Tema de la práctica: Análisis de ADN de bacterias por medio de herramientas de

biotecnología.

Número de la PRÁCTICAS: 1- 3

AUTORES DEL INFORME

Cristopher Aguaiza
Ismael Barbecho
Juan Guamán

OBJETIVO GENERAL

 Realizar la extracción del ADN de bacterias y levaduras.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Comprender el uso de los reactivos y materiales usados en el laboratorio.

 Observar la calidad y cantidad del ADN por electroforesis.
 Comparar los resultados obtenidos de ambos grupos con la imagen de referencia.

INTRODUCCIÓN

La pared celular de las bacterias varía en su complejidad arquitectónica. Esta diferencia sirve de base
para dividirlas en dos grandes grupos: las bacterias Gram positivas y las Gram negativas. Esta división se
basa en el hecho de que, por diferencias en: la estructura y composición de la pared celular, las
bacterias se tiñen de diferente color cuando se usa la tinción de Gram (Vera, 2008, pág. 39).

La pared celular de las bacterias Gram positivas está compuesta por varias capas de peptidoglicano que
conforman una estructura gruesa y rígida que permite diferenciarlas con la pared de las Gram negativas.
Además, la pared celular de las bacterias Gram positivas contiene ácidos teicoicos que están
compuestos principalmente de un alcohol y fosfato; y su función principal es prevenir la ruptura de la
pared celular y reducir el riesgo de lisis (Tortora, Berdell, & Christine, 2009, pág. 49).
La pared celular de las bacterias Gram negativas está compuesta por una capa o por muy pocas capas
de peptidoglucano y una membrana externa que recubre la pared celular de estas bacterias. Entre la
membrana citoplasmática interna y la membrana externa se localiza el espacio periplásmico, relleno de
una sustancia denominada periplasma, la cual contiene enzimas importantes para la nutrición de
estas bacterias. La membrana externa de las bacterias Gram negativas está compuesta por
lipopolisacárido (LPS), lipoproteínas y fosfolípidos. La pared celular de estas bacterias al no tener ácidos
teicoicos y el hecho de que contenga una escasa cantidad de peptidoglucano es más susceptible a la lisis
(Tortora, Berdell, & Christine, 2009, pág. 41).

Usos de la extracción de ADN

La extracción de ADN puede usarse para introducir genes de interés en organismos, con el objetivo de
expresar una proteína recombinante concreta, que puede ser:

 Utilizada para enriquecer un alimento: por ejemplo, la composición de la leche (una

importante fuente de proteínas para el consumo humano y animal) puede modificarse
mediante transgénesis, añadiendo genes exógenos y desactivando genes endógenos
para mejorar su valor nutricional, reducir infecciones en las glándulas mamarias,
proporcionar a los consumidores proteínas antipatógenas.
 Útil para mejorar la resistencia del organismo transformado: por ejemplo, en plantas se
pueden introducir genes que confieren resistencia a plagas, herbicidas o agentes como:
sequedad, salinidad (Harvey, y otros, 2005, pág. 52).

Electroforesis en gel

La electroforesis en gel es una técnica utilizada para separar fragmentos de ADN únicamente por su
tamaño y carga; consiste en aplicar una corriente eléctrica a través de un gel que contiene las moléculas
de interés. Con base en su tamaño y carga, las moléculas se desplazarán por el gel en diferentes
direcciones o a distintas velocidades, con lo que se separan unas de otras. Esta técnica es útil y de
mucha importancia cuando se desea determinar la calidad del ADN. (Harvey, y otros, 2005, pág. 70)
MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

Materiales Reactivos Equipos

Micropipetas Etanol 70% MIcrocentrífuga de tubos de
1.5 ml
Puntas de micropipetas 10,100, Cultivo de una noche de bacteria E. Equipo de electroforesis
1000 ul coli y levadura
Kit de extracción de ADN Masking tape Transiluminador
“Purelink Genomic DNA kits”
Matraz Erlenmeyer Agarosa Termociclador
Probeta 100 ml TAE 1X
Tubos Eppendorf 1.5 ml Syber safe 10000X
Tubos de PCR Parafilm
Gel de agarosa Taq polimerasa
Producto de PCR Primers
Agua ultrapura
Muestra de bacterias
Ladder
Enzimas de restricción
Buffer de carga de ADN

Procedimiento experimental

Procedimiento para extracción de ADN de bacterias

Agregamos 1 ml de un caldo de cultivo de una noche anterior a un tubo de 1,5 ml Eppendorf.

Centrifugamos a 13000-16000 rcf por 2 minutos hasta obtener un pellet. Remover el sobrenadante.
Resuspendemos el pellet en 180 ul de Purelink Genomic Digestion Buffer. Agregamos 20 ul de
proteinase K para lisar las células. Mezclar bien con el vortex.
 Incubamos el tubo a 55ºC mezclando con el vortex ocasionalmente (30 min a 4 horas). Una vez
terminado este paso ir a la lisis celular inmediatamente.

Procedimiento para extracción de ADN de levaduras.

Agregamos 1 ml de un caldo de cultivo de una noche anterior a un tubo de 1,5 ml Eppendorf.

Centrifugamos a 13000-16000 rcf por 2 minutos hasta obtener un pellet. Remover el sobrenadante.
Resuspendemos el pellet en 180 ul de PureLink Genomic Digestion Buffer.
Llevamos al sonicador por 10 minutos.
Agragamos20 ul de proteinase K para lisar las células. Mezclar bien con el vortex. E incubamos (45
min a 55ºC). Una vez terminados este paso pasar a lisis celular inmediatamente.

Lisis celular para bacterias y levaduras

Agregamos 20 ul de RNAsa al lisado. Mezclar bien con el vortex e incubamos 2 min a temperatura
ambiente (TA)
Agregamos 200 ul de Purelink Genomic Lysis/Binding Buffer y mezclamos bien con el vortex hasta
obtener una solución homogénea.
Agregamos 200 ul de Etanol 96-100% al lisado, Mezclamos bien con el vortex por 5s hasta alcanzar
una solución homogénea.
Lavado de Muestras

Sacamos un PureLink Spin Column del paquete que las contiene.

Agragamos al lisado (PureLink Genomic Lysis/Binding Buffer y Etanol) a la Spin Column.
Centrifugamos la columna a 10000g por 1 min a temperatura ambiente.
Descartar el tubo de coleecion y colocar la Spin Column en un nuevo PureLink Collection Tube .
Agregamos 500 ul de Wash Buffer 1 a la columna (Asegurar que ya se ha adicionado etanol).
Centrifugamos la columna a 10000g por 1 min a temperatura ambiente.
Descartamos el tubo de colección y colocar la Spin column en un nuevo PureLink Collection Tube.
Agregamos 500 ul de Wash Buffer 2 a la columna (Asegurar que ya se ha adicionado etanol)
Centrifugamos la columna a máxima velocidad por 3 min a temperatura ambiente. Descartar el tubo
de colección.

Elusión de Muestras
 Colocamos la columna en tubo de 1.5 ml estéril
Agregamos 50 ul de PureLink Genomic Elution Buffer a la columna, cuidando de no romper a esta
con la punta de la micropipeta.
Encubar a temperatura ambiente por 1 min. Centrifugar la columna a máxima velocidad por 1 min.
El ADN está en el tubo.
Almacenar el ADN a –20ºC hasta que sea necesario su uso.

Procedimiento de una gel de agarosa al1.2% de 80 ml.

Medimos 80 ml de buffer TAE 1X con una probeta y depositar este volumen en un matraz
Erlenmeyer.
Calculamos la cantidad de agarosa que se debe usar para un gel al 1.2% considerando el volumen
indicado en el punto anterior.
Pesamos la cantidad de agarosa calculada y disolvemos en el buffer contenido en el matraz usando
en el microondas.
Calculamos el volumen de Syber Safe en concentración inicial 10000X para llegar a una
concentración final de 1X parar un gel de 80 ml(80000 ul). Usar la siguiente formula:
C1V1=C2V2
Colocamos volumen de syber Safe calculando y mezclar.
Una vez mezclado vaciamos en el molde de gel agarosa y colocamos la peineta para formar los
pocillos correspondientes.
Dejamos enfriar a temperatura ambiente hasta que solidifique durante al menos 15min.
Retiramos la peineta con cuidado.

Carga de muestras y corrida de gel

Colocamos el gel en la cámara de electroforesis.

Añadimos el buffer TAE hasta que cubra el gel en su totalidad.
Preparamos la muestra de ADN agregando la cantidad que corresponda el buffer de carga (Loading
buffer) .
Cargamos el gel de acuerdo con lo que indique el instructor.
 Conectamos los cables a la fuente de poder ajustar el voltaje a 100V y hacerlo correr durante 30
min.

Relevado del gel de agarosa en el equipo ENDURO GDS

Cuando ha terminado la electroforesis, apagamos y retiramos la tapa.

Quitamos el gel de la cubeta. Escurrimos el exceso de buffer de la superficie del gel.
Visualizamos las bandas usando el transiluminador.
Interpretamos los resultados.
Desechamos el gel de acuerdo con las normas del centro.

Procedimiento para la reacción de PCR

Trabajamos con nuestras muestras que corresponden a microorganismos utilizados en la

fermentación de alimento o de uso común en Biotecnología.
Usamos Primers (cebadores) que son específicos para detectar bacterias (Primers 16S) y primers que
son específicos para hongos y levaduras.
Preparamos las reacciones de PCR de acuerdo con la siguiente tabala:
Componente de la reacción Volumen para una reacción Mix X

Dream Taq 2X 10 ul 130 ul

Primer F 2 ul 26 ul

Primer R 2 ul 26 ul

Agua 4 ul 52 ul

Muestra de ADN 2 ul _____

Volumen total 20 ul 260 ul

Cada grupo debe preparar 1 tubo para hacer una PCR con la muestra de bacteria y un tubo para
hacer una reacción con la muestra de levadura.
Del mix tomamos 18 ul y depositamos este volumen en cada uno de los tubos de PCR
 A cada tubo de PCR agregamos 2 ul dela muestra que se desea analizar.
Cerrar bien los tubos y llevar al Termociclador para que se pueda llevar a cabo la PCR.
Cargamos las muestras en un gel de electroforesis para analizar los resultados.

Análisis de ADN con enzimas de restricción

Haremos una digestión (Corte) de AND procedente de reacciones de PCR. Investigaremos si estos
fragmentos de ADN son reconocidos y cortamos por las enzimas de restricción que usaremos.
Específicamente trabajaremos con productos de PCR que corresponden a la región ribosomal de 16S
de bacterias.
Para esta práctica usaremos las enzimas de restricción Dde1 y Bgl2 y usaremos mezclas de reacción
que se describen a continuación.
Enzima Dde1

Buffer 10X 2 ul

Enzima Dde1 1 ul

Producto de PCR 5 ul

H20 12 ul

Total 20 ul

Enzima Bgl2

Buffer 10X 2 ul

Enzima Bgl2 1 ul

Producto de PCR 5 ul

H20 12 ul

Total 20 ul

Para las enzimas de restricción Dde1 y Bgl2 debemos incubar a 37ºC por una hora
 A la muestra digerida, agregamos suficiente buffer de carga para sembrar en un gel de electroforesis
(1.2% de agarosa)
Cargamos 20 ul en el gel de cada muestra digerida, incluyendo también muestras de ADN que no
han sido sometidas a tratamientos con enzimas.
Usamos un ladder de ADN 100bp y 1Kb para poder estimar el tamaño de las bandas obtenidas

RESULTADOS

En la figura 1 que se muestra a continuación se observa el ADN genómico extraído de la bacteria E. coli y
de la levadura Saccharomyces cerevisiae por medio de una electroforesis, en la que el tamaño del ADN
de los dos tiene una longitud mayor a 10000 kb.

30 10000

6 30 8000

14 70 6000

6 30 5000

6 30 4000

6 30 3500

14 70 3000

5 25 2500

5 25 2000

5 25 1500

12 60 1000 Figura1: electroforesis de ADN genómico extraído de la bacteria

Escherichia coli y levadura Saccharomyces cerevisiae.
5 25 750

5 25 500

5 25 250
PCR de bacterias

En la figura 2 se observa la bacteria Escherichia coli sin aislar por medio de una electroforesis que en
nuestro caso no se puede visualizar los pares de kb del ADN, esto se debe a que la muestra está
contaminada ……..

Figura 2: electroforesis de la bacteria Escherichia coli sin aislar.

Digestión de productos de PCR

En la figura 3 se observa la electroforesis del ADN puro extraído de la bacteria E. coli, el ADN digerido
por la enzima Dde I y el ADN digerido por la enzima Bgl II.
Figura 3: electroforesis de ADN 1) puro de Escherichia coli 2) Digerido por la enzima Dde I 3) digerido
con la enzima Bgl II.

Comparación entre los tamaños de las muestras y la escalera 1 Kb de la electroforesis con el tamaño del
manual de la escalera de 1 kb

Discusión:

Tamaños de la figura 2 ya que se puede discutir, la una es pura y las otras dos son con enzimas
diferentes.
CONCLUSIONES

En conclusión se logró realizar la extracción del ADN de bacterias (E. coli) y levadura, a través de
un gel de electroforesis de agarosa.
Logramos aprender y comprender el uso de cada uno de los materiales, equipos y reactivos
empleados en las prácticas.
Las muestras extraídas fueron muy buenas ya que se pudo observar con claridad la escalera de
ADN.

BIBLIOGRAFÍA

Harvey, L., Arnold, B., Paul, M., Chris, K., Monty, K., Matthew, S., & James, D. (2005). Molecular
Cell Biology. New York, Estados Unidos : Médica Panamericana.
Tortora, G., Berdell, F., & Christine, C. (2009). Introduccion a la Microbiología . España: Médica
Panamericana.
Vera, G. (2008). Introducción a la Microbiología. Costa Rica: Universidad Estatal.