Licenciatura en Ingeniería en Alimentos y Biotecnología Elaboró: Profesor

Raúl Snell Castro Asignatura: Introducción a la biotecnología

Versión: v1 24/02/2017

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GUIA DE LA LECTURA

Producción por ingeniería genética de hormonas del crecimiento animal Hugo A. Barrera Saldaña,
Jorge A. Ascacio Martínez, Hugo L. Gallardo Blanco, Jorge M. Reyes Ruiz y Celia N. Sánchez
Domínguez

Investigar sobre las hormonas y específicamente las hormonas del crecimiento animales.
2. Analizar la Tabla 1, entendiendo los textos e ideas mencionadas.
3. En el apartado 4 mencionan la frase animales filogenéticamente inferiores, ¿qué significa esa
frase?
4. ¿Cómo funciona el sistema de expresión en Pichia pastoris.
5. ¿Qué función tiene el metanol en ese sistema de expresión?
6. ¿Qué es un promotor y para qué sirve en las células vivas?
7. ¿Para qué pusieron el promotor de la alcohol oxidasa (AOX1) en el vector donde insertaron
el gen de alguna hormona del crecimiento?
8. Investiga todas las secuencias que forman el vector de expresión de la figura 7.
9. ¿Qué muestran en la figura 8?
10. ¿Cuál es la metodología indicada en la figura 9?
11. Relata cómo se verificó la integración del casette al genoma de la levadura (figura 14).
12. ¿Cómo se induce la producción de la hormona del crecimiento animal en la levadura?
Ver figura 15.
1. En una caja petri se hace una siembra con Pichia pastoris productora de XGH (cualquier
hormona de crecimiento)
2. Para ensayar la fermentación de las clonas, se inoculó una colonia de cada cepa en el medio de
cultivo apropiado y se incubó a 30º C y 250 r.p.m. por 24 a 48 horas para la primera etapa de
crecimiento, hasta alcanzar una biomasa a una D.O. a 600 nm de 10.
3. Para la segunda etapa, que es la de inducción de la producción de la hormona recombinante, se
cosecharon las levaduras y el paquete celular se resuspendió en un medio con metanol a la
concentración apropiada. La inducción se mantuvo añadiendo metanol cada 24 h., para
compensar su pérdida por evaporación. Se monitoreó el crecimiento registrando la D.O. a 600
nm a lo largo del experimento, el cual duró alrededor de 100 h.
4. Por ultimo se realiza una tabla “Cinetica de crecimiento bajo induccion” relacionando el timepo
en horas y la D.O a 600nm.

NOTA:
Todas las cepas se crecieron para adquirir biomasa en medio BMGY (amortiguador de citratos 100 mM
a pH de 5.0, peptona al 2%, extracto de levadura al 1%, NBY al 1.34% y glicerol al 1%) y para su
inducción se transfirieron a medio nuevo conteniendo metanol al 1% en lugar de glicerol (BMMY=
amortiguador de citratos 100 mM a pH de 5.0, peptona al 2%, extracto de levadura al 1%, NBY al
1.34% y metanol al 1%).
 13. ¿Qué muestran el la figura 16?
Se logra la construcción de los vectores de expresión portadores de los ADNc de BGH, CHGH, CFGH,
ECGH y FCGH, como fue evidenciado mediante la caracterización de sus ADNs plasmídicos con
enzimas de restricción. Por medio de un aPCR dichas caracterizaciones se presentan en el gel de ña
figura 16

En este caso se hace un tamizaje para pPIC9bGH con ayuda del Gel de Agarosa al 1% de la
caracterización del ADN plasmídico de las clonas tamizadas mediante la enzima Bgl II. M: marcador
de peso molecular, 1: pPIC9K. Las clonas que resultaron positivas fueron la 2, 3, 5, 6, 11, 12, 14, 15,
17, 19, 20, 21 y la 22.
(se hace una comparacion entre la linea de M (que es la pPIC9bGH) y las demas filas)

14. ¿Qué es un fibroblasto de ratón?

• Es un tipo de celula residente del tejido conectivo (conjunto heterogeneo de tejidos organicos
cuya funcion primordial es de sosten e integracion sistematica del organismo)
• Sus celulas proporcionan una etsructura en forma de entramado (estroma: tejido de sosten o
soporte de tejido que cumplen la funcion especifica de un organo) a muy diversos tejidos y
juegan un papel crucial en la curacion de heridas, siendo las celulas mas comunes del tejidos
conectivo.
• Hay dos tipos celulares los fibroblastos y los fibrocitos
• Fibroblastos:celulas activas con gran produccion y secrecion, sintetizan colagrno y
glucosaminoglucanos de la matriz extracelular. Migran y proliferan durante la cicatrizacion de
heridas.
• Es el encargado d elas sintesis de todas las fibras del tejido conjuntivo incluyendo reticulares,
colagenas y elasticas.
• Ejemplo: en los caos de cicatrizacion algunos fibroblastos incluyen miofibrillas y se denominan
entonces miofibroblastos, dado que adquieren cierta similitud con las células musculares. Algunas evidencias
sugieren que los miofibroblastos están en condiciones de contraerse y así desempeñar un papel.
• CONCLUSION: celulas adultas de la piel de ratones.

15. Investiga sobre la enzima glicerol 3 fosfato deshidrogenasa (GPDH).

La enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (NAD+) (EC 1.1.1.8) catalizala reacción de oxidación del
glicerol-3-fosfato a dihidroxiacetona fosfato utilizando NAD+como aceptor de electrones.

Lanzadera de electrones del glicerol-3-fosfato

Durante la glicolisis (es la encargada de oxidar la glucosa con la finalidad de obtener energía para la
célula) se genera NADH en el citosol en la oxidación del gliceraldehído-3-fosfato y se debe regenerar
más NAD+ para que lruta metabólicaa glicólisis continue. El NADH no puede pasar a la mitocondria para
ser oxidado por la cadena respiratoria ya que la membrana interior mitocondrial es impermeable al NADH
y NAD+. La solución es que los electrones del NADH, en vez del propio NADH, sean transportados a
través de esta membrana.
Una de las maneras de introducir electrones del NADH en la cadena respiratoria es la lanzadera del
glicerol-3-fosfato.
En el caso del documento La GPDH es una enzima clave en la lipogénesis(es la reacción bioquímica
por la cual son sintetizados los ácidos grasos de cadena larga esterificados (unidos con el
glicerol) para formar triglicéridos o grasas de reserva) La unidad enzimática para la GPDH está
definida como la conversión de 1 µmol de DHAP (Dihidroxiacetona Fosfato) a GP (glicerol fosfato) por min
a pH 7.4 y a 25ºC. Se lleva a cabo una oxidación del NADH (Nicotinamida adenina dinucleótido reducido)
a NAD (Nicotinamida adenina dinucleótido oxidado). La presencia de NADH en la reacción puede ser
medida por la absorción a 340 nm; el decremento en la absorción indica la oxidación del NADH a NAD.
El resultado se multiplicó por 1000 y se obtuvo la actividad específica en miliunidades de GPDH por μg de
proteína.

16. ¿Qué es un control negativo?

El control científico negativo es el proceso que consiste en utilizar el grupo de control para asegurarse de que ninguna
variable de confusion haya afectado los resultados o eliminar las posibles fuentes de sesgo. Se utiliza una muestra que
no se espera que funcione.

En el ejemplo de los antibióticos, el grupo de control negativo sería un plato de Petri sin antibiótico, lo que permite al
investigador demostrar que los resultados son validosy que no hay variables de confusión.
Si todos los medicamentos nuevos funcionaron pero el grupo de control negativo también mostró inhibición del
crecimiento bacteriano, entonces alguna otra variable podría haber tenido un efecto, invalidando los resultados.
Un control negativo también puede ser una forma de establecer un punto de referencia.

17. ¿Qué muestran en la tabla 6 y figura 22 sobre la actividad de la hormona de

crecimiento?
La tabla 6 muestra los resultados obtenidos en ensayos efectuados sobre la CHGH, los cuales estan
divididos en tres partes:
1. concentracion molar utilizada de la CHGH en algunas incliyendo suero fetal bovino (SFB).
2. Cantidad de proteina encontrada en los extractos celulares (3T3 F442A)
3. La actividad especifica de la GPDH
En la cual la muestra con una concentracion molar de 1x10-7 se comportó de manera muy similar al
control positivo, mostrando una mayor cantidad de proteínas.

Las concentraciones de 1X10-9 hasta 1X10-15 M mostraron un comportamiento muy similar al control
negativo. Por lo tanto, la cantidad de proteína encontrada en los extractos celulares varió de manera
significativa en las células que fueron expuestas a las mayores concentraciones de GH y SFB 10%. que
fue el control positivo.

En la figura 22 se muestran los resultados en donde solo la concentracion molar de 1x10-7 mostró una
actividad específica evidentemente mayor en comparación con el control negativo, y la concentración
molar de 1X10-8 mostró una actividad específica ligeramente mayor en comparación con el control
negativo. Las concentraciones de 1X10-9 a 1X10-15 mostraron una actividad específica baja
comparable con el control negativo (resultados no mostrados).
Muetsra la actividad especifica de la GDPH en base a la concentracion molar de la CHGH en donde se
puede ver que la cantidad de actividad específica fue directamente proporcional a la concentración
molar de la proteína usada.