca de la estructura,
función y vitalidad de las células. Los usamos en citometría para marcar estructuras concretas, ya sea por su
unión directa a la estructura o por su unión a un anticuerpo específico contra una estructura concreta. Modo
de uso:

1. unión covalente del fluorocromo a moléculas que se unen específicamente a componentes

celulares.

2. fluorocromos que varían sus características en función del microambiente que les rodea.

El primero de la tabla es FITC. Es uno de los más usados por su frupo N=C=S
que permite una buena unión a distintas proteínas

La absorción máxima de la tabla te dice el láser que debes usar y la emisión,

por su lado, el detector a usar.

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Las propiedades ideales de un fluoróforo son:

 Alto coeficiente de extinción a la longitud de onda de excitación (probabilidad de absorber la luz),

• Alto rendimiento cuántico (emisión de luz),

• elevada fotoestabilidad,

• Corto estado de excitación.

• Si el fluorocromo va a estar unido a algo, éste debe ser insensible a cambios de pH, polaridad y
microambiente.

• Recordar que a longitudes de onda inferiores a 500 nm se produce una alta autofluorescencia celular
debido a las flavinas.

Marcadores fluorescentes de unión covalente:

Son fluorocromos que reaccionan y se usan para marcar proteínas, lípidos, o bien otras moléculas biológicas.

• Deben ser suficientemente selectivos y reactivos.

• Por su capacidad de unión se emplean cromóforos con grupos isotiocianato, clorotrirzinil, y ésteres
de succinimida.

Fluorocromos covalentes más empleados (excitables a 488 nm):

• Fluoresceína

• Rodamina

• Rojos Texas

• Cianinas

• Ficoeritrina (ficobiliproteína), famoso por su gran absorción, rendimiento y fotoestabilidad.

EX: parte de una pregunta puede ser que le

digas el nombre de algún fluoróforo de
esta lista.

Te puede poner también un esquema como

el de la derecha y preguntarte que
fluorocromo utilizarías si el citómetro que
tu tienes posee un láser de por ejemplo
457 nm.

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Fluoróforos que se unen NO covalentemente a estructuras celulares (no dijo nada):

Debido a su composición molecular se unen a determinados componentes celulares.

 Marcadores del contenido en ADN y ARN:

– Según el tipo son más o menos específicos para el ADN, ARN, o determinadas bases.

– Hoechst 33342 (Unión a A-T, vital).

– DAPI (A-T), DIPI (A-T).

– cromomicina A3 (Unión a G-C).

– olivomicina (G-C), mitramicina (G-C).

– Naranja de acridina se une al ADN y ARN pero tiene la particularidad de emitir en diferente
longitud según al tipo de ácido nucleico al que está unido.

– Ioduro de propidio (unión intercalante) que se excita con un láser de 488 nm.

• Marcadores del potencial de membrana

– Cianinas y la rodamina 123. También marcar mitocondrias debido a la alta diferencia de

potencial entre su membrana.

• Marcadores de membrana y lípidos

– marcadores que diferencian compartimentos con distinto pH: poco usados en citometría de flujo.

Marcadores fluorescentes que son sensibles al microambiente que les rodea: (no dijo nada)

• Varían su espectro de absorción o emisión en función de las características del microambiente que
les rodea. Se emplean para la determinación de diversos estados funcionales celulares

– pH (6-carboxi-fluoresceína, 2,3-diciano-1,4-dihidroxidenceno, hidroxipireno trisulfato),

– calcio (quin II, fura-2, indo-1),

– potencial red-ox (diclorofluoresceína, NADH, NADHP),

– actividad enzimática (substratos que por acción del enzima varían su fluorescencia o
espectro),

– polaridad (anilino-naftalina-sulfato o ANS),

– viscosidad/fluidez.

Técnicnas inmunofluorescentes, inmunofenotipaje: (no dijo nada)

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 En la diferenciación y maduración celular se expresan genes, algunos de los productos específicos se

expresan en la superficie celular, esto permite caracterizar subpoblaciones celulares.

• La producción de inmunoglobulinas (anticuerpos) a partir de un solo linfocitos B (anticuerpos

monoclonales) permite identificar antígenos muy específicamente.

• El fluorocromo que se conjuga al anticuerpo actúa como un simple marcador con el que se pueden
marcar distintos anticuerpos (facilita la standardización del sistema óptico del citómetro).

Distintos procedimientos técnicos para usar anticuerpos marcados con fluoróforos:

El método Indirecto es mejor que el directo porque se pueden unir varios a la cadena pesada del Ac 1º y se
amplifica por tanto mucho la señal. (De la segunda imagen azul pasó, solo se fijó en la primera).

2. APLICACIONES DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO

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La CMF se puede emplear para estudiar características estructurales y funcionales de células o partículas en
suspensión. Las aplicaciones fundamentales de esta técnica se dan en biología y medicina y son la
identificación de antígenos celulares mediante técnicas de inmunofluorescencia y el estudio del contenido de
ADN y fases del ciclo celular.

• En hematología: contaje celular, fórmula leucocitaria, contaje reticulocitario, análisis de médula

ósea.

• En farmacología: estudios de cinética celular.

• En inmunología: subpoblaciones T, tipaje tisular, estimulación linfocitaria. como podemos detectar

los receptores de supericie podemos clasificarlas en los distintos subtipos.

• En oncología: diagnóstico/pronóstico, monitorizar tratamiento.

• En microbiología: diagnóstico bacteriano y vírico, sensibilidad a antibióticos.

• En genética: cariotipo, diagnóstico de portador, diagnóstico prenatal.

Otras aplicaciones que podemos obtener de un citómetro de flujo.

-Cantidad de células que hay en la muestra: mide el número de células. Te ayuda a medir
concentración, cuanto han crecido las células (ensayo de crecimiento).

-El tamaño de la célula. Si pasa una célula muy grande, tapará más la luz del láser. El tamaño de las
células es importante verlo, si ves leucocitos muy grandes puede ser que sean mieloblasto. El tamaño
también te dice si las células están más o menos vivas, si están muertas, las células van a ser más
pequeñas.

-La complejidad: la cantidad de

organelas, la cantidad de gránulos…
al atravesar el láser va a dispersar
mucho la luz. Mientras más
dispersión de la luz del láser mayor
será la complejidad celular. Esto es
tan importante que el citómetro
muestra una gráfica de Side Scatter
(COMPLEJIDAD) vs Forward Scatter
(TAMAÑO)

-La dotación cromosómica: G0 y G1

= 2n, S: dotación intermedia, G2 y Mitosis: 4n. Para este tipo de aplicación el ADN se tiñe con Ioduro
de Propidio (PI), aunque se pueden usar otros como DAPI o Hoescht (todos ellos deben ser capaces
de excitarse). Este compuesto se une al ADN, la intensidad de la célula te dice la cantidad de DNA que
tiene esa célula. En apoptosis aparece un pico antes de G1-G 0 (zona sub G1), han perdido DNA.
También se incluirían aquí necróticas que han ido perdiendo ADN.

La gráfica muestra número de células vs intensidad del colorante PI:

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DE AQUÍ CAE PREGUNTA DE EXAMEN  Nos va a poner una gráfica del tipo de la de arriba y nos va a
decir que las células se han tratado con un tóxico; nos preguntará el efecto del tóxico y en que parte
del ciclo actúa.

Esto es un ejemplo que dio en clase. ( Figura Obtenida de: Jara’s Notebook: a new concept of cell cultures.
Ed. 1, 2015) A la vista de la imagen, el tóxico actuaría en G2-Mitosis, parando el ciclo celular. Otro
colorante también muy usado es DAPI. Leyenda: Número de células vs PI.

-Diferenciar distintas poblaciones de células. Podemos unir anticuerpos específicos para una
molécula de superficie específica de una población de células. A ese anticuerpo unimos un fluoróforo
y excitamos diferencialmente distintos fluorocromos con lo que podemos distinguir entre las distintas
poblaciones: Ej CD45, CD3…

Ej: Células de la sangre: linfocitos, hematíes, PMN, Monocitos, Basófilos, Plaquetas, Eosinófilos…
Todo esto lo puede separar el citómetro en una gráfica de Tamaño contra Tinción. Esto se utiliza
mucho en hematología en hospitales.

-Ver eficiencia de transfección. Por ejemplo queremos meter una proteína en la célula, y para
seguirla la unimos a GFP. El citómetro excita a la GFP y así eres capaz de ver cuánta GFP tienes. Eso
será equivalente a la cantidad de proteína que tienes. Así puedes medir la eficacia de la transfección.

-Ver la cantidad de lisosomas dentro de la célula. Para ello marcamos con LysoTracker (Molecular
Probes). El LysoTracker son moléculas que tiene afinidad por ambientes ácidos y se van a las vesículas
ácidas: lisosomas. Pero en caso de tener una enfermedad cuya patología es tener mitocondrias

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ácidas también se te van a ir allí, es decir, no son 100% específico. La fluorescencia que te mide el
citómetro es la del LysoTracker y te permite saber la cantidad de vesículas ácidas.

-La cantidad de mitocondrias igual pero con MitoTracker. En este caso la cualidad que se mide es el
potencial mitocondrial. La matriz de la mitocondria es negativa (porque echa protones al espacio
intermebrana), y el MitoTracker es una molécula muy positiva, por eso se va a ir a las mitocondrias
preferentemente (si echamos mucho MitoTracker, se puede ir a otras zonas positivas como el
núcleo). Pero recalquemos que NO sólo tiene porque ir a la mitocondria, sino que se puede ir a otras
vesículas de carga positiva.

Por otro lado, si el MitoTracker no va a la mitocondria quiere decir que las mitocondrias por alguna
razón están funcionando mal. Las mitocondrias en este caso estarían despolarizadas. Cuando esto
ocurre las mitocondrias se fisionan, se hacen más pequeñas y redondas lo que facilita que las
mitocondrias sean fagocitadas. Esto ocurre cuando por ejemplo hay una necesidad de detoxificar
más eficientemente un tóxico que esté entrando en las mitocondrias.

MITO Y LYSOTRACKER  Pregunta de examen

-Ver Calcio dentro de las células. Hay un compuesto llamado FURA que es fluorescente y que se une
al calcio. De igual forma y con otros compuestos también se puede medir potasio y muchas cosas
más… Molecular Probes tiene fluorocromos para casi todo.

-Cell Sorting. es un aparato acoplado al citómetro encargado de separar células físicamente de la

siguiente forma: cuando detecta una excitación particular, separa esa célula a otro lugar. Así puedes
separar distintas líneas celulares.

Los “sorters” (citómetro capaz de hacer cell sorting) tienen las mismas prestaciones y posibilidades que los
citómetros de flujo pero con la capacidad adicional de separar partículas selectivamente.

El Sorter lo que nos permite es

separar poblaciones de células.
Las células van cayendo y se tecta
su señal fluorescente.
Dependiendo de esta (y
previamente tú se lo has tenido
que decir), el citómetro carga
eléctricamente a esa célula en
particular y cambia su trayectoria
hacia un tubo. La trayectoria se
cambia porque la célula se carga
por ejemplo positivamente y se
pone algo que atrae las cargas
positivas hacia el tubo.

Ej: CD34+ son células madre hematológicas. Le ponemos anticuerpo anti CD34+ en verde, y le decimos que
las que vea verde me las mande al tubo X.

IMP: Hay citómetros que además del láser tiene una cámara de microscopia y puedes además ver la células.
Te ahorras tener que verlas en el microscopio.

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Existe un PROBLEMA grande relacionado con el mundo de la citometría de flujo. Este problema reside en que
el fluorocromo a detectar se tenga que unir a algo dentro de la célula sea realmente capaz de penetrar
dentro de la célula y pueda ser objeto de unirse, irse a mitocondrias, cortarse y emitir fluorescencia, etc. Si
no es capaz de pasar, estaríamos teniendo datos negativos falsos.

3. TIPOS DE GRÁFICOS OBTENIDOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO

Histograma obtenido de un citómetro de flujo

El histograma representa la presencia de un único parámetro, por

ejemplo la longitud de onda de un fluorocromo. En el eje de abscisas
se muestran las diferentes intensidades, mientras que en el eje de
ordenadas contabiliza el número de células que emitieron luz a esa
intensidad y color. A partir de una intensidad se considera intensidad
positiva para ese fluorocromo (se lo tienes que decir en los settings al
citómetro), los datos después presentados en el gráfico proporcionado
por el citómetro serán positivos.

DotPlot obtenido por un citómetro de flujo.

En este tipo de gráficos se

representan dos parámetros medibles y se representa cada
célula como un punto. Definimos cada parámetro lo que
consideramos nosotros positivo y negativo, de manera que
tendremos 4 cuadrantes: (-,-) (+,-) (+,+) y (-,+). Esta
representación es muy útil cuando distintos linajes celulares
presentan el mismo primer parámetro pero queremos
diferenciar poblaciones.

EXAMEN: Vamos a ver un ejemplo referido a Apoptosis. Lo

primero que hay que saber es que las células expresan Anexina
en su membrana y poseen el córtex celular aún vivo, por lo cual
son impermeables. Los estudios que podemos hacer en
apoptosis incluyen normalmente un anticuerpo con fluorocromo que detecta la Anexina y PI, que va a
penetrar más en aquellas con un córtex permeable, esto es, células necróticas.

En la imagen que se muestra en el OY la cantidad de PI, de manera que si es positivo para este parámetro, tu
membrana es permeable; y en el OX, la Anexina, de manera que si eres positivo es que se trata de una célula
apoptótica. Así pues lo cuadrantes representan:

(-,-): células normales (es donde hay más células)

(-,+): células necróticas. (en este caso hay muy pocas)

(+,-): células apoptóticas.

(+,+): células en necrosis secundaria, eran antes apoptóticas pero han entrado en necrosis debido al
tiempo.

Pregunta de examen: Características de las células en necrosis secundaria por citómetría de flujo. Respuesta:
presentan Anexina + y PI +.

A partir de los DotPlot se pueden obtener los Density DotPlots. Son dotplots a los que se les ha añadido un
tercer parámetro, obteniendo un tercera dimensión. Este tercer parámetro puede ser la presencia de un

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tercer fluorocromo. No obstante, también podemos hacer un Density dotplot utilizando como parámetro la
intensidad de las zonas de la nube de puntos, es decir, se hay muchos puntos agrupados, se verá a modo de
pico elevado en un Density DotPlot.

Gating Booleano o Complejo

Seleccionar una población: gating. Podemos coger una

región y decirle que te lo represente en otro gráfico. También puedes decirle que te represente una
población con otros parámetros. Una vez que el citómetro haya recogido todos los datos éste puede coger
los que sean y representarlo como quieras.

Un tipo de Gating es el Back-Gating en el que coges una población de células y la pasas a un DotPlot de
Forward vs Side scatter para ver qué forma tienen.

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4. CITÓMETRO DE COULTER (Algo de historia que sí ha comentado)

Se trata de una cámara donde hay un orificio por donde pasan las células. Hay
un potencial que se altera cuando pasa cada partícula. Esto permitió contar el
número de células, esto se aplicó al citómetro de flujo.

W. Coulter describió (1949) el principio que lleva su nombre. Desarrolló un

contador celular basado en el cambio que produce una partícula al pasar por un
agujero en el que hay una diferencia de potencial conocida. En 1966 también
usó cambios en ondas de radiofrecuencia.

5. SISTEMAS DE FLUIDO

Son los sistemas por los que el citómetro es capaz de obtener muestras, y
pueden ser:

Sistemas basados en presión positiva. Estos sistemas se basan en crear una

diferencia de presión entre la muestra y el tubo por donde pasará la
muestra. Para ello se requiere balancear la presión por el uso de aire o
nitrógeno. La velocidad de flujo que son capaces de crear varía entre 2 a 10
ms-1.

Sistemas basados en jeringas que crean presión positiva. Se usan jeringas

con volúmenes fijos de 50 o 100 µL. Normalmente se intoduce la jeringa en
una cabina cerrada, y son capaces de crear un flujo de 1 a 2 ms -1.

Sin embargo, el flujo a veces no es continuo sino que la cámara de flujo se puede atascar:

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Lo que ha dicho que mejor hay que saberse

-Los ejemplo que ejemplos que ha dicho que son importantes para el examen.

-Forward y Side scatter.

-Cómo se hace la detección de apoptosis con citómetro de flujo.

-Cómo se usa para ciclo celular

En el tema hay muchas diapositivas sobre historia que ha dicho que si queremos las leamos por culturilla.

TEMA 10 (II) – APLICACIONES

Este tema lo ha dado en los últimos 5 minutos. Os voy a poner directamente las diapositivas en las que se
paró y si dijo algo de alguna os lo pondré debajo.

Básicamente vuelve a hablar de aplicaciones que ya se han mencionado antes.

Problemas biológicos abordables mediante citometría de flujo:

-Estudio de complejidad y heterogeneidad del sistema inmune.

-Estudio del crecimiento celular.

-Estudio de la apoptosis.

-Cuantificación de la actividad fagocítica.

-Cuantificación de la actividad microbicida.

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ESTUDIO DE LA COMPLEJIDAD Y HETEROGENEIDAD DEL SISTEMA INMUNE:

Nos permite diferenciar entre poblaciones

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ESTUDIO DEL CICLO CELULAR

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ESTUIO DE LA ENUMARACIÓN CELULAR

ESTUDIO DE APOPTOSIS Y NECROSIS

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ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD FAGOCÍTICA

Ver si los macrófagos tienen o no actividad fagocítica y cuánta tiene. E. coli con fluoresceína. Ahora vamos
viendo cuantas se están comiendo. Mientras más verde se pongan, más bacterias se habrán comido.

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ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD MICROBICIDA

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Producción de radicales libres por macrófagos. Los ROS producidos por los macrófagos debidos a su actividad
microbicida hacen que la 1,2,3-dihidro-rodamina no fluorescente pase a rodamina que sí lo es y se ve en el
canal de FITC (verde).

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