Une-En Iso 94082000 Dbo5

norma UNE-EN ISO 9408
española
Mayo 2000
TÍTULO Calidad del agua
Evaluación de la biodegradabilidad aerobia final de los

compuestos orgánicos en medio acuoso mediante la
determinación de la demanda de oxígeno en un respirómetro
cerrado
(ISO 9408:1999)
Water quality. Evaluation of ultimate aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium
by determination of oxygen demand in a closed respirometer. (ISO 9408:1999)
Qualité de l'eau. Evaluation de la biodégradabilité aérobie ultime des composés organiques, en milieu
aqueux, par détermination de la demande on oxygène dans un respiromètre fermé. (ISO 9408:1999)
CORRESPONDENCIA Esta norma es la versión oficial, en español, de la Norma Europea EN ISO 9408 de
agosto 1999, que a su vez adopta íntegramente la Norma Internacional
ISO 9408:1999.
OBSERVACIONES Esta norma anula y sustituye a la Norma UNE-EN 29408 de junio 1995.
ANTECEDENTES Esta norma ha sido elaborada por el comité técnico AEN/CTN 77 Medio Ambiente
cuya Secretaría desempeña AENOR.
Editada e impresa por AENOR LAS OBSERVACIONES A ESTE DOCUMENTO HAN DE DIRIGIRSE A:
Depósito legal: M 19483:2000
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Reproducción prohibida 28004 MADRID-España Fax 91 310 40 32
AENOR AUTORIZA EL USO DE ESTE DOCUMENTO A LABORATORIS VIDAL SL

S

NORMA EUROPEA
EUROPEAN STANDARD EN ISO 9408
NORME EUROPÉENNE
EUROPÄISCHE NORM Agosto 1999
ICS 13.060.00 Sustituye a EN 29408:1993
Versión en español
Calidad del agua

Evaluación de la biodegradabilidad aerobia final de los compuestos orgánicos
en medio acuoso mediante la determinación de la demanda de oxígeno
en un respirómetro cerrado
(ISO 9408:1999)
Water quality. Evaluation of ultimate Qualité de l'eau. Evaluation de la Wasserbeschaffenheit. Bestimmung der
aerobic biodegradability of organic biodégradabilité aérobie ultime des vollständigen aeroben biologischen
compounds in aqueous medium by composés organiques, en milieu aqueux, Abbaubarkeit organischer Stoffe im
determination of oxygen demand in a par détermination de la demande on wäβrigen Medium über die Bestimmung
closed respirometer. oxygène dans un respiromètre fermé. des Sauerstoffbedarfs in einem
(ISO 9408:1999) (ISO 9408:1999) geschlossenen Respirometer.
(ISO 9408:1999)
Esta norma europea ha sido aprobada por CEN el 1999-08-01. Los miembros de CEN están sometidos al Reglamento
Interior de CEN/CENELEC que define las condiciones dentro de las cuales debe adoptarse, sin modificación, la norma
europea como norma nacional.
Las correspondientes listas actualizadas y las referencias bibliográficas relativas a estas normas nacionales, pueden
obtenerse en la Secretaría Central de CEN, o a través de sus miembros.
Esta norma europea existe en tres versiones oficiales (alemán, francés e inglés). Una versión en otra lengua realizada
bajo la responsabilidad de un miembro de CEN en su idioma nacional, y notificada a la Secretaría Central, tiene el
mismo rango que aquéllas.
Los miembros de CEN son los organismos nacionales de normalización de los países siguientes: Alemania, Austria,
Bélgica, Dinamarca, España, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda, Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega, Países Bajos,
Portugal, Reino Unido, República Checa, Suecia y Suiza.
CEN
COMITÉ EUROPEO DE NORMALIZACIÓN
European Committee for Standardization
Comité Européen de Normalisation
Europäisches Komitee für Normung
SECRETARÍA CENTRAL: Rue de Stassart, 36 B-1050 Bruxelles
 1999 Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

EN ISO 9408:1999 -4-
ANTECEDENTES
El texto de la Norma Internacional ISO 9408:1999 ha sido elaborado por el Comité Técnico ISO/TC 147
"Calidad del agua " en colaboración con el Comité Técnico CEN/TC 230 "Análisis del agua", cuya Secretaría
está desempeñada por DIN.
Esta norma sustituye a la Norma EN 29408:1993.
Esta norma europea deberá recibir el rango de norma nacional mediante la publicación de un texto idéntico a
la misma o mediante ratificación antes de finales de febrero de 2000, y todas las normas nacionales
técnicamente divergentes deberán anularse antes de finales de febrero de 2000.
De acuerdo con el Reglamento Interior de CEN/CENELEC, los siguientes países están obligados a adoptar
esta norma europea: Alemania, Austria, Bélgica, Dinamarca, España, Finlandia, Francia, Grecia, Irlanda,
Islandia, Italia, Luxemburgo, Noruega, Países Bajos, Portugal, Reino Unido, República Checa, Suecia y
Suiza.
NOTA DE CEN/CS: Los antecedentes son susceptibles de modificación cuando se reciba la versión
alemana. Los antecedentes confirmados o modificados, y si procede, el anexo ZA normativo para las
referencias a publicaciones internacionales con sus publicaciones europeas correspondientes se harán circular
con la versión alemana.
DECLARACIÓN
El texto de la Norma Internacional ISO 9408:1999 ha sido aprobado por CEN como norma europea sin
ninguna modificación.

-5- ISO 9408:1999
ÍNDICE
Página
1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ............................................................................ 6
2 TÉRMINOS Y DEFINICIONES.......................................................................................... 6
3 FUNDAMENTO .................................................................................................................... 7
4 CONDICIONES AMBIENTALES DEL ENSAYO............................................................ 8
5 REACTIVOS ......................................................................................................................... 8
6 APARATOS ........................................................................................................................... 9
7 PROCEDIMIENTO .............................................................................................................. 10
8 CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS...................................................... 13
9 VALIDEZ DE LOS RESULTADOS.................................................................................... 15
10 INFORME DE ENSAYO...................................................................................................... 15
ANEXO A (Informativo) EJEMPLO DEL CÁLCULO DE LA DEMANDA

TEÓRICA DE OXIGENO .................................................................. 17
ANEXO B (Informativo) CORRECCIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO PARA

ELIMINAR LA INTERFERENCIA CON EL PROCESO
DE NITRIFICACIÓN ......................................................................... 18
ANEXO C (Informativo) EJEMPLO DE UNA CURVA DE BIODEGRADACIÓN................ 20
ANEXO D (Informativo) RESPIRÓMETRO CERRADO.......................................................... 21
BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................................... 22

ISO 9408:1999 -6-
PRECAUCIÓN − Los lodos activados y las aguas residuales contienen organismos potencialmente patógenos.
Deben tomarse las precauciones adecuadas para su manipulación. Los compuestos de ensayo tóxicos y aquellos
de los que se desconocen sus propiedades, deben manipularse con precaución.
1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

Esta norma internacional especifica un método para la evaluación, en medio acuoso, de la biodegradabilidad final de los
compuestos orgánicos y de las aguas residuales a una concentración dada, bajo la acción de microorganismos aerobios,
mediante la determinación de la demanda oxígeno en un respirómetro cerrado.
El método es aplicable a los compuestos orgánicos que:
a) sean solubles en agua en las condiciones de ensayo;
b) sean poco solubles en agua en las condiciones de ensayo, en cuyo caso puede resultar necesario poner en práctica
medidas que garanticen una buena dispersión del compuesto (véase, por ejemplo, la Norma ISO 10634);
c) no estén en contacto ni reaccionen con el absorbente de CO2;
d) sean volátiles, siempre y cuando se utilice un respirómetro adecuado o se den las condiciones apropiadas (por
ejemplo, una relación más pequeña entre el volumen de espacio de cabeza y el volumen del medio líquido);
e) no tengan un efecto inhibidor sobre los microorganismos de ensayo a los niveles de concentración seleccionados
para el ensayo. La presencia de efectos inhibidores se puede determinar conforme a lo especificado en el apartado
7.3, o mediante la utilización de cualquier otro método para determinar el efecto inhibidor que un compuesto ejerce
sobre las bacterias (véase, por ejemplo, la Norma ISO 8192).
NOTA − Las condiciones que se describen en esta norma internacional no siempre corresponden a las condiciones óptimas que permiten la
obtención del máximo grado de biodegradación. Otros métodos de biodegradación se indican en la Norma ISO 15462.
2 TÉRMINOS Y DEFINICIONES
Para los fines de esta norma internacional, son de aplicación las siguientes definiciones:
2.1 biodegradación aerobia final: Descomposición de un compuesto químico o de materia orgánica en dióxido de
carbono, agua y sales minerales de cualquier otro elemento presente (mineralización), con producción de nueva
biomasa, por acción de microorganismos y en presencia de oxígeno.
2.2 biodegradación primaria: Modificación estructural (transformación) de un compuesto químico por acción de
microorganismos, que produce la pérdida de una propiedad específica.
2.3 lodo activado: Biomasa producida en el tratamiento aerobio de las aguas residuales por el crecimiento de las
bacterias y de otros microorganismos en presencia de oxígeno disuelto.
2.4 concentración de sólidos en suspensión de un lodo activado: Cantidad de sólidos obtenidos por filtración o
centrifugación de un volumen conocido de lodo activado y secado a una temperatura de aproximadamente 105 ºC, hasta
masa constante
2.5 demanda bioquímica de oxígeno (DBO): Concentración másica de oxígeno disuelto consumido, en condiciones
definidas, por la oxidación biológica aerobia de un compuesto químico o de la materia orgánica presente en el agua.
NOTA − La DBO se expresa, en este caso, como miligramos de oxígeno consumido por miligramo (o gramo) de compuesto de ensayo.

-7- ISO 9408:1999
2.6 demanda química de oxígeno (DQO): Concentración másica de oxígeno equivalente a la cantidad de un oxidante
específico consumido por un compuesto químico, o por la materia orgánica, cuando una muestra de agua se trata con
dicho oxidante bajo condiciones definidas.
NOTA − La DQO se expresa en este caso como miligramos de oxígeno requeridos por miligramo (o gramo) de compuesto de ensayo.
2.7 demanda teórica de oxígeno (DTO): Cantidad máxima teórica de oxígeno necesaria para oxidar completamente
un compuesto químico, calculada a partir de su fórmula molecular
NOTA − La DTO se expresa en este caso como miligramos de oxígeno necesarios por miligramo (o gramo) de compuesto de ensayo.
2.8 carbono orgánico disuelto (COD): Fracción del carbono orgánico presente en el agua que no puede eliminarse
por el método de separación de fases especificado.
NOTA − Un método de separación de fases especificado puede ser, por ejemplo, la centrifugación a 40 000 m.s-2 durante 15 min, o la filtración a
través de una membrana con un diámetro de poro de 0,2 µm a 0,45 µm.
2.9 fase de latencia: Período de tiempo transcurrido desde el inicio de un ensayo hasta el momento en el que se
consigue la adaptación y/o la selección de los microorganismos responsables de la degradación y en el que la tasa de
biodegradación de un compuesto químico o de la materia orgánica ha aumentado hasta un 10% aproximadamente del
nivel máximo de biodegradación.
NOTA − La fase de latencia de expresa en días.
2.10 nivel máximo de biodegradación: Tasa máxima de biodegradación de un compuesto químico o de la materia
orgánica en un ensayo, por encima de la cual no tiene lugar biodegradación alguna en el transcurso del ensayo.
NOTA − El nivel máximo de degradación se expresa como porcentaje.
2.11 fase de biodegradación: Período de tiempo transcurrido desde el final de la fase de latencia de un ensayo hasta
el momento en el que se alcanza el 90% del nivel máximo de degradación
NOTA − La fase de biodegradación se expresa en días.
2.12 fase de meseta: Período de tiempo transcurrido desde el final de la fase de biodegradación hasta el final del
ensayo
NOTA − La fase de meseta se expresa en días.
2.13 pre-exposición: Preincubación del inóculo en presencia del compuesto químico de ensayo o de la materia
orgánica, con el fin de aumentar la capacidad de dicho inóculo para biodegradar el material de ensayo, por adaptación
y/o selección de los microorganismos.
2.14 pre-acondicionamiento: Preincubación del inóculo en las condiciones de ensayo, pero en ausencia del
compuesto químico de ensayo o de la materia orgánica, con el fin de mejorar la eficacia del ensayo, por aclimatación de
los microorganismos a las condiciones de ensayo.
3 FUNDAMENTO
Determinación de la biodegradación de los compuestos orgánicos por microorganismos aerobios en un medio de ensayo
acuoso estático. En el contexto de esta norma internacional, las aguas residuales están incluidas dentro de los
compuestos orgánicos. La mezcla para el ensayo contiene un medio inorgánico, el compuesto orgánico como única
fuente de carbono y energía a una concentración generalmente de 100 mg/l de carbono orgánico [pero su demanda
teórica de oxígeno (DTO) debe ser de al menos 100 mg/l], y un inóculo mixto procedente de una planta de tratamiento
de aguas residuales o de cualquier otro origen medioambiental.

ISO 9408:1999 -8-
La mezcla se agita dentro de un recipiente de ensayo cerrado y se determina el consumo de oxígeno bien por medición
de la cantidad de oxígeno necesaria para mantener un volumen constante de gas en el respirómetro o bien midiendo el
cambio de volumen o de presión (o una combinación de ambos) en el equipo. El dióxido de carbono que se libera se
absorbe con una sustancia adecuada en el interior del recipiente de ensayo.
Se realiza el seguimiento de la degradación durante un período de 28 días, o más si fuera necesario, mediante la
determinación automática o manual del consumo de oxígeno. La cantidad de oxígeno consumida por el compuesto
orgánico (después de realizada la corrección por comparación con el ensayo en blanco) se expresa como porcentaje de
la demanda teórica de oxígeno (DTO) calculada a partir de la fórmula del compuesto, o bien como porcentaje de la
demanda química de oxígeno (DQO).
Para los compuestos suficientemente solubles en agua, es posible determinar (opcionalmente) la eliminación de carbono
orgánico disuelto (COD) midiendo la concentración de COD al principio y al final de la incubación, con el fin de
obtener información adicional relativa a la biodegradación final. Puede obtenerse información acerca de la
biodegradación primaria siempre que se disponga de un método analítico específico para la sustancia.
4 CONDICIONES AMBIENTALES DEL ENSAYO
La incubación debe realizarse en la oscuridad o con iluminación difusa, a una temperatura que se encuentre en el
intervalo comprendido entre 20 ºC y 25 ºC y que no varíe en más de ± 1 ºC durante el ensayo.
5 REACTIVOS
Deben utilizarse únicamente reactivos de calidad analítica reconocida.
5.1 Agua
Agua destilada o desionizada cuyo contenido en COD sea inferior a 1 mg/l.
5.2 Medio de ensayo
5.2.1 Composición
5.2.1.1 Solución a). Se disuelven:
dihidrógenofosfato de potasio anhidro (KH2PO4) 8,5 g
hidrógeno fosfato de dipotasio anhidro (K2HPO4) 21,75 g
hidrógeno fosfato de disodio dihidratado (Na2HPO4.2H2O) 33,4 g
cloruro de amonio (NH4Cl) 0,5 g
agua (5.1), en la cantidad necesaria para enrasar a 1 000 ml
Con objeto de controlar esta solución tampón, es recomendable medir el pH, que debe tener un valor aproximado de
7,4. En caso contrario debe prepararse una nueva solución.
5.2.1.2 Solución b). Se disuelven 22,5 g de sulfato de magnesio heptahidratado (MgSO4.7H2O) en agua (5.1) y se
enrasa a 1000 ml.
5.2.1.3 Solución c). Se disuelven 36,4 g de cloruro de calcio dihidratado (CaCl2.2H2O) en agua (5.1) y se enrasa a
1 000 ml.

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5.2.1.4 Solución d). Se disuelven 0,25 g de cloruro de hierro (III) hexahidratado (FeCl3.6H2O) en agua (5.1) y se
enrasa a 1 000 ml. La solución se prepara inmediatamente antes de su utilización, o se añade una gota de ácido
clorhídrico concentrado (HCl) para evitar la formación de precipitados.
5.2.2 Preparación del medio de ensayo. Para preparar 1 000 ml de medio de ensayo se añaden, a unos 800 ml de
agua (5.1):
− 10 ml de la solución a);
− 1 ml de cada una de las soluciones b), c) y d).
Se enrasa a 1 000 ml con agua (5.1). El medio de ensayo debe prepararse inmediatamente antes de su utilización. Las
soluciones a), b) y c) pueden conservarse hasta 6 meses, en la oscuridad y a temperatura ambiente.
5.3 Absorbente del dióxido de carbono

Solución de hidróxido de potasio (aproximadamente 10 mol/l), carbonato de sodio granulado o cualquier otro
absorbente adecuado.
5.4 Solución de cloruro de mercurio

Se disuelve 1 g de cloruro de mercurio (II) (HgCl2) en 100 ml de agua (5.1).
5.5 Solución de hidróxido de sodio

Se disuelve hidróxido de sodio (NaOH) en agua (5.1) para obtener una solución con una concentración entre 0,1 mol/l y
0,5 mol/l.
5.6 Solución de ácido clorhídrico

Se diluye ácido clorhídrico concentrado (HCl) en agua (5.1) para obtener una solución con una concentración entre
0,1 mol/l y 0,5 mol/l.
6 APARATOS
Es necesario asegurarse de que todo el material de vidrio ha sido limpiado cuidadosamente y que se encuentra exento de
cualquier sustancia orgánica o tóxica.
6.1 Respirómetro cerrado

El anexo D describe el principio de funcionamiento de un respirómetro cerrado. El respirómetro contiene los recipientes
de ensayo que permiten el suministro de oxígeno, aporta la agitación, e incluye los tubos impermeables al oxígeno y al
dióxido de carbono. Los recipientes del respirómetro se conservan en un recinto que esté a temperatura constante o en
un baño de agua termostatizado. Cuando se realizan ensayos sobre compuestos volátiles, deben utilizarse aparatos
específicos apropiados o adaptados a esta utilización particular. Deben tomarse las medidas adecuadas para evitar
pérdidas de compuesto a causa del aparato.
6.2 Baño de agua o recinto termostatizado (para satisfacer los requerimientos del capítulo 4).
6.3 Equipo para la determinación del carbono orgánico disuelto

Instrumento de sensibilidad suficiente para la medida del carbono orgánico disuelto (COD) (opcional).

ISO 9408:1999 - 10 -
6.4 Dispositivo para la determinación de la demanda química de oxígeno (DQO) (opcional)
6.5 Centrífuga o sistema de filtración

La centrífuga debe ser capaz de producir una aceleración de 4 000 g.
El sistema de filtración debe estar equipado con filtros de membrana (de diámetro nominal de poro de 0,2 µm a
0,45 µm), que no absorban ni liberen carbono orgánico.
6.6 pH-metro (equipo corriente de laboratorio).
7 PROCEDIMIENTO
7.1 Preparación de las soluciones de ensayo
7.1.1 Compuesto de ensayo. Se prepara una solución madre de un compuesto de ensayo suficientemente soluble en
agua, en el medio de ensayo (5.2) y se añade una cantidad adecuada de esta solución a los recipientes de ensayo de
modo que se obtenga una concentración másica final de 100 mg/l del compuesto de ensayo, equivalente como mínimo a
una demanda teórica de oxígeno (DTO) de 100 mg/l. En función de las propiedades del compuesto de ensayo (por
ejemplo, la toxicidad) y del objetivo del ensayo, pueden utilizarse otras concentraciones. Los compuestos poco solubles
se añaden directamente en los recipientes de ensayo. Se determina la cantidad añadida con exactitud. Se determina, si
fuera necesario, la DQO del compuesto de ensayo conforme, por ejemplo, a la Norma ISO 6060.
NOTA − Véase la Norma ISO 10634 para más detalles relativos a la manipulación de compuestos débilmente solubles en agua.
7.1.2 Solución del compuesto de referencia. Se utiliza como compuesto de referencia un compuesto orgánico de
biodegradabilidad conocida, como por ejemplo anilina o benzoato de sodio, que tienen tasas de degradación > 60%. Se
prepara una solución madre del compuesto de referencia en el medio de ensayo (5.2), de la misma forma que se hace
para el caso del compuesto de ensayo soluble en agua (7.1.1), con objeto de obtener una concentración másica final de
100 mg de compuesto de referencia por litro de medio de ensayo.
7.1.3 Solución de control de la inhibición. Si fuera necesario (por ejemplo, cuando no se dispone de información
acerca de la toxicidad del compuesto de ensayo), se prepara una solución que contenga, en el medio de ensayo (5.2), a
la vez el compuesto de ensayo (7.1.1) y el compuesto de referencia (7.1.2), preferiblemente con unas concentraciones
de 100 mg/l de cada uno de ellos.
7.2 Preparación del inóculo
7.2.1 Generalidades. Se prepara el inóculo utilizando preferiblemente un lodo activado procedente de las fuentes
siguientes (7.2.2 a 7.2.4) o una mezcla de dichas fuentes, de modo que se obtenga una población microbiana que
presente una suficiente actividad de biodegradación. Se controla la actividad del inóculo a través del compuesto de
referencia (7.1.2 y capítulo 9). La DBO del blanco debe satisfacer las exigencias del criterio de validez (véase el
capítulo 9). Para reducir la influencia del blanco, puede resultar de utilidad realizar un pre-acondicionamiento del
inóculo, por ejemplo aireándolo durante una semana antes de su utilización. Debe utilizarse un volumen adecuado para
la inoculación.
NOTA − Con objeto de permitir una predicción general del comportamiento de degradación en el medio ambiente, generalmente no es conveniente
realizar una pre-exposición del inóculo al compuesto de ensayo. No obstante, en ciertas circunstancias y según el propósito del ensayo,
puede realizarse una pre-exposición del inóculo, siempre que este hecho se especifique claramente en el informe de ensayo (por ejemplo,
porcentaje de biodegradación = x %, utilizando un inóculo pre-expuesto) y a condición de que el método de pre-exposición se detalle en el
informe de ensayo. Los inóculos pre-expuestos pueden obtenerse a partir de ensayos de biodegradación en laboratorio, efectuados en
diferentes condiciones (por ejemplo, ensayo de Zahn-Wellens conforme a la Norma ISO 9888 y el ensayo SCAS según la Norma
ISO 9887) o a partir de muestras recogidas de lugares en los que se dan circunstancias ambientales particulares (por ejemplo, plantas
depuradoras que tratan compuestos similares o zonas contaminadas).

- 11 - ISO 9408:1999
Basándose en la experiencia, un "volumen adecuado" es aquel:
− que permite obtener una población que ofrece suficiente actividad de biodegradación;
− que degrada el compuesto de referencia en el porcentaje estipulado (véase el capítulo 9);
− que proporciona entre 103 y 106 unidades formadoras de colonias por mililitro en la mezcla final;
− que no proporciona más del equivalente a 30 mg/l de sólidos en suspensión de lodo activado en la mezcla final;
− que la cantidad de carbono orgánico disuelto aportado por el inóculo sea preferentemente menor al 10% de la
concentración inicial de carbono orgánico introducida por el compuesto de ensayo.
Generalmente, son suficientes de 1 ml a 10 ml de inóculo por cada 1 000 ml de solución de ensayo.
7.2.2 Inóculo procedente de planta de tratamiento con lodos activados. Se toma una muestra de lodo activado de
un tanque de aireación de una planta de tratamiento de aguas residuales, o de una planta piloto de laboratorio, que trate
predominantemente aguas de origen urbano. Se mezcla bien y se determina la concentración de sólidos en suspensión
del lodo activado (utilizando, por ejemplo, la Norma ISO 11293). Si fuera necesario, se concentra el lodo por
decantación, de manera que el volumen de lodo añadido en el ensayo sea mínimo, pero que cumpla en cualquier caso
los criterios indicados en 7.2.1. Si se sospecha la presencia de sustancias inhibidoras en el lodo, se centrifuga, se lava
con medio de ensayo (5.2), se vuelve a centrifugar y se suspende nuevamente en el medio de ensayo. La muestra debe
mantenerse en condiciones aerobias y es preferible utilizarla el mismo día de su toma. Debe utilizarse un volumen
adecuado (véase 7.2.1) como para obtener una concentración de 30 mg/l de sólidos en suspensión en la mezcla final.
7.2.3 Inóculo de agua residual. Se toma una muestra del influente o del efluente de una planta de tratamiento de
aguas residuales, o de una planta piloto de laboratorio, que trate predominantemente aguas de origen urbano. Si fuera
necesario, se concentra la muestra por filtración o centrifugación. Se mezcla bien. La muestra debe mantenerse en
condiciones aerobias y es preferible utilizarla el mismo día de su toma. Antes de su utilización, se deja decantar la
muestra durante 1 h y se toma un volumen adecuado del sobrenadante para la inoculación.
7.2.4 Inóculo procedente de aguas superficiales. Se toma una muestra de un agua superficial adecuada. Si fuera
necesario, se concentra la muestra por filtración o centrifugación. La muestra debe mantenerse en condiciones aerobias
y es preferible utilizarla el mismo día de su toma. Se utiliza un volumen adecuado como inóculo.
7.3 Ensayo
Se instala el respirómetro (véase 6.1 y el ejemplo que se describe en el anexo D). Se prepara un número suficiente de
recipientes de ensayo con el fin de disponer de:
− al menos 2 recipientes de ensayo (símbolo FT) que contengan el compuesto de ensayo (7.1.1);
− al menos 2 recipientes para el ensayo en blanco (símbolo FB) que contengan el medio de ensayo y el inóculo;
− al menos 1 recipiente destinado al control del procedimiento (símbolo FC) que contenga el compuesto de referencia
(7.1.2);
− si fuera necesario, 1 recipiente (símbolo FI) destinado a verificar un posible efecto inhibidor del compuesto de
ensayo, que contenga la solución (7.1.3);
− si fuera necesario, 1 recipiente (símbolo FS) para verificar la posible degradación abiótica, que contenga el
compuesto de ensayo (7.1.1) pero no el inóculo, esterilizado por adición de un compuesto inorgánico tóxico
apropiado que inhiba la actividad microbiana. Se utiliza, por ejemplo, 1 ml/l de una solución de cloruro de mercurio
(II) (5.4). Si fuera necesario, se añade la misma cantidad de sustancia tóxica dos semanas después del inicio del
ensayo.

ISO 9408:1999 - 12 -
Se añaden, en los recipientes de ensayo respectivos conforme a la Tabla 1, las cantidades apropiadas de medio de
ensayo (5.2), de inóculo (7.2), de compuesto de ensayo (7.1.1) y de compuesto de referencia (7.1.2), a las
concentraciones adecuadas para obtener el volumen final de ensayo deseado. Se añade el absorbente (5.3) en los
compartimentos de absorción de CO2 de los recipientes. Se mide el valor del pH del contenido de los recipientes y, si es
necesario, se ajusta a 7,4 con ayuda de las soluciones 5.5 ó 5.6.
Tabla 1
Distribución final de los compuestos de ensayo y de referencia en los recipientes de ensayo
Medio de ensayo Compuesto Compuesto Inóculo

Recipiente de ensayo de referencia
(5.2) (7.1.1) (7.1.2) (7.2)
FT compuesto de ensayo + + − +
FT compuesto de ensayo + + − +
FB ensayo en blanco + − − +
FB ensayo en blanco + − − +
FC control del inóculo + − + +
FI control de inhibición (opcional) + + + +
FS control de la degradación abiótica + + − −
(opcional)
Se colocan todos los recipientes de ensayo en el baño de agua o en el recinto termostatizado (6.2), se espera hasta que
todos los recipientes alcancen la temperatura deseada (véase el capítulo 4), se cierran herméticamente y, en los casos en
los que se utilicen respirómetros automáticos, se hacen las conexiones pertinentes, y se acciona el agitador. Se efectúan
las lecturas de demanda bioquímica de oxígeno (consumo de oxígeno) en los manómetros (en caso de que sean
manuales) o se verifica el correcto funcionamiento del dispositivo de registro del respirómetro automático. Debe
seguirse el método indicado por el fabricante para el tipo correspondiente de respirómetro.
Cuando el nivel de consumo de oxígeno se estabiliza (fase de meseta) y no es previsible ninguna biodegradación
suplementaria, se considera finalizado el ensayo. Generalmente la duración máxima del ensayo no debe exceder los
28 d. El ensayo se prolonga por espacio de una o dos semanas si la degradación ha comenzado de manera patente pero
no se ha alcanzado la fase de meseta.
Se mide el pH el último día del ensayo.
Cuando se controla la concentración de COD, se toman muestras de volumen apropiado de los recipientes de ensayo al
inicio (tiempo 0) y al final (tiempo t) del período de ensayo. Es igualmente posible determinar el valor inicial (tiempo 0)
en un recipiente preparado de forma independiente o calcularlo a partir de la cantidad de compuesto de ensayo añadida.
Las muestras se filtran a través de un filtro de membrana o se centrifugan a 4 000 g durante 15 min (véase 6.5). Cuando
las medidas de COD no se lleven a cabo el mismo día, se conservan las muestras durante un período máximo de 48 h,
en la oscuridad, a una temperatura de 4 ºC y en recipientes herméticamente cerrados.
NOTA − La eliminación de COD puede deberse no solo a la biodegradación sino también a procesos abióticos tales como la adsorción sobre el
inóculo o las paredes del recipiente, o, en el caso de compuestos de ensayo volátiles, por volatilización y adsorción sobre los tubos.
Cuando se trabaje con mezclas, puede producirse una adsorción selectiva de los diferentes componentes.
Cuando se esté controlando la degradación primaria, se determina la concentración del compuesto de ensayo utilizando
análisis específicos, en los recipientes FT y FS al final del ensayo (tiempo t).
Si el compuesto de ensayo contiene nitrógeno, se determina la concentración final de nitrato y nitrito inmediatamente
después de finalizado el ensayo, o bien sobre muestras adecuadamente conservadas. Alternativamente, puede utilizarse
un procedimiento de ensayo cualitativo para el nitrito y el nitrato en un pequeño volumen de mezcla de reacción,
tomado de cada recipiente, poniéndose en práctica después un método cuantitativo únicamente si se obtienen resultados
positivos. Si se ha producido nitrificación, se corrige el consumo de oxígeno (véase el anexo B).

- 13 - ISO 9408:1999
8 CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS
8.1 Cálculo
8.1.1 Demanda bioquímica de oxígeno específica. Los valores de consumo de oxígeno en cada recipiente, obtenidos
a partir de las lecturas del respirómetro, se expresan como demanda bioquímica de oxígeno. Se calcula la demanda
bioquímica de oxígeno específica BS de acuerdo a la ecuación (1). El consumo de oxígeno se corrige en el caso en que
se haya producido nitrificación (véase 7.3 y el anexo B).
Bt − BBt
BS = (1)
ρ TC
donde
BS es la demanda bioquímica de oxígeno específica, en miligramos de oxígeno por gramo de compuesto de ensayo;
Bt es la demanda bioquímica de oxígeno del compuesto de ensayo FT medida a tiempo t, en miligramos por litro;
BBt es la demanda bioquímica de oxígeno del ensayo en blanco FB medida a tiempo t, en miligramos por litro;
ρTC es la concentración del compuesto de ensayo, en gramos por litro.
8.1.2 Porcentaje de biodegradación. La biodegradación se define como la relación entre la demanda bioquímica de
oxígeno específica y la demanda teórica de oxígeno (DTO) (véase el ejemplo de cálculo del anexo A) o la demanda
química de oxígeno (DQO). El porcentaje de degradación en cada recipiente de ensayo se determina mediante las
ecuaciones (2) y/o (3):
BS
DDTO = × 100 (2)
DTO
BS
DDQO = × 100 (3)
DQO
donde
DDTO es el porcentaje de biodegradación de la DTO a tiempo t;
DDQO es el porcentaje de biodegradación de la DQO a tiempo t;
BS es la demanda de oxígeno específica del compuesto de ensayo, expresada en miligramos por gramo de
compuesto de ensayo;
DTO es la demanda teórica de oxígeno, en miligramos por gramo del compuesto de ensayo;
DQO es la demanda química de oxígeno determinada experimentalmente, en miligramos por gramo de compuesto de
ensayo.
NOTA − Dado que la DQO de un compuesto químico rara vez alcanza el valor de la DTO, el porcentaje de degradación de la DQO es generalmente
superior al porcentaje de degradación de la DTO. Este último valor es más preciso y es el que se debe utilizar con preferencia.

ISO 9408:1999 - 14 -
8.1.3 Cálculo de la eliminación del carbono orgánico disuelto. Para la determinación de la eliminación de COD de
un compuesto de ensayo soluble en agua, se calcula para cada recipiente de ensayo FT el porcentaje de eliminación de
carbono orgánico disuelto DC utilizando la ecuación (4):
ρ cTt − ρ cBt × 100

DC = 1 −
ρ cT 0 − ρ cB0 (4)
donde
ρcT0 es la concentración de COD, a tiempo 0, en el recipiente de ensayo FT, en miligramos por litro;
ρcB0 es la concentración de COD, a tiempo 0, en el recipiente de ensayo en blanco FB, en miligramos por litro;
ρcTt es la concentración de COD, a tiempo t, en el recipiente de ensayo FT, en miligramos por litro;
ρcBt es la concentración de COD, a tiempo t, en el recipiente de ensayo en blanco FB, en miligramos por litro;
Si ρcT0 se calcula a partir de la cantidad de compuesto de ensayo añadido, se desprecia ρcB0.
8.1.4 Cálculo de la biodegradación primaria. Cuando se realicen análisis específicos del compuesto de ensayo, se
calcula el porcentaje de biodegradación primaria DS del compuesto de ensayo por comparación con la cantidad de
compuesto de ensayo en el recipiente FS al final del ensayo, utilizando la ecuación (5):
ρS − ρT
DS = × 100 (5)
ρS
donde
ρT es la concentración del compuesto de ensayo en el recipiente FT, a tiempo t, en miligramos por litro;
ρS es la concentración del compuesto de ensayo en el recipiente FS, a tiempo t, en miligramos por litro.
8.1.5 Compuesto de referencia, eliminación abiótica y control de inhibición. Se calcula de la misma forma la tasa
de biodegradación y la eliminación de COD del compuesto de referencia FC y, si estuvieran incluidos en el ensayo, del
control de degradación abiótica FS y del control de inhibición FI.
8.2 Expresión de resultados

Se presentan en forma tabulada los valores medidos de DBO y los porcentajes de biodegradación DDTO y/o DDQO para
cada intervalo de medidas y para cada recipiente de ensayo. En el caso de respirómetros automáticos, pueden
seleccionarse puntos correspondientes a tiempos apropiados a partir de la curva de consumo de oxígeno trazada de
forma automática. Se traza una curva de biodegradación, en porcentaje, en función del tiempo y se indican las fases de
latencia y de degradación. Si se obtienen resultados comparables en los recipientes de ensayo por duplicado FT
(diferencia < 20%) se traza una curva media; en caso contrario, se traza una curva para cada recipiente (véase el
ejemplo descrito en el anexo C). Se traza de la misma forma una curva de biodegradación del compuesto de referencia
FC y, si estuvieran incluidos en el ensayo, del control de degradación abiótica FS y del control de inhibición FI.
Se determina el valor medio del porcentaje de biodegradación en la fase de meseta o se utiliza el valor más alto, por
ejemplo cuando la curva descienda en la fase de meseta, y en el informe de ensayo este nivel máximo de
biodegradación se indica como "tasa de biodegradación del compuesto de ensayo".

- 15 - ISO 9408:1999
La información relativa a la toxicidad del compuesto de ensayo puede resultar de utilidad en la interpretación de los
resultados de ensayo que muestren una baja biodegradación. Si en el recipiente FI el porcentaje de degradación es
inferior al 25% y en los recipientes FT se observa una degradación insuficiente del compuesto de ensayo, puede
entonces suponerse que el compuesto de ensayo tiene un efecto inhibidor. En este caso, el ensayo debe repetirse
utilizando una concentración menor o empleando otro inóculo. Si en el recipiente FS (control de la degradación
abiótica, en el caso de que se incluya en el ensayo) se observa una cantidad significativa de DBO (> 10%), pueden
haberse producido procesos de degradación abiótica.
Si se ha determinado la eliminación de DQO, la degradación primaria y/o el contenido de nitratos/nitritos, deben

indicarse los valores medidos y los valores calculados. Deben indicarse los valores de pH medidos.
9 VALIDEZ DE LOS RESULTADOS
9.1 Criterios de validez
El ensayo se considera válido si:
a) el porcentaje de degradación obtenido en el decimocuarto día en el recipiente F C (control del inóculo) es superior al
60%;
b) la cantidad de DBO en el ensayo en blanco FB al finalizar el ensayo, que habitualmente se encuentra en el intervalo
comprendido entre 20 mg/l y 30 mg/l, no excede los 60 mg/l una vez transcurridos 28 d.
Si no se satisface alguna de las condiciones a) o b), es conveniente repetir el ensayo con otro inóculo o bien utilizando
un inóculo mejor pre-acondicionado.
9.2 Inhibición
Si el recipiente FI (control de inhibición) está incluido en el ensayo, se considera que el compuesto de ensayo tiene un
efecto inhibidor cuando el porcentaje de degradación del compuesto de referencia en el recipiente F I es inferior al 40%
al finalizar el ensayo. En ese caso, es recomendable repetir el ensayo con una menor concentración del compuesto de
ensayo.
9.3 Valor de pH
Si, una vez finalizado el ensayo, el valor del pH se encuentra fuera del intervalo comprendido entre 6 y 8,5 (por
ejemplo, a causa de la nitrificación de un compuesto de ensayo que contenga nitrógeno) y si el porcentaje de
degradación del compuesto de ensayo es inferior al 60%, es recomendable repetir el ensayo con una menor
concentración del compuesto de ensayo, utilizando un lodo activado no nitrificante como inóculo o aumentando la
capacidad tampón del medio inorgánico. Este hecho debe indicarse en el informe de ensayo.
10 INFORME DE ENSAYO
El informe de ensayo debe contener, al menos, la siguiente información:
a) una referencia a esta norma internacional;
b) toda la información necesaria para la identificación del compuesto de ensayo;
c) todos los datos medidos y calculados (presentados, por ejemplo, en forma tabulada) que se han obtenido, así como la
curva de degradación;
d) la concentración, la DTO y/o la DQO del compuesto de ensayo y del compuesto de referencia utilizados;

ISO 9408:1999 - 16 -
e) el nombre del compuesto de referencia utilizado y la degradación obtenida con este compuesto;
f) el origen, las características, la concentración o el volumen del inóculo utilizado, así como toda la información
relativa a cualquier pretratamiento;
g) las características principales del respirómetro utilizado;
h) la temperatura de incubación del ensayo;
i) si estuviera incluido, el porcentaje de eliminación de COD o la biodegradación primaria;
j) si estuviera incluido, el porcentaje de degradación obtenido en el recipiente F S (degradación abiótica);
k) si estuviera incluido, el porcentaje de degradación en el recipiente FI (control de inhibición) y una indicación acerca
de la toxicidad del compuesto de ensayo;
l) las razones de un eventual rechazo del ensayo;
m) toda modificación del procedimiento operativo así como cualquier circunstancia que pueda haber influido en los
resultados.

- 17 - ISO 9408:1999
ANEXO A (Informativo)
EJEMPLO DEL CÁLCULO DE LA DEMANDA TEÓRICA DE OXÍGENO
A.1 Generalidades
La demanda teórica de oxígeno (DTO) de una hipotético sustancia Cc Hh Clcl Nn Nana Oo Pp Ss, de peso molecular Mr,
puede calcularse según la fórmula:
1 5 1 "#
DTO NH 3 =
!
16 2c +
2
(h − cl − 3n) + 3s + p + na − o
2 2 $
Mr
Este cálculo implica que el C se ha mineralizado a CO2, el H a H2O, el P a P2O5 y el Na a Na2O. El halógeno se elimina
como haluro de hidrógeno. El nitrógeno se elimina en forma amoniacal y no se oxida a nitrito o nitrato. Se supone que
el azufre se oxida al estado +VI.
En el caso de un compuesto nitrogenado, el nitrógeno puede eliminarse después de un proceso de nitrificación a nitrito
o nitrato, con demandas teóricas de oxígeno iguales respectivamente a:
1 3 5 1 "#
DTO NO 2 = !
16 2c +
2
(h − cl ) + 3s + n + p + na − o
2 2 2 $
Mr
1 5 5 1 "#
DTO NH 3 = !
16 2c +
2
(h − cl ) + 3s + n + p + na − o
2 2 2 $
Mr
A.2 Ejemplo: glucosa

Fórmula molecular: C6H12O6; peso molecular: Mr = 180.
1 "#
DTO = !
16 2 × 6 +
2
× 12 − 6
$
= 1,07 mg / mg del compuesto
180
A.3 Ejemplo: n-dodecilbencenosulfonato de sodio

Fórmula molecular: C18H29SO3Na; peso molecular: Mr = 348.
1 1 "#
DTO = !
16 2 × 18 +
2
× 29 + 3 + − 3
2 $
348
A.4 Ejemplo: di-n-dodecilamina

Fórmula molecular: (C12H25)2NH; peso molecular: Mr = 353.
Se asume que se ha observado mediante análisis una conversión completa a nitrato.
1 5 "#
DTO NO 3 = !
16 2 × 24 +
2
× 51 +
2 $
353

ISO 9408:1999 - 18 -
ANEXO B (Informativo)
CORRECCIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO PARA ELIMINAR LA INTERFERENCIA

CON EL PROCESO DE NITRIFICACIÓN
Si se ha producido nitrificación pero ésta no es completa, el consumo de oxígeno observado en la mezcla de reacción
puede corregirse teniendo en cuenta la cantidad de oxígeno empleada en la oxidación del amoníaco a nitrito y del nitrito
a nitrato, siempre que se determinen los cambios en la concentración de nitritos y nitratos durante la incubación. La
corrección se realiza considerando las siguientes reacciones:
2NH4Cl + 3O2 = 2HNO2 + 2HCl + 2H2O (B.1)
2HNO2 + O2 = 2HNO3 (B.2)
Por tanto, de forma global:
2NH4Cl + 4O2 = 2HNO3 + 2HCl + 2H2O (B.3)
De la reacción (B.1) se deduce que el consumo de oxígeno necesario para oxidar al estado de nitrito 28 g de nitrógeno
contenidos en el cloruro de amonio (NH4Cl) es de 96 g, es decir un factor de 3,43 (96/28). De la misma forma, a partir
de la ecuación (B.3), el consumo de oxígeno asociado a la conversión de 28 g de nitrógeno al estado de nitrato es de
128 g, es decir, un factor de 4,57 (128/28).
Dado que las reacciones son secuenciales y que se llevan a cabo por especies diferentes de bacterias, es posible que la
concentración de nitrito aumente o disminuya; en este último caso, se formaría una cantidad equivalente de nitrato. De
este modo, el oxígeno consumido en la formación de nitrato es de 4,57 veces el aumento de la concentración de
N-nitrato mientras que el oxígeno asociado a la formación de nitrito es de 3,43 veces el aumento de la concentración de
N-nitrito. Si la concentración de nitrito disminuye, la pérdida de oxígeno es de 3,43 veces el valor de dicha disminución
de la concentración.
Es decir:
O1 = 4,57 x ∆ NO 3 − N (B.4)
O2 = 3,43 x ∆ NO 2 − N (B.5)
O3 = − [3,43 x ∆ NO 2 − N ] (B.6)
donde
O1 es el oxígeno consumido en la formación de nitrato;
O2 es el oxígeno consumido en la formación de nitrito;
O3 es la pérdida de oxígeno asociada a la desaparición de nitrito;
∆ NO 3 − N es el aumento en la concentración de nitrato-N;
∆ NO 2 − N es la variación en la concentración de nitrito-N.

- 19 - ISO 9408:1999
Así, utilizando las ecuaciones (B.4) y (B.5) o (B.6):
O4 = [4,57 x ∆ NO 3 − N ] ± [3,43 x ∆ NO 2 − N ] (B.7)
y:
O5 = O 6 − O 4 (B.8)
donde
O4 es el consumo de oxígeno resultante de la nitrificación;
O5 es el consumo de oxígeno resultante de la oxidación del carbono;
O6 es el consumo total de oxígeno observado.
De forma alternativa, si solamente se determina el nitrógeno oxidado total, el consumo de oxígeno debido a la
nitrificación puede considerarse, en una primera aproximación, como 4,57 veces mayor que el aumento en la
concentración de nitrógeno oxidado.
El valor corregido correspondiente al consumo de oxígeno debido a la oxidación del carbono se compara entonces a la
DTO NH 3 calculada según el método descrito en el Anexo A.

ISO 9408:1999 - 20 -
ANEXO C (Informativo)
EJEMPLO DE UNA CURVA DE BIODEGRADACIÓN
Fig. C.1 − Biodegradación de la anilina en el ensayo respirométrico

- 21 - ISO 9408:1999
ANEXO D (informativo)
RESPIRÓMETRO CERRADO
Leyenda
1 Absorbente de CO2
2 Monitor
3 Impresora, registro u ordenador
4 Manómetro
5 Baño de agua
6 Unidad productora de oxígeno
7 Recipiente de ensayo
8 Agitador
Fig. D.1 − Principio de funcionamiento de un respirómetro cerrado
La mezcla de ensayo se agita con ayuda de un agitador magnético colocado dentro del recipiente de ensayo, que se
encuentra lleno de líquido hasta un tercio de su capacidad. Si la biodegradación tiene lugar, los microorganismos
consumen oxígeno y producen dióxido de carbono. En ese caso, el oxígeno presente en la fase gaseosa del recipiente se
disuelve en el líquido. El dióxido de carbono que se encuentra en la parte superior del recipiente es adsorbido y, como
consecuencia, la presión total en el interior del recipiente disminuye.
Esta caída de presión se detecta con la ayuda de un manómetro, que se utiliza para iniciar la generación electrolítica de
oxígeno. Una vez restablecida la presión original, la electrólisis se detiene y la cantidad de electricidad utilizada se mide
en el monitor. La cantidad de electricidad empleada es proporcional a la cantidad de oxígeno consumida. Este valor
queda registrado en una impresora, aparato registrador o directamente en un ordenador.

ISO 9408:1999 - 22 -
BIBLIOGRAFÍA
[1] ISO 6060:1989 − Calidad del agua. Determinación de la demanda química de oxígeno.
[2] ISO 7827:1994 − Calidad del agua. Evaluación en medio acuoso de la biodegradabilidad aerobia final de los
compuestos orgánicos. Método por análisis del carbono orgánico disuelto (COD).
[3] ISO 8192:1986 − Calidad del agua. Ensayo de inhibición del consumo de oxígeno por lodo activado.
[4] ISO 8245:1999 − Calidad del agua. Directrices para la determinación del carbono orgánico total (COT) y el
carbono orgánico disuelto (COD).
[5] ISO 9887:1992 − Calidad del agua. Evaluación de la biodegradabilidad aerobia de los compuestos orgánicos
en medio acuoso. Método semicontinuo con lodos activados (SCAS).
[6] ISO 9888:1999 − Calidad del agua. Evaluación de la biodegradabilidad aerobia de los compuestos orgánicos
en medio acuoso. Ensayo estático (Método de Zahn-Wellens).
[7] ISO 10634:1995 − Calidad del agua. Líneas directrices para la preparación y tratamiento de los compuestos
orgánicos poco solubles en agua para la subsecuente evaluación de su biodegradabilidad en medio acuoso.
[8] ISO 11923:1997 − Calidad del agua. Determinación de los sólidos en suspensión. Método de filtración por filtro
de fibra de vidrio.
[9] ISO/TR 15462:1997 − Calidad del agua. Selección de ensayos de biodegradabilidad.

g

Dirección C Génova, 6 Teléfono 91 432 60 00 Fax 91 310 40 32
28004 MADRID-España

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TÍTULO Calidad del agua

Evaluación de la biodegradabilidad aerobia final de los

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ICS 13.060.00 Sustituye a EN 29408:1993

Calidad del agua

 1999 Derechos de reproducción reservados a los Miembros de CEN.

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Esta norma sustituye a la Norma EN 29408:1993.

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1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN ............................................................................ 6

4 CONDICIONES AMBIENTALES DEL ENSAYO............................................................ 8

8 CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS...................................................... 13

9 VALIDEZ DE LOS RESULTADOS.................................................................................... 15

ANEXO A (Informativo) EJEMPLO DEL CÁLCULO DE LA DEMANDA

ANEXO B (Informativo) CORRECCIÓN DEL CONSUMO DE OXÍGENO PARA

ANEXO C (Informativo) EJEMPLO DE UNA CURVA DE BIODEGRADACIÓN................ 20

ANEXO D (Informativo) RESPIRÓMETRO CERRADO.......................................................... 21

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1 OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN

El método es aplicable a los compuestos orgánicos que:

a) sean solubles en agua en las condiciones de ensayo;

c) no estén en contacto ni reaccionen con el absorbente de CO2;

AENOR AUTORIZA EL USO DE ESTE DOCUMENTO A LABORATORIS VIDAL SL

NOTA − El nivel máximo de degradación se expresa como porcentaje.

NOTA − La fase de biodegradación se expresa en días.

NOTA − La fase de meseta se expresa en días.

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4 CONDICIONES AMBIENTALES DEL ENSAYO

5.2 Medio de ensayo

5.2.1.1 Solución a). Se disuelven:

dihidrógenofosfato de potasio anhidro (KH2PO4) 8,5 g

hidrógeno fosfato de dipotasio anhidro (K2HPO4) 21,75 g

hidrógeno fosfato de disodio dihidratado (Na2HPO4.2H2O) 33,4 g

cloruro de amonio (NH4Cl) 0,5 g

agua (5.1), en la cantidad necesaria para enrasar a 1 000 ml

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− 1 ml de cada una de las soluciones b), c) y d).

5.3 Absorbente del dióxido de carbono

5.4 Solución de cloruro de mercurio

5.5 Solución de hidróxido de sodio

5.6 Solución de ácido clorhídrico

6.1 Respirómetro cerrado

6.3 Equipo para la determinación del carbono orgánico disuelto

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6.4 Dispositivo para la determinación de la demanda química de oxígeno (DQO) (opcional)

6.5 Centrífuga o sistema de filtración

6.6 pH-metro (equipo corriente de laboratorio).

7.1 Preparación de las soluciones de ensayo

7.2 Preparación del inóculo

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Basándose en la experiencia, un "volumen adecuado" es aquel:

− que degrada el compuesto de referencia en el porcentaje estipulado (véase el capítulo 9);

Generalmente, son suficientes de 1 ml a 10 ml de inóculo por cada 1 000 ml de solución de ensayo.

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Medio de ensayo Compuesto Compuesto Inóculo

Se mide el pH el último día del ensayo.

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8 CÁLCULO Y EXPRESIÓN DE LOS RESULTADOS

ρTC es la concentración del compuesto de ensayo, en gramos por litro.

DDTO es el porcentaje de biodegradación de la DTO a tiempo t;

ρ cTt − ρ cBt × 100