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UNIVERSIDAD DE LA SERENA BIOQUÍMICA - LABORATORIO

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICO LABORATORISTA


DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA PROFESORA CARLA MATURANA V.

Cuantificación de ácidos nucleicos (ADN, ARN)


en sedimentos marinos, utilizando
el método espectrofotométrico.

Integrantes:
Matías Godoy Cuellar
Catalina Rojas Varas
Introducción:
• En este estudio, comparamos tres métodos para la extracción y cuantificación
de ARN y ADN de sedimentos marinos: método espectrofotométrico, método
fluorimétrico y el método de cromatografía líquida de alta presión (HPLC).

• Para llevar a cabo este estudio se recolectaron muestras de sedimentos en el


mar oligotrófico de Creta (Mediterráneo oriental, de 40 a 1540 m de
profundidad) ), utilizando un multicorer, en siete estaciones ubicadas a lo largo
de un transecto de profundidades 40, 100, 200, 500, 700, 900 y 1,540 m y se
compararon con la distribución y composición de los conjuntos microbianos
bentónicos (es decir, bacterias y micro protozoos).

• Para la determinación de ácidos nucleicos en los sedimentos nos enfocaremos


principalmente en el método espectrofotométrico, basado en la absorbancia
específica de ácidos nucleicos y el ensayo de la fenilamina.
Conocer el método espectrofotométrico
para la cuantificación de ácidos
nucleicos.

Comparar los resultados de la


• Objetivos cuantificación de ácidos
obtenidos utilizando los tres
nucleicos
métodos
mencionados anteriormente.

Explorar las relaciones entre los


patrones ARN/ADN.
Métodos de
cuantificación y su
fundamento

Espectrofotométrico Fluorimétrico HPLC

Utiliza fluorocromos Utiliza una columna


Utiliza el ensayo de selectivos (naranja especifica para
difenilamina de tiazol para ácidos separar el ARN y el
nucleicos totales y ADN y la absorción
Hoechst 33258 para UV de los ácidos
el ADN) nucleicos
Diseño experimental
Antes del análisis:
• Se eliminaron de las muestras los organismos macroscópicos más grandes. Todos los materiales
utilizados para el análisis de ácidos nucleicos se limpiaron cuidadosamente sumergiéndolos en
NaOH 1 N, HCl al 10% y Agua MilliQ para eliminar la contaminación de materia orgánica.
• Posteriormente se hizo un tratamiento para evitar la contaminación por nucleasas.
Diseño experimental
Procedimiento:
• Se trató 1 g de sedimento (tres réplicas) con 3,0 ml de ácido perclórico 0,5 N, se agitó durante 3 min
y se sonico tres veces durante 1 min (con intervalos de 30 s).

• La extracción de ácido nucleico se llevó a cabo a 75 ° C durante 30 min con agitación continua. 

• Después de la centrifugación (3.000 × g, 10 min), se midió la absorbancia del contenido total de
ácido nucleico (ATN) en el sobrenadante a 260 nm. La absorbancia del ADN se determinó con una
reacción activada por luz de difenilamina (2% en ácido acético) (40 W, 12 h) a 598 nm y se convirtió
a concentración, usando soluciones estándar de ADN de timo de ternera. 
• Luego se informó la concentración de ADN como equivalente a la
absorbancia a 260 nm para calcular por diferencia la absorbancia
debida al ARN: ABS ARN = ABS ATN - ABS ADN

• La absorbancia de ARN (260 nm) se convirtió luego en


concentración, usando soluciones estándar de ARN de levadura de
panadería

• Dado que la absorbancia de ATN a 260 nm podría verse afectada por


la interferencia debida a compuestos inorgánicos, se utilizaron
submuestras de sedimento, previamente tratadas en un horno de
mufla (550 ° C, 4 h) como blancos.

•  La sensibilidad del método se ha probado con estándares de ADN y


ARN (precisión de ± 1,0 μg) y parece adecuado para investigaciones
de campo.
Resultados
Concentraciones de ADN, ARN y proporciones de ARN/ADN a diferentes
profundidades.

Método
Método fluorimétrico Método HPLC
espectrofotométrico

Profundidad(m)

Promedio
Análisis
Gráfico concentraciones promedio de ADN y ARN obtenidas de los tres métodos.
Métodos ADN promedio, ARN promedio
μg g -1 ug μg-1

ADN, ARN promedio, ug g-1


Espectrofotométrico 30.9 11.1

Fluorimétrico 10.3 8.4


Concentraciones promedio de ADN y ARN obtenidas de los diferentes métodos
HPLC 33.7 7.1
40

35 33.7

30.9
30

25

20
ADN
15
ARN
11.1
10.3
10 8.4
7.1

0
Método Método Fluorimétrico Método HPLC
Espectrofotométrico
Gráfico relación ARN/ADN obtenida de los tres métodos a diferentes profundidades

Proporciones ARN/ADN de los tres métodos a diferentes profundidades


2.5

1.5
ARN/ADN

Espectrofotométrico

1 Fluorimétrico

HPLC
0.5

0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Profundidad del mar(m)


Tabla comparativa con las respectivas ventajas y desventajas de
cada método.
Método Ventajas Desventajas

- Las determinaciones de difenilamina no se ven - No es posible cuantificar por separado ADN, y


Espectrofotométrico relativamente afectadas por la composición de la ARN.
base del ADN.

- El rendimiento de fluorescencia del complejo


Hoechst-ADN depende en gran medida de la
composición y estructura de ADN. 
Fluorimétrico - Utilizando naranja de tiazol, existe un mejor  
rendimiento, con respecto a Hoechst. - Obtiene la concentración de ARN por
diferencia y, por lo tanto, pueden estar
sesgados por las estimaciones de ADN.

-Proporciona evaluaciones independientes de las - Más costoso.


HPLC concentraciones de ARN y ADN.
  - Mayor sensibilidad.
Relación ARN / ADN en correspondencia con las
ARN/ADN
limitaciones ambientales
• La disminución de las concentraciones de ARN a lo largo de la
plataforma y la pendiente de Creta refleja una disminución en la actividad
Limitaciones
ambientales metabólica bentónica.
• Dado que la meiofauna y la macrofauna por debajo de los 100 m de
profundidad representan en conjunto menos del 10% de la biomasa
Actividad metabólica de bentónica total, la mayor parte de la actividad metabólica en los
organismos acuáticos
sedimentos más profundos será microbiana.

Crecimiento instantáneo de
organismos acuáticos*
Menor
Menor gasto Menor relación
actividad
energético ARN/ ADN
metabólica

Conclusión
El método espectrofotométrico utilizado para cuantificar ácidos nucleicos demostró ser un método
sencillo y eficaz para llevar a cabo el estudio, también es muy utilizado para este tipo de
cuantificaciones.
• La limitación que posee este método es que no es posible cuantificar por separado ADN y ARN, pero
a pesar de ello, las concentraciones de ADN medidas espectrofotométricamente y por HPLC no
fueron significativamente diferentes.
• Dado que las concentraciones de ARN determinadas por este método se calculan por diferencia, las
estimaciones de ARN podrían estar sesgadas por las estimaciones de ATN y ADN.
Gracias por su atención

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