MICROBIOLOGÓA GENERAL

Cortes con enzimas de restricción

G.N. Crespin Lay, S.G. Carrillo Morales, P.S. Hernández Ugalde.
202106878, 202011201, 202010468
Curso – Biología Celular y Molecular, Paralelo 100
Facultad de Ciencias de la Vida
Escuela Superior Politécnica del Litoral

e-mail1: gcrespin@espol.edu.ec
e-mail2: shegcarr@espol.edu.ec
e-mail3: pausaher@espol.edu.ec

RESUMEN:

En la presente práctica se estudió la acción de las enzimas de restricción por medio de

experimentaciones, en las que se realizaron cortes en muestras de plásmidos bacterianos

y ADN genómicos para la posterior comparación entre los resultados entre ambas

muestras, de los cuales se obtuvieron como resultado diferentes ubicaciones de

nucleótidos en cada una de las muestras que fueron en los que realizaron los cortes por

estas enzimas de restricción.

I. INTRODUCCIÓN:

Las enzimas de restricción, también conocidas como restrictasas, nucleasas o

endonucleasas, son proteínas capaces de dividir/separar los enlaces fosfodiéster entre los

nucleótidos de los ácidos nucleicos del material genético para poder cortarlos. Las mismas

tienen la facultad de cortar ADN de doble hebra o cadena cuando reconocen un patrón de

secuencia específico como secuencias palindrómicas, estos cortes generan fragmentos de

ADN que recibirán el nombre de “fragmentos de restricción” (Rivera y Maldonado, s.f.).

Estas enzimas de restricción son producidas por organismos procariontes, es decir,

bacterias, con el fin de actuar como un mecanismo de defensa y degradar aquel material

genético extraño que pueda llegar a ingresar a la célula y llegue a causar una infección

vírica, cuya reproducción depende de la información genética de la bacteria (Bioted, s.f.).

Así, cada enzima se caracteriza por su sitio o secuencia de reconocimiento o restricción,

o secuencia diana. Los fragmentos de ADN resultantes se pueden usar para iniciar la

clonación de células o la clonación acelular, con el objetivo de analizar el ADN, el mapeo

de restricción física o la detección de polimorfismos. El mecanismo de defensa es el

siguiente: el propio ADN de la bacteria se metila de una manera específica que es

característica de cada especie bacteriana (en secuencias reconocidas por las enzimas de

restricción y metilasas de esa especie) (Luque y Herraéz, 2002).

Los diferentes tipos de enzimas de restricción se dividen en tres familias según sus

propiedades: tipo I, tipo II y tipo III, siendo las del tipo II las de mayor interés para su

estudio y utilidad en el campo de la biología molecular (NIH, 2022).

OBJETIVO GENERAL:

o Realizar cortes con enzimas de restricción de muestras de ADN genómicos y

plásmidos bacterianos, donde se podrán observar varios fragmentos y diferenciar

los resultados entre ambos tipos de muestras.

OBJETIVOS ESPECIFICOS:

o Colocar los reactivos necesarios para la preparación de los tubos con las muestras

de ADN y plásmidos por equipos, los cuales contengan un volumen final de 20 𝜇𝑙.

o Identificar los sitios de restricción de los 4 plásmidos por medio de su comparación

con el mapa de restricción facilitado por el docente.

II. MÉTODOS:

Detalles experimentales:

Se realizaron cortes con enzimas de restricción de muestras de ADN genómicos y

plásmidos bacterianos, donde se podrán observar varios fragmentos y diferenciar los

resultados entre ambos tipos de muestras.

Materiales:

Bacterias

• Eco RiI

• Hind III

Reactivos

• Enzima Bam HI

• Buffer

• ADN

• H2O

• BSA
PROCEDIMIENTO

1. Tener dos tubos para la preparación, uno para el ADN genómico y otro para el

plásmido.

2. Verificar las cantidades a poner en la solución

Reactivos Cantidad (Concentración 1X)

Buffer 2.0 micro l
BSA 0.2 micro l
ADN 5.0 micro l
Enzima 0.5 micro l
H2O 12.3 micro l
Volumen final 20 micro l

3. Colocar 12 micro l de agua en ambos tubos.

4. Colocar 2 micro l del buffer.

5. Colocar los 5 micro l e ADN genómico en un tubo y la enzima de restricción Bam

HI.

6. La solución anterior, balancear y realizar un spin en la centrifuga.

7. Colocar el plásmido en el otro tubo.

8. Mezclar el contenido de los tubos por pipeteo.

9. Insertar las soluciones en el termociclador con el siguiente programa:

TIEMPO TEMPERATURA
3 horas 30 °C
20 min 65° C
Hold 4°C

10. Correr el resultado en gel de agarosa y examinar los resultados.

III. RESULTADOS EXPERIMENTALES:

En el plásmido pC1300 la enzima de restricción que realiza el corte en EcoRI es el

nucleótido 8959. En el plásmido pGL4 la enzima de restricción que realiza el corte en

HindIII es el nucleótido 65. En el plásmido pES1 la enzima de restricción que realiza el

corte en HindIII es en el nucleótido 399.

En el pGL4 HindIII tiene un sitio de restricción a 65 nucleótidos, lo cual se puede observar

al final de la banda como si estuviera degradado, ya que es un valor pequeño. El fragmento

más grande se encuentra aproximadamente a 1000pb.

En el control del plásmido pC1300 y pES1 el ADN se degradó, el vector se hizo pedazos

y no se puede observar en el gel de agarosa.

El pES1 que fue cortado con HindIII tiene una banda con un fragmento a 400pb y el

fragmento más grande se encuentre aproximadamente a 1000pb.

IV. CONCLUSIONES:

• No se logró obtener el resultado esperado, ya que al momento de realizar la

práctica hubo varios errores de contaminación y pipeteo.

• El resultado no se encontraba visible en el gel de agarosa, por cual para realizar

esta práctica.

VI. ANEXOS

VII. REFERENCIAS:

Rivera, O., y Maldonado, J. (s.f.). Enzimas de restricción. Laboratorio 12: Enzimas de

Restricción y Electroforesis de DNA.
https://academic.uprm.edu/~jvelezg/EnzimasDNA.htm
Luque, J; Herráez, A. 2002. Texto Ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética,
conceptos, técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud. Primera edición.
Elsevier Science. Madrid, España.

Bioted. (s.f.). Introducción a los enzimas de restricción. Bioted.

https://www.bioted.es/protocolos/INTRODUCCION-ENZ-
RESTRICCION.pdf

NIH. (18 de agosto del 2022). Enzima de restricción. National Human Genome
Research Institute. https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Enzima-de-
restriccion