Segunda Unidad Metabolismo de los Carbohidratos

INTRODUCCION.
La mayoría de alimentos que consumimos no pueden ser absorbidos hacia la sangre, sin antes transformarse en partículas más
pequeñas. La digestión es el proceso por el cual, en el tubo digestivo, las moléculas de alimentos se rompen en moléculas
pequeñas con la ayuda de enzimas. Las enzimas digestivas son del tipo hidrolítico o hidrolasas, que descomponen las moléculas
orgánicas del alimento (sustratos), mediante la adición de agua, rompiendo los enlaces entre subunidades conformantes de la
molécula.

Las enzimas hidrolíticas son específicas; hidrolizando una molécula sustrato o a lo sumo un pequeño grupo de moléculas sustrato.
Para que una enzima funcione se necesita de condiciones específicas como la temperatura, pH, etc, de lo contrario sin estas
condiciones se hace difícil su accionar.

FUNDAMENTACIÓN DE LA TECNICA.
La técnica empleada está basada en la siguiente reacción:
amilasa
Almidón + H2O maltosa + glucosa
para detectar la actividad enzimática se identificará al sustrato mediante la reacción IKI y la del producto mediante la reacción de
Benedict. La reacción IKI (iodo-yoduro de potasio) detecta la presencia de almidón; mediante el viraje de color caramelo a un
color azul oscuro; el reactivo de Benedict detecta la presencia de azúcares reductores (glucosa o maltosa) mediante un cambio
de color azul brillante a verde anarajando o marrón rojizo.

FINALIDAD.
▪ Determinar la digestión de la molécula sustrato almidón utilizando la enzima amilasa comparando con controles negativos.

COMPETENCIA A LOGRAR POR EL ESTUDIANTE.

▪ Comprende cómo se logra demostrar la digestión de una molécula de carbohidrato (sustrato) por la acción específica de una
enzima determinando la presencia del sustrato residual y productos formados en la reacción.

MATERIAL Y EQUIPO.
▪ Simulador de Laboratorio: Physio ExTM 10.0
▪ Reactivos:
• Solución de amilasa.
• Solución de almidón.
• Solución tamponada pH 2.0
• Solución tamponada pH 7.0
• Solución tamponada pH 9.0
• Solución de maltosa.
• Agua destilada.

PROCEDIMIENTO.
1) Acceda al programa Physio Ex, mediante el siguiente enlace:
https://media.pearsoncmg.com/bc/bc_0media_ap/physioex/10/ex8/act1/
2) Pulse en la pestaña Experimento (Experiment) para comenzar, hasta que en la pantalla aparezca el equipo para el trabajo.
3) Arrastre un tubo de ensayo hasta la primera ranura (1) de la unidad de incubación, los demás tubos se colocan
automáticamente.
4) Añada a los tubos de ensayo lo que se indica a continuación:
TUBOS DE ENSAYO (Componentes)
I II III IV V VI VII VIII
Amilasa Amilasa Amilasa Amilasa Agua destilada Agua destilada Amilasa Amilasa
Almidón Almidón Almidón Agua destilada Almidón Maltosa Almidón Almidón
Tampón pH 7.0 Tampón pH 7.0 Tampón pH 7.0 Tampón pH 7.0 Tampón pH 7.0 Tampón pH 7.0 Tapón pH 2.0 Tapón pH 9.0
(para añadir una sustancia a un tubo de ensayo, del estante de soluciones arrastre el tapón cuentagotas del frasco correspondiente, hasta la parte superior
del tubo de ensayo).
5) Pulse en el número (1) que está bajo el primer tubo de ensayo. El tubo descenderá a la unidad de incubación el resto de
tubos deben permanecer en la posición elevada.
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6) Pulse en Hervir (Boil) para hervir el contenido del primer tubo. Después de hervir durante unos momentos, el tubo subirá
automáticamente.
7) Pulse en el número (2) que está bajo el segundo tubo de ensayo. El tubo descenderá a la unidad de incubación el resto de
tubos deben permanecer en la posición elevada.
8) Pulse en Congelar (Freeze) para congelar el contenido del segundo tubo. Después de hervir durante unos momentos, el
tubo subirá automáticamente.
9) Pulse en Incubar (Incubate) para iniciar la incubación. La temperatura debe estar en 37°C y el temporizador fijado en 60
minutos (la simulación comprime el período de tiempo de 60 minutos hasta 10 segundos de tiempo real). La unidad de
incubación agitará suavemente el soporte de los tubos y mezclará de manera uniforme su contenido durante la incubación.
Transcurrido el tiempo de incubación, el soporte de los tubos de ensayo subirá automáticamente y las puertas del armario
de análisis se abrirán.
10) Arrastre el primer tubo desde la unidad de incubación hasta el primer tubo de ensayo en el armario de análisis, para decantar
la mitad de su contenido, la decantación para el resto de los tubos se repite automáticamente.
11) Arrastre el tapón cuentagotas del frasco del reactivo IKI hasta el primer tubo de ensayo del armario de análisis y coloque
una gota; el proceso para el resto de los tubos se repite automáticamente.
12) Observe el cambio de color en los tubos y pulse Guardar Datos (Record Data) para mostrar los resultados en la pantalla.
13) Arrastre el tapón cuentagotas del frasco del reactivo de Benedict hasta el primer tubo de ensayo de la unidad de incubación
para añadir cinco gotas de reactivo. Automáticamente se añadirán gotas de reactivos a los demás tubos.
14) Pulse en Hervir (Boil). El soporte de los tubos bajará sumergiendo los tubos en la unidad de incubación y el contenido de
los tubos hervirá durante un momento.
15) Observe el cambio de color en los tubos y pulse Guardar Datos (Record Data) para mostrar los resultados en la pantalla.

ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO:

▪ Anote los resultados observados en el paso 8 y 11 en la siguiente tabla:
Tabla Digestión del almidón por la amilasa salival
Tubos I II III IV V VI VII VIII
Ensayo IKI
Test Benedict
▪ Explique bioquímicamente lo observado.

PREGUNTAS DE APLICACIÓN.
1) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la simulación.
2) Elabore un mapa conceptual y explique el efecto de la ebullición sobre la actividad de la enzima
3) Mediante un mapa conceptual explique el efecto del congelamiento sobre la actividad de la enzima estudiada.
4) Elabore un mapa conceptual y explique cómo averiguaría el pH óptimo para la actividad de la amilasa.
5) Mediante un gráfico explique cuál es la razón por qué la amilasa sería mucho menos activa en el estómago.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
2) Nelson D, Cox M. Lehninger. Principios de Bioquímica. 7ma Edición, Editorial Omega, España, 2018.
3) Zao P, Stabler T, Smith L, Lokuta A, E Griff. Physio ExTM 9.0 Simulaciones de Laboratorio de Fisiología, España 2012.
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INTRODUCCION.
La glucosa es la fuente de energía más importante del organismo, especialmente para algunos tejidos altamente especializados
como el cerebro y los glóbulos rojos que constituyen su única fuente de energía. Por tanto, nuestro organismo dispondrá de una
compleja maquinaria metabólica que asegure mantener constante la concentración de glucosa en la sangre y con ello, el aporte
permanente de este sustrato a los tejidos.

La glucosa sanguínea, proviene de dos fuentes: una de origen exógeno de los alimentos, y otra de origen endógeno del hígado
por glucogenólisis y de la gluconeogénesis. Se ha demostrado que la glucosa se gasta cuando es removida de los tejidos
periféricos (para su consumo) y por excreción renal por la orina; por tanto, la concentración de glucosa sanguínea dependerá del
balance entre el aporte y el gasto de la misma en el organismo.

El mantenimiento constante de la concentración de glucosa sanguínea depende de la interacción de diversos factores como la
absorción, producción endógena de glucosa, así como la utilización y excreción de la misma. El transporte de glucosa a través
de la membrana apical de las células de la mucosa intestinal se realiza ligado al sodio, en un mecanismo dependiente de energía
empleando una proteína transportadora para ambas moléculas llamada SGLT, requiriendo de alta concentración de sodio en la
luz intestinal para que se realice dicho mecanismo.

El transporte de glucosa al interior de las células se realiza por un mecanismo diferente al que se lleva a cabo en las células
intestinales; en el caso del hepatocito, célula muy permeable a la glucosa, el mecanismo estará asociado a difusión simple;
mientras que, en la mayoría de los demás tejidos, en particular en el tejido adiposo, corazón y músculo esquelético dicho
transporte estará dado por difusión controlada mediada por receptores asociados a la familia GLUT.

El conocimiento de la concentración de glucosa en sangre (glicemia) es importante no sólo porque permite tener una idea integral
del mecanismo de homeostasis metabólica existente, sino porque las variaciones de ella son expresiones de diversos estados
patológicos que se deben investigar y diagnosticar para su tratamiento. Los valores normales de glicemia son variables de acuerdo
al método utilizado; según el método de Folin Wu los niveles varían entre los 80 – 120 mg%; mientras que con el método de la
glucosa oxidasa la concentración varía entre 70 – 110 mg/dl.

FUNDAMENTACIÓN DE LA TECNICA.
La técnica empleada en la determinación de la glucosa en sangre es una técnica enzimática, basada en la siguiente reacción:

Glucosa + O2 + H2O GOD ácido glucónico + H2O2; 2H2O2 + 4-AF + 4-Hidroxibenzoato POD Quinonimina roja

FINALIDAD.
▪ Demostrar la digestión y absorción de la glucosa, cuantificando la glicemia pre y postprandial, por el método de Glucosa
oxidasa; tanto en personas normales como en casos patológicos.

COMPETENCIA A LOGRAR POR EL ESTUDIANTE.

▪ Comprende como se demuestra la digestión y absorción de la glucosa, cuantificando la glicemia pre y posprandial por el
método enzimático.

MATERIAL, EQUIPO y REACTIVOS.

▪ Material de vidrio: tubos de ensayo, pipetas milimétricas.
▪ Equipo de extracción de muestra: guantes, alcohol, algodón, agujas N° 20, jeringas x 5 cc.
▪ Equipos: centrífuga, micropipetas, baño maría, espectrofotómetro.
▪ Reactivos:
• Reactivo A: Solución conteniendo glucosaoxidasa, peroxidasa, aminofenazona, hidroxibenzoato y buffer fosfato pH: 7
• Estándar: solución de glucosa 1g/l. (100 mg/dl)

PROCEDIMIENTO.
1) Extracción de muestras: previa limpieza de la zona con alcohol, se extraerá 5 cc de sangre de la flexura del codo con jeringa
hipodérmica de 5 cc y aguja N° 20 en dos momentos:
▪ La primera extracción se realizará con la persona en ayuno de 4 a 8 horas.
▪ La segunda se realizará después de la ingesta alimenticia, una hora después como máximo.

2) Una vez obtenidas las muestras, colocarlas en tubos de ensayo y dejarlas reposar durante 10 minutos.

3) Terminado el reposo, contrapesar los tubos conteniendo las muestras y centrifugarlos a 3000 RPM durante 10 minutos.

4) Finalizado el centrifugado separar el suero para trabajar la determinación.

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5) Rotular previamente los tubos de ensayo y preparar el siguiente sistema agregando lo que se indica:
TUBOS DE ENSAYO
COMPONENTES (en ml)
B S Dpre (1) Dpos (2)
Estándar -- 10 ul -- --
Muestra 1 (suero preprandial) -- -- 10 ul --
Muestra 2 (suero posprandial) -- -- -- 10 ul
Reactivo A 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Incubar 5 minutos a todos los tubos de ensayo en baño maría a 37 °C
Observar los resultados en cada uno de los tubos (considerar cambio de color).
Leer en espectrofotómetro a 505 nm, llevando el aparato a cero con el blanco. Anotar los
resultados.

RESULTADOS.
1) Luego del Incubado:

B S D1 D2

2) Lecturas del espectrofotómetro: de las muestras de un paciente adulto en ayunas y posingesta alimenticia.
Glucosa [505 nm]
Muestra Muestra
Blanco Estándar
Preprandial Postprandial
0.000 0.220 0.225 0.298

ACTIVIDADES A DESARROLLAR POR EL ALUMNO.

1) Cálculos de los resultados:
▪ Cálculo del factor:
𝟏𝟎𝟎 𝐦𝐠/𝐝𝐥
𝐅=
𝐒

▪ Cálculo de la concentración de glucosa. (de cada una de las muestras).

Glucosa (mg/dl) = D x F

2) Interpretación de los resultados.

▪ Valores Referenciales:
• Suero o Plasma (adultos): 74 – 106 mg/dl.

3) Explique bioquímicamente lo encontrado.

PREGUNTAS DE APLICACIÓN.
1) Identifique las variables que intervinieron en el experimento realizado en la práctica.
2) Mediante un mapa mental, identifique los componentes del sistema enzimático empleado en la práctica y señale sus
principales características.
3) Confeccione un cuadro comparativo explicando cómo afecta el ayuno y el estado posprandial a la concentración de la glucosa
en sangre y que vía metabólica activa.
4) Esquematice un transportador de glucosa de la familia SGLT y GLUT, señalando sus componentes.
5) Analice los datos. Mujer de 54 años, que acude con las siguientes lecturas de absorbancia: Estándar = 0.240, Muestra
preprandial = 0.446 y muestra postprandial = 0.523. Interprete y de una explicación bioquímica.
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1) Murray R. Harper Bioquímica Ilustrada. 31° edición, México 2019.
2) ADA, estándares para Diabetes 2020. Diabetes Care.
Disponible: https://care.diabetesjournals.org/content/44/Supplement_1
3) Vademecum Wiener Lab, Rosario, Argentina. Disponible: http://files.wiener-lab.com/Vademecum_completo_espanol.pdf
4) Alpaca H, J García. Guía de Práctica de Bioquímica. UNT 2007.
5) Huamán J. Laboratorio clínico. Procedimiento e interpretación. 2° edición, Trujillo 2018.