Ensayos Biotecnológicos

PRÁCTICA
AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS:
EXTRACCIÓN CON SOLVENTES ORGÁNICOS. ADN DEL HIGADO (I)

1.- INTRODUCCIÓN:

Las células eucariotas presentan un contenido en ADN mucho mayor que las células
procariotas. Las moléculas de ADN en eucariotas se combinan con proteínas y se organizan
en fibras de cromatina en el núcleo.

Los ARNs, aun siendo mucho más cortos que los ADNs, son mucho más abundantes
en la mayoría de las células. Tanto en células eucariotas como procariotas las tres clases
mayoritarias de ARNs son: mensajero (ARNm), ribosomal (ARNr) y transferente (ARNt). Cada
uno consta de una cadena simple de ribonucleótidos con un determinado peso molecular,
secuencia de nucleótidos y función biológica.

En esta práctica se va a extraer el ADN del hígado de ternera, tras la disgregación

del tejido y la lisis celular, se extraerá el ADN mediante una purificación con fenol,
cloroformo, alcohol isoamílico, y posterior precipitación con un alcohol de alta pureza y
una sal. Finalmente, se cuantificará por espectrofotometría en la práctica siguiente.

2.- OBJETIVO:

El objetivo de esta práctica es aislar ácidos nucleicos (fundamentalmente ADN) a

partir de un tejido animal, el hígado de ternera y su posterior cuantificación.

3.- MATERIALES:

 Tubos (de plástico) y tubos Falcon® de 15 mL  Centrífuga de mesa.

(Tubo de fondo cónico y tapón de rosca).  Varilla de vidrio y pipetas.

4- MUESTRA Y REACTIVOS:

 Tampón salino/Detergente: NaCl 0.14 M,  Acetato sódico 3 M pH 5.2.

acetato Mg 1.5 mM, KCl 5 mM, Dodecil Sulfato  Etanol absoluto (en el
Sódico (SDS) al 1%. congelador).
 Fenol/cloroformo/isoamílico (Preparar en la  Tejido animal (hígado de
campana de gases, 25:24:1). ternera).
 Tampón Tris-EDTA: Tris 10 mM, EDTA 1 mM,
pH 7.5.

Profesor: David Ruiz Sánchez 1

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5.- PROCEDIMIENTO:

5.1. Lisis celular:

1. En un tubo Falcon® de 15 mL (tubo de fondo cónico con tapón de rosca) poner el trozo de
hígado pesado (pesar entre 0,1 y 0, 2 g, y anotar el peso realizado).

2. Disgregar el tejido: desmenuzarlo tanto como sea posible con una varilla de vidrio contra
las paredes del tubo (procurando que no se vaya al fondo cónico).

3. Añadirle 10 veces el peso de hígado pesado en mL de Tampón Salino/Detergente.

5.2.- Purificación del ADN:

1. Añadir (en campana de gases, con guantes ¡producto muy

corrosivo!) el mismo volumen de Fenol/cloroformo/alcohol
isoamílico, en proporción 25:24:1. Tapar muy bien y agitar
durante 60 segundos.

2. Equilibrar el peso de este tubo con otro Falcon® de 15 mL

con agua. Centrifugar a 5.000 rpm durante 5 minutos.

3. Extraer con cuidado la fase acuosa (fase superior) con una

pipeta de vidrio, y pasar a otro tubo Falcon® de 15 mL. Vaciar
el resto del contenido en una botella de residuos tóxicos en la
campana de gases ¡No tirar por el fregadero! (acumular en un
frasco con tapón de rosca, para depositar al final, en el bidón
de residuos orgánicos). Lavar el tubo.

Nota: Para Muestras Fibrosas (que se quedan sin fase acuosa tras la 1ª centrifugación):
Añadir un volumen de Tampón + otro volumen de (Fenol/cloroformo/isoamílico). Mezclar,
centrifugar como anteriormente, y recoger la fase acuosa.

Profesor: David Ruiz Sánchez 2

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5.3.-Precipitación del ADN:

1. Añadir 1/10 del volumen de fase acuosa recuperada (medirla con una pipeta de 5mL), de
Acetato sódico 3 M pH 5.2.

2. Añadir gota a gota 2 volúmenes de Etanol absoluto (100%) frio (está en el congelador) a la
solución anterior y mezclar por inversión.

3. Al añadir el Etanol, el ADN precipita en forma de un ovillo blanquecino. Si no se ve

claramente el ovillo de ADN, incubar 5 minutos a – 20 C, en el congelador.

4. Centrifugar a 5.000 rpm 5 minutos para depositar el ADN en las paredes del tubo. Escurrir
con cuidado el etanol y resuspender el pellet de ADN en 2 mL de tampón Tris/EDTA pH 7.5.

5. Conservar a 2-8 ˚C. Para almacenajes largos conservar a -20 ˚C o – 80 ˚C.

En el informe a entregar, seguir las normas y guía para la realización de los informes, y no
olvidar realizar un esquema del proceso, justificando el fundamento, indicando los
reactivos usados en cada etapa que finalidad y función tienen, justificando los fenómenos
o procesos que ocurren en la lisis, la purificación y la precipitación, incluyendo los datos e
imágenes del proceso, así como la longitud de máxima absorción. Realizar los cálculos
necesarios para preparar las diferentes disoluciones empleadas, así como, las conclusiones
oportunas o discusión de los resultados. Realizar el informe atendiendo al orden
establecido de los apartados en la rúbrica establecida en la programación.

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