ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO y TECNICAS DE MUESTREO DE ALIMENTOS.

Control microbiológico de alimentos

Los microorganismos se encuentran en los más diversos ambientes y materiales. Esta
presencia se basa en tres características principales: pequeño tamaño, viabilidad y
flexibilidad metabólica y plasticidad genética.

El análisis microbiológico de indicadores es útil para evaluar la higiene en la

manipulación de los productos, y nos permite comprobar la necesidad de establecer
medidas correctoras para evitar niveles altos de microorganismos alterantes que
pueden modificar las propiedades organolépticas de los productos finales.
Los microorganismos indicadores se pueden analizar en el producto, superficies de
trabajo y ambientes y nos ayudan a saber si los procesos de limpieza y desinfección
son eficaces.

El análisis de patógenos es muy importante para detectar la presencia de

microorganismos que pueden causar problemas de salud (Salmonella spp., Listeria
monocytogenes, Escherichia Coli, Clostridium Perfringes, Bacillus Cereus, Legionella
pneumophilla, etc.)

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Microorganismos y Bacterias detectados:

 Aeróbios Mesófilos
 Bacillus Cereus
 Campylobacter
 Candida Albicans
 Clostridium Perfringens
 Clostridium Sulfito Reductores
 Coliformes Fecales
 Coliformes Totales
 Legionella Pneumophilla
 Bacterias Lácticas
  Vibrio Parahaemolyticus

 Enterobacterias
 Escherichia Coli
 Estreptococos Fecales
 Listeria Monocytogenes
 Mohos y Levaduras
 Pseudomonas Aeruginosa
 Salmonella Spp
 Salmonella Shigella
 Staphylococcus Aureus
 Vibrio Cholerae
Objetivo de un análisis microbiológico:
El principal propósito que se persigue con un tipo de estudio de estas características es
determinar si existe algún riesgo para la salud animal o humana y saber cuáles son los
elementos que exponen ese alimento a la contaminación, con el fin de evitarlos.

Partes de un análisis microbiológico:

Muestreo
El muestreo en superficies de trabajo puede hacerse mediante placas petri o hisopo.
Para ambientes se utiliza el método de decantación por gravedad en placas petri.
Además suele establecerse control de manipuladores en manos y tos forzada.

El muestreo de los alimentos destinados al análisis microbiológicos es la operación que

consiste en separar un número determinado de muestras de un lote, remesa o partida
con el fin de obtener unos resultados analíticos fiables. Debemos obtener una muestra
representativa del total.

Métodos de muestreo
El número de muestras para el análisis microbiológico está relacionado con la precisión
que se requiera obtener en los resultados.

 Un lote, es una cantidad de alimentos producida o manipulada bajo

condiciones uniformes.
 Una muestra, es un número de unidades del lote que se toman para
analizar.
El método de muestreo aleatorio consiste en separar un número de muestras de un
lote, según una tabla de números al azar.

Técnicas básicas de análisis en microbiología de alimentos

Una vez se tienen las muestras, se elige la técnica de análisis.

1. Método de recuento en placa, consiste en realizar diluciones con la muestra, para

llegar al cultivo en placa de Petri de cantidades conocidas de muestra y así poder
contar las colonias de microorganismos.
2. Método de detección (presencia/ausencia), se busca poder analizar un alimento
para poder decir si contiene o no un determinado microorganismo en una cantidad
determinada de alimento.

Criterios Microbiológicos
A lo largo de los años se han ido modificando las legislaciones de aplicación a los
criterios microbiológicos. Hasta el año 2005 los criterios microbiológicos en España
estaban indicados en diferentes reales decretos.

En el año 2005, Europa editó un Reglamento que recopilaba los criterios

microbiológicos para los distintos alimentos, el Reglamento (CE) nº 2073/2005 de la
comisión del 15 de noviembre de 2055 relativo a los criterios microbiológicos
aplicables a los productos alimenticios.

En 2007 salió la modificación de este reglamento, el Reglamento (CE) nº 1441/2007 de

la comisión del 5 de Diciembre de 2007, que modifica el 2073 relativo a los criterios
microbiológicos aplicables a los productos alimenticios.
 DISEÑOS DE PROTOCOLOS DE MUESTREO

INTRODUCCION

Al realizar un análisis existe una secuencia de etapas a seguir que se inicia con la
identificación del problema analítico, luego se elige el método a utilizar, se procede al
muestreo, se realiza el procedimiento analítico, se hace la determinación y finalmente
se evalúan los resultados para emitir el informe correspondiente.

El muestreo apropiado de los alimentos es importante en todos los estudios de

composición de alimentos y de fundamental importancia en los sistemas de base de
datos; la responsabilidad mayor del muestreo debe ser asumida por el analista.

El muestreo debe ser compatible con los objetivos claramente definidos del trabajo
analítico, por eso el muestreo y el programa analítico deben ser considerados.

Una correcta colección de muestras de alimentos y su adecuado tratamiento es crucial,

de ahí que el cuidado que se otorgue al muestreo debe ser por lo menos igual al dado
al análisis.

Muy a menudo, un análisis muy exacto, costoso y lento puede desperdiciarse si las
muestras de alimentos no han sido apropiadamente colectadas, manejadas
inadecuadamente o documentadas pobremente.

El muestreo corresponde a la selección y colección de ítemes de alimentos definidos

en número, tamaño y naturaleza para ser representativo del alimento.

Los objetivos del muestreo para estudios de composición son:

a. Coleccionar alimentos representativos de aquellos disponibles o consumidos

por la población concerniente.
b. Entregar información de las variaciones en la composición de los alimentos.
c. Asegurar que las porciones tomadas para el análisis son representativas de los
alimentos colectados.
d. Prevenir las pérdidas, contaminación o degradación del material en todo
tiempo durante la colección, manipulación, almacenamiento o análisis.

Los métodos de muestreo de alimentos para estudios de composición, pueden ser: i) al

azar; ii) selectivos; iii) muestreo controlado.

Una muestra al azar es aquella en la cual cada ítem del alimento bajo consideración,
tiene la misma chance o probabilidad de ser incorporado en la porción analítica. El
proceso al azar puede ser modificado dando peso a la distribución poblacional o
considerando modelos de consumo regional, o sea, se puede ponderar.
Cualquier forma de muestreo que no sea al azar se considera como muestreo
selectivo. Si bien es cierto puede proporcionar datos útiles para la base de datos, éstos
no pueden considerarse representativos de los alimentos tal como se producen
comercial-mente o como se encuentran a disposición del público general y hay que ser
muy cuidadoso en el uso que se dará a estos datos. Ejemplo de muestreo selectivo:
alimentos sometidos a estudios especiales de fertilizante, o de cocción en microonda o
en el laboratorio.

Un ejemplo de muestreo por conveniencia, sería el muestreo sólo a puntos accesibles

y es un error común y posible. No deben entrar estos resultados en la base de datos,
pero podrían usarse como ejercicios preliminares para estimar la variación en la
composición.

DISEÑO DE UN PROCEDIMIENTO DE MUESTREO

Cuando un alimento es coleccionado específicamente para generar resultados para

una base de datos de composición de alimentos, es de primordial importancia que las
muestras sean representativas del alimento, tal como es consumido o está disponible.

La muestra corresponde a una porción de material que ha sido seleccionada de una

gran cantidad de material.

La muestra representativa es aquella resultante de un plan de muestreo y se espera

que refleje adecuadamente las propiedades de interés de la población madre.

Se entiende por plan de muestreo el procedimiento determinado para la selección,

extracción, preservación, transporte y preparación de las porciones a ser removidas de
una población para servir como muestras.

Es necesario entonces construir una forma de muestreo que refleje esta consideración
y dirigida a la obtención de alimentos que remede el modo de proceder del
consumidor (muestras del campo o del supermercado). Es por eso que los planes
selectivos son en muchos casos inapropiados, porque han sido diseñados
originalmente para otros fines.

Tomada la decisión de analizar alimentos específicos se debe diseñar un protocolo de

muestreo que debe definir el número y tamaño de ítemes de alimentos y donde
pueden ser obtenidos. Debe describir el detalle de cómo deben colectarse y cómo
debe prepararse la muestra en el laboratorio.

El diseño del plan de muestreo debe utilizar información proveniente de diversas

fuentes para tener datos de producción, almacenamiento y distribución de alimentos.
Se necesitan también datos estadísticos de demografía y consumo para definir su
distribución y así su colección para análisis.

El plan de muestreo requiere conocer el rango de concentración de los nutrientes que

serán analizados y su concentración mínima detectable, para establecer la cantidad
suficiente de material a colectar.
Previamente se debió decidir si se analizarían muestras simples o compuestas porque
si interesa, por ejemplo, información de la variación se deben analizar muestras
simples pero realizar varias repeticiones.

La extracción de muestras estratificadas y al azar se puede aplicar para seleccionar

sobre una base geográfica o económica y determinar al azar los puntos de colección
dentro de cada área.

Si se desea coleccionar muestras representativas, puede ser necesario aplicar una

ponderación en el procedimiento de muestreo. Ejemplo: para que se refleje en la
muestra compuesta la distribución de la producción del alimento en 3 áreas cuyos
volúmenes de producción son 3:2: 1, entonces las muestras colectadas deben ser
ponderadas en la misma proporción.

El plan de muestreo debe también incluir disposiciones para la colección de muestras

indicando qué instituciones la realizarían.

Una vez elaborado un plan de muestreo con todos los detalles, se debe someter a
discusión con cada uno de los participantes en la colección y análisis de los alimentos,
de modo que los requerimientos del plan se conozcan y se comprenda su importancia.

FUENTES DE ALIMENTOS PARA ANALISIS

En el Cuadro 1 se presentan las mayores fuentes de muestras de alimentos para

análisis destinados a base de datos de composición de alimentos.

Mercadería a granel

Generalmente se analizan para el comercio internacional y deben ceñirse a planes de

muestreo estándares (ISO, AOAC).

Se debe tener precaución para asegurarse de la representatividad de la muestra.

Muchas muestras se extraen de sacos, cajas o de muchas partes del silo o del
"container", de preferencia al azar, pero es preferible muestrear durante la carga o
descarga de la mercadería. Debe poseerse equipos de muestreos.

Alimentos al por mayor

Se debe aplicar muestreo al azar.

Alimentos al por menor

Constituyen la mayoría de los alimentos cuyo análisis está destinado a base de datos
de composición de alimentos en países industrializados. Para productos primarios
como carne, frutas, vegetales, las muestras deben ser adquiridas en un variado rango
de locales de venta y el número de muestras debe guardar relación con la importancia
del negocio dentro de la infraestructura de la región. Muchas veces es necesario un
muestreo independiente para centros comerciales urbanos y rurales, pero las
muestras deben combinarse en una proporción que refleje la densidad poblacional y/o
el volumen de producción en esas regiones.

Cuadro 1
Principales fuentes de alimentos para base de datos de composición

Grado de Ejemplos Principal uso de

fuente los datos
Mercadería a Carcasas de carne, consignación
granel de granos, frutas, contenedores
Estadística de declaración de
Mercadería y Carcasas de carne, cajas de desaparición de alimentos
alimentos alimento a granel, a menudo para
al por mayor uso institucional
Alimentos al por Alimentos tal como se venden al
menor consumidor Estadísticas de consumo en el
hogar; medida de la ingesta
Producción del Alimentos cultivados para el individual
campo o huerto consumo de la familia
Alimentos como Alimentos igual como Medición de la
se consumen se consumen ingesta individual

Alimentos del campo o huerto

En el campo o zonas rurales representan la mayoría de la colección para análisis

porque se supone, constituyen parte significativa de la dieta. Sin embargo, en países
industrializados, el consumo de alimentos directos del campo o huerto es
prácticamente nulo y debe ignorarse en el muestreo. Si los alimentos cultivados en el
hogar constituyen más del 10% del consumo total de alimentos, deben incluirse en
colecciones de muestras representativas.

Alimentos tal como se consumen

Corresponde a aquellos que se preparan para su consumo. A menudo son mezcla de

alimentos y su composición es muy variable porque también considera los
procedimientos culinarios (ejemplo: cocción). Es muy difícil tener muestras represen-
tativas y es por eso que su frecuencia de análisis es mínima. Es más fácil en el caso de
comidas institucionales, como casinos, hospitales, comedores escolares.

NÚMERO Y TAMAÑO DE UNIDADES DE MUESTREO

Existe una estrecha relación entre el número de unidades que constituyen la muestra y
su representatividad.

Número

El número de unidades coleccionadas para una muestra única (con su duplicado) o

para una muestra compuesta influye notoriamente en la representatividad. El número
coleccionado debe reflejar la variabilidad en la composición, es decir, más muestras
coleccionadas a mayor variabilidad, aunque en general es intuitivo, porque el grado de
varianza de un nutriente es desconocido la mayoría de las veces.

Como regla general, en alimentos preparados se deben tomar por lo menos 10

unidades, cada uno proveniente de compras separadas o colecciones diferentes. Si el
alimento procesado está sujeto a una formulación consistente y con estricto control de
ingredientes y producto final, este número se puede reducir. ' En EE.UU. las
regulaciones de etiquetado requieren el análisis de una muestra compuesta, formada
por 12 unidades seleccionadas al azar de un lote de producción.

Tamaño

Si se van a realizar 10 o más repeticiones de muestra se debe colectar entre 50 y 500 g

por muestra y más cercano a 500 si el contenido del nutriente a analizar es pequeño.

COLECCION, MANEJO Y TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS

La composición de un alimento puede variar si hay ataque de origen biológico ya sea

externo (microorganismos) o internos (enzimas).

Además factores ambientales (calor, luz, oxígeno, humedad, contramuestras,

catalizadores) pueden también variar la composición.

Por tal motivo la colección debe considerar:

a. Rapidez para minimizar las pérdidas de nutrientes a niveles usuales por

mercadeo y manejo en el hogar.
b. Conservación de nutrientes, se incluye el agua, mediante almacenamiento y
manipulación adecuada cuando las demoras son inevitables.
c. Impedir daño, pérdidas y contusión con otros alimentos en la misma colección.

Áreas de colección ultramar, regional o remota

Se deben respetar las regulaciones de cuarentena, conseguir permisos especiales y

proceder a destruir o esterilizar las muestras después del análisis para cumplir con las
exigencias de la cuarentena.

Para la disminución del peso del envío de muestras es posible proceder a cuarteos,
secado u otros.

La recolección de muestras regionales es más simple, porque se puede recurrir a

organizaciones locales para coleccionar y empacar muestras para transporte aéreo o
terrestre o bien enviar personal del laboratorio para la recolección y traslado al
laboratorio.

A veces es necesario envasar al vacío, en envase que no se quiebre y sellado

herméticamente (se podrían usar bolsas de polietileno con espacio de cabeza mínimo
y termosellados). Luego el transporte se efectúa envasando en cajas con hielo seco. Si
se analizan vitaminas los alimentos deben protegerse de la luz.

Otro método aceptable es el uso de ácido metafosfórico, si se desea analizar vitamina

C, o bien solución buffer ascorbato para análisis de folato.

Debe programarse con el laboratorio el despacho de muestras congeladas, en todo

caso, si llegan alimentos descongelados al laboratorio se debe controlar la
temperatura y descartar la muestra en caso necesario.

Colección local

Se debe considerar el costo, personal disponible y el número de alimentos a manipular

en cada colección y los instrumentos de muestreo.

Etiquetado

Es muy importante que sea legible, permanente en todas las etapas desde la colección
al análisis. No usar lápices de cera, marcadores solubles al agua, lapiceras o lápices.

Procedimientos escritos de muestreo

Los procedimientos para la manipulación, almacenamiento y tratamiento de las

muestras deben describirse totalmente en el manual de calidad del laboratorio o en el
manual de muestreo específico. Nunca se debe analizar una muestra si el muestreo no
está descrito o hay dudas acerca de su identidad.

Identificación

Muchas veces se requiere identificación científica y para ello debe contactarse a un

especialista. El uso de fotografías o un dibujo del alimento puede usarse para
identificación y registro permanente de la muestra.

Nomenclatura y descripción del alimento

Debe registrarse información local del nombre dado al alimento en todos los
lenguajes usados en el país. La descripción de alimentos preparados debe incluir la lista
de ingredientes. Debe describirse la parte del animal o planta usado, su madurez y
calidad, procedimiento usado, si es importado es necesario anotar el país de origen.

Registro de colección
Al llegar al laboratorio debe efectuarse un completo registro de datos de la colección,
para cada alimento.

Un formato sugerido para una hoja de registro de la muestra de alimento incluye:

fecha, tipo de salida, tipo de envase, nombre, número de lote, su uso, listado de
ingredientes, cantidad de contenido, hechos inesperados y estado durante la compra,
tamaño de la porción, considerando lo recomendado en la etiqueta.

ACONDICIONADO Y TRANSPORTE DE LA MUESTRA

Para análisis físico-químicos

El acondicionamiento de las muestras dependerá del objetivo del muestreo. En
general, puede ser necesario acondicionarlas con conservadores de frío, ya que
algunas especies químicas (nitratos, nitritos y en menor medida los sulfatos) pueden
sufrir transformaciones por acción microbiana. También deben mantenerse al
resguardo de la luz, procurando enviarlas lo más rápido posible al laboratorio. Una
buena opción, si no se dispone de conservadora con hielo, es tener las muestras en el
interior de los vehículos con aire acondicionado hasta que se las lleva al Laboratorio o
a algún medio de refrigeración adecuado (heladera). Si no se refrigera puede haber
variación del pH por alteración de CO3 = y CO3H - . No es significativa si hay poca
materia orgánica. Es importante medir pH “in situ”. Recordar que un pH mayor o igual
a 8,3 indica presencia de CO3 = Los demás no tienen problemas. El As puede tener un
proceso de metilación por acción bacteriana y tener un valor ligeramente menor en el
resultado del análisis si se analiza con un método colorimétrico, pero no tiene este
inconveniente si se analiza por horno de grafito. En todos los casos conviene acidificar
la muestra con un pH muy bajo para evitar esos inconvenientes. Si se transporta en un
vehículo, con aire acondicionado no hay problemas si no pasa más de un día, salvo que
sea una muestra muy cargada de bacterias y materia orgánica (pero esto nunca es
conveniente que suceda en ningún caso).

Para análisis microbiológico

Es indispensable que la muestra se mantenga refrigerada hasta su arribo al laboratorio,
ya que tanto las temperaturas mayores a 6ºC como la luz provocan la multiplicación de
los microorganismos e invalidan la muestra dado que los resultados no reflejarán la
realidad. Siempre es conveniente tomar la muestra y transportarla los primeros días de
la semana (hasta el miércoles en lo posible, sino consensuar previamente con el
Personal del Laboratorio), previendo feriados o días no laborables, ya que, si se
requiriera análisis microbiológico, una vez en el Laboratorio son necesarias por los
menos 48 hs. para realizar los cultivos.
En caso de demorarse el envío, se guarda en la heladera en la parte de abajo, pero no
es conveniente que pase más de dos (2) días. En cualquier caso debe evitarse el
congelamiento de la muestra (el lugar correcto para conservar las muestras que no se
hayan podido entregar al laboratorio es en la parte inferior de una heladera común).
En resumen, tres (3) cosas afectan a los organismos vivos en una muestra para análisis
microbiológico:
− las temperaturas por arriba de los 6°C
− la luminosidad
− las temperaturas de congelamiento.
Las dos primeras cosas hacen que esos organismos se multipliquen y la muestra no sea
válida y de resultados que no reflejen la realidad. La tercera hace que se mueran y de
un resultado de no contaminación cuando sí puede haberla. Las muestras para análisis
microbiológico se deberán efectuar de manera separada a las destinadas para análisis
físico-químico, tanto en el tipo de recipiente, como en su conservación y en el tiempo
de envío a Laboratorio. Hay que guardar las muestras para análisis microbiológico en
un ambiente lo más limpio posible. La limpieza de los vehículos es importante para
evitar problemas de contaminación. Nunca hay que exponer las muestras al sol,
guardarlas en lugar fresco y trasladarlas sin demoras al Laboratorio, si es posible el
mismo día del muestreo asegurando la correcta identificación de las muestras.

CALCULO DEL TAMAÑO DE LA MUESTRA

Si no se conoce nada acerca de la población, podemos fijar un valor cualquiera para el

número de elementos de la muestra, sea este n´, apliquemos la siguiente fórmula:3

a. Con una muestra de tamaño n1 calculado encontramos la media y la varianza

s2 muestrales y de aquí pasaremos a aplicar la fórmula dada en el inciso b) para
el cálculo de n. Se tienen entonces los valores n´, n1 y n de la fórmula.
 o Se sigue el siguiente algoritmo:

 Si n1 > n se trabaja con los valores de media y desviación

estándar calculados con n1, se tiene una muestra mayor a la
necesaria, pero es significativa.

 Si n1 < n entonces se tiene que ir a completar la muestra con los

n-n1 elementos restantes para que la muestra sea significativa.

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