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Laboratorio de biología molecular

Practica 6. Espectrofotometría
Resumen: La espectrofotometría es un método científico utilizado para medir cuanta luz absorbe
una sustancia química, midiendo la intensidad de la luz cuando un haz luminoso pasa a través de la
solución muestra, basándose en la Ley de Beer-Lambert. Esta medición también puede usarse para
medir la cantidad de un producto químico conocido en una sustancia.

1.0 Introducción.

La espectrofotometría es un método científico Los instrumentos de trayectoria corta se utilizan


basado en la absorción de luz por una sustancia, y cuando la muestra es de volumen limitado, escasa y tal
aprovecha las dos leyes de absorción de luz. La vez requiere recuperación, o está muy concentrado (por
proporción de luz absorbida por un medio es ejemplo,> 50 µg de ADN / ml), y el usuario desea evitar
independiente de la intensidad de la luz incidente. Una la necesidad de dilución.3 Muchas muestras
muestra que absorba el 75% (25% de transmitancia) de tradicionalmente requerirían dilución por dos razones:
la luz siempre absorberá el 75% de la luz, no importa la
fuerza de la fuente de luz.1 1. Para que haya suficiente volumen para llenar una
cubeta de longitud de trayectoria de 10 mm.
La ley de Lambert se expresa como I / Io = T 2. Bajar la concentración de la muestra lo suficiente
Donde I = Intensidad de la luz transmitida. para permitir una medición precisa por el
Io = Intensidad de la luz incidente. espectrofotómetro.
T = Transmitancia

Esto permite que diferentes espectrofotómetros con


diferentes fuentes de luz produzcan lecturas de absorción
independientes de la potencia de la fuente de luz (Fig. 1).
La absorbancia de la luz es directamente proporcional
tanto a la concentración de la absorción del medio y el
grosor del medio. En espectrofotometría el espesor del
medio se llama la longitud del camino. En los
instrumentos normales basados en cubetas, la longitud
del camino es de 10 mm. La ley de la cerveza nos
permite medir muestras de diferentes longitudes de ruta,
y comparar los resultados directamente entre sí.2
Figura 2. Esquema general del uso del
espectofotometro.

La dilución introduce un aspecto de error humano y


también puede evitar el uso de esa muestra en
aplicaciones posteriores. Para medir muestras
concentradas usando una longitud de trayectoria de 10
mm se requeriría un muy potente fuente de luz para
proporcionar una transmitancia lo suficientemente alta
como para ser detectada de manera confiable. Un cortoa
longitud de trayectoria reduce la absorbancia, aumenta la
transmitancia y, por lo tanto, reduce la luz incidente
requerida para lograr un resultado confiable. Esto
Figura 1. Espectro electromagnético.
elimina la necesidad de diluir la muestra, o tener un 1.2 Procedimiento
instrumento más grande, más potente o más caro.4
Preparar las siguientes soluciones del colorante y
Cuando se usan longitudes de ruta cortas (menos de por medio del espectrofotómetro medir la absorbancia de
10 mm), los resultados generalmente se normalizan a eso cada una de ellas.
de una longitud de recorrido de 10 mm, p. ej. En el caso
de una longitud de recorrido de 0.2 mm, los resultados Concentración de Absorbancia
de absorbancia son multiplicado por 50. Sin embargo, al colorante
mismo tiempo, cualquier error del sistema de absorción 0
por parte de la cubeta también se multiplica por 50, lo 0.1ppm
que aumenta el posible efecto sobre el resultado. 0.25ppm
0.33ppm
La espectrofotometría se puede utilizar para estimar 0.5ppm
la concentración de ADN o ARN y para analizar la 0.6ppm
pureza de la preparación. Las longitudes de onda típicas 0.7ppm
para la medición son 260 nm y 280 nm. Además, las 0.85ppm
mediciones a 230 nm y 320 nm pueden proporcionar 1ppm
información adicional. Las purinas y pirimidinas en los
ácidos nucleicos naturalmente absorben la luz a 260 nm.
Medir la absorbancia de las dos soluciones
Para muestras puras está bien documentado que para problemas.
una longitud de trayectoria de 10 mm, una absorción de
1A unidad es igual a una concentración de 50 µg / ml de Por medio de los resultados construir la curva de
ADN y 40 µg / ml de ARN. Para los oligonucleótidos la
calibración para el colorante. Obtener las ecuaciones
concentración es de alrededor de 33 µg / ml, pero esto
puede variar con la longitud y la secuencia de bases. para poder calcular la concentraciones de la soluciones
problemas.
Absorción es la cantidad de luz que una sustancia
absorbe y no permite que pase eso. Los 2.0 Referencias
espectrofotómetros en realidad miden la transmisión, la 1. J.H. Lambert, (1760) Photometria sive de
cantidad de luz que pasa a través de una muestra, pero mensura et gradibus luminis, colorum et umbrae
esto se convierte en absorción comparando la salida del [Photometry, or, On the measure and gradations
bulbo con la luz que ha pasado por la muestra. of light, colors, and shade] (Augsburg (“Augusta
Vindelicorum”), Germany: Eberhardt Klett).
El ancho de banda describe la propiedad de la luz 2. 2. Beer (1852) Bestimmung der Absorption des
emitida por el monocromador. Cuando se analiza la luz,
el pico puede estar en su máximo en la longitud de onda rothen Lichts in farbigen Flüssigkeiten
especificada, pero la luz también es emitida en menor (Determination of the absorption of red light in
medida en las longitudes de onda a cada lado de la colored liquids), Annalen der Physik und
seleccionada. El espectral el ancho de banda es una Chemie, vol. 86, pp. 78–88.
medida del ancho de un pico a intensidad de media luz.5 3. 3. Warburg, O. and Christian, W. (1942)
Isolierung und Kristallisation des
Por medio de la técnica de espectofotometría se Garungsferments Enolase. Biochem. Z. 310:384-
podrá construir una curva de calibración para determinar
421.
la concentración de un colorante que puede servir como
sensor colorimetrico. 4. 4. Smith, P.K., et al. (1985). “Measurement of
protein using bicinchoninic acid”. Anal.
Metodología Biochem. 150 (1): 76–85. 3843705.
5. 5. Layne, E. (1957) Spectrophotometric and
1.1 Materiales Turbidimetric Methods for Measuring Proteins.
Methods in Enzymology 10: 447-455.
1 Piseta con agua destilada
7 Matraces aforados 50mL
5 Vasos de precipitados de 25mL