UNIVERSIDAD DEL AZUAY

FACULTAD DE CIENCIA Y TECNOLOGIA

GUIA DE PRACTICAS DE LABORATORIO
ESCUELA DE INGENIERÍA EN ALIMENTOS

Asignatura: Biotecnología de Tema: Extracción de ADN Practica N0: 4

alimentos. plasmídico y enzimas de
restricción.

Profesor: Rodrigo Caroca, PHD. Nombre del alumno(a): Fecha: 17/05/2022

Naomi Duran
Estefano Segarra

OBJETIVO GENERAL
Implementar el método para la extracción de ADN plasmídico con distintas enzimas de restricción.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Identificar y aprender los métodos de extracción de ADN plasmídico.

 Diferenciar los tipos de enzimas de restricción.
 Conocer los usos de las distintas enzimas de restricción para poder identificar los
plásmidos en las bacterias.

INTRODUCCIÓN
Los plásmidos son moléculas pequeñas de ADN circular capaces de replicarse de forma autónoma,
independientemente del cromosoma. Son muy comunes en bacterias y algunos de ellos, los más
pequeños, existen en las células bacterianas en un número elevado (hasta 100 copias por célula). Los
plásmidos son una herramienta fundamental en Biología Molecular e Ingeniería Genética ya que se
pueden usar como “vectores” para introducir en ellos cualquier fragmento de ADN de interés y de esta
forma amplificarlo de forma natural dentro de la bacteria en la que el plásmido se replica (es lo que se
llama “clonar” un fragmento de DNA).(Repullo J., Moyano E. y Blanco J., s.f ).
Una enzima de restricción es una proteína aislada a partir de bacterias que cortan secuencias de ADN en
sitios específicos de la secuencia, lo que produce fragmentos de ADN con una secuencia conocida en
cada extremo. El uso de enzimas de restricción es sumamente importante para determinados métodos
de laboratorio, tales como la tecnología de ADN recombinante y la modificación genética. Las enzimas

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de restricción son proteínas que se unen al ADN de una manera muy específica. Realmente reconocen
los pares de bases en el ADN. En general se unen a una secuencia palindrómica que es una secuencia
que tiene una copia en espejo de sí misma - GCTAGC. (National Human Genome Research Institute,
2022).
Recientemente se está generando una nueva era del mejoramiento genético por medio de las técnicas
de edición génica que generan cambios precisos y controlados (edición) de las secuencias génicas a
partir de un sistema de enzimas de restricción. Este sistema se espera genere una nueva revolución
biotecnológica y aportes sustanciales al desarrollo de cultivos y alimentos.(Mendez J., 2022)

MATERIALES Y MÉTODOS

- Materiales y reactivos
Reactivos

1. Enzimas de restricción HindIII, XbaI y VspI (AseI) (Thermo Fisher Scientific)

2. Buffer Tango (Thermo Fisher Scientific)

3. Agua estéril

Equipo y materiales

1. Estufa a 37ºC

2. Set de Micropipetas

3. Tubos de 1.5 mL

4. Puntas para micropipeta de 10, 100 y 1000 ul.

- Procedimiento experimental
1. Medir 1.5 ml del caldo de cultivo y centrifugar para el crecimiento de bacterias del día
anterior para formar un pellet para remover el líquido presente.
2. Agregar 250 ul de Buffer de resuspensión (R3) con RNasa A al pellet de las células y se

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 resuspendió el pellet hasta que este totalmente homogéneo.
3. Agregar 250 ul de Buffer de lisis (L7). Se mezclo por inversión tapado el tubo hasta que
la mezcla se encuentre homogénea. No se utilizó vortex. Se incubo el tubo a una
temperatura ambiente por 5 minutos.
4. Se adiciono 350uL de buffer de precipitación (N4). Se mezcló inmediatamente
invirtiendo el tubo. NO USAR VORTEX. Se centrifugó el lisado a 12000 x g por 10
minutos.
5. Se cargó el sobrenadante del paso anterior a la SPIN COLUMN unida a un tubo de
lavado de 2mL. Se centrifugó la columna a 12000 x g por 1 minuto. Se descartó el
líquido que pasa al tubo de colección removiendo la columna y se colocó la columna
nuevamente al tubo de colección.
6. Se añadió 500uL de Wash Buffer (W10). Se incubó la columna durante 1 minuto a
temperatura ambiente. Se centrifugó la columna a 12000 x g por 1 minuto. Se descartó
el líquido que pasa al tubo de colección removiendo la columna y se colocó la columna
nuevamente al tubo de colección.
7. Se agregó 700uL de Wash Buffer (W9) y se centrifugó a 12000 x g por 1 minuto. Se
descartó el líquido que pasa al tubo de colección removiendo la columna y se colocó la
columna nuevamente al tubo de colección. Además, se centrifugó la columna a 12000 x
g por 1 minuto y se descartó el tubo de colección.
8. Se colocó la columna en un tubo limpio de 1.5mL. Se adicionó 50uL de buffer TE en el
centro de la columna. Se incubó el tubo a temperatura ambiente.
9. Se centrifugó la columna a 12000 x g por 2 minutos. Se guardó el tubo a -20°C en el
congelador.
10. La muestra fue analizada por un gel de electroforesis.

Tabla 1: Digestión del plásmido pET28-AAM con la enzima HindIII

Componente de la reacción Volumen (1 ul)
H2O 6 ul
Buffer R 2 ul
Plásmido 10 ul
Enzima HindIII 2 ul
Volumen total 20 ul

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 Tabla 2: Digestión del plásmido pET28-AAM con la enzima XhoI
Componente de la reacción Volumen (1 ul)
H2O 6 ul
Buffer R 2 ul
Plásmido 10 ul
Enzima XhoI 2 ul
Volumen total 20 ul

Tabla 3: Digestión del plásmido pET28-AAM con las enzimas HindIII y XhoI
Componente de la reacción Volumen (1 ul)
H2O 4 ul
Buffer R 2 ul
Plásmido 10 ul
Enzima XhoI 2 ul
Enzima HindIII 2 ul
Volumen total 20 ul

Tabla 4: Digestión del plásmido pET28-AAM con la enzima VspI (AseI)

Componente de la reacción Volumen (1 ul)
H2O 6 ul
Buffer Red Anza 2 ul
Plásmido 10 ul
Enzima VspI 2 ul
Volumen total 20 ul

RESULTADOS
El resultado obtenido fue a través de un gel de electroforesis en el cual está cargado con adn plasmidico
ya que nos ayudo a observar varias marcas a lo largo del gel, con esto se puede decir que el ADN se
fragmento correctamente, se coloco por posillos la ayuda con la que logramos observar cuantas pares
de bases tiene nuestro ADN.

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DISCUSIÓN

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

Enzima de restricción | NHGRI. (2022, 17 mayo). Genome.gov. Recuperado 17 de mayo de

2022, de https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Enzima-de-restriccion

Mendez, L. (s. f.). Una nueva era de la biotecnología en el mejoramiento genético. Investiga

TEC. Recuperado 17 de mayo de 2022, de

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 https://revistas.tec.ac.cr/index.php/investiga_tec/article/download/3473/3142

Repullo, J. L., Moyano, E., & Blanco, J. (s. f.). Purificación de ADN plasmídico y electroforesis
del mismo en gel de agarosa. Universidad de Córdoba.
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/38%20PURIFICACION%20DNA
%20PLASMIDO.pdf