Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Bioquímica y Biología Molecular
“CARACTERIZACON ESPECTROFOTOMETRICA DE ADN, HIDROLISIS
DE ACIDOS NUCLEICOS E IDENTIFICACION POR CROMATOGRAFIA
EN CAPA FINA”
Juárez Castillón Luis Enrique Moreno Hernández Leonardo
Grupo 3IV1 Sección 4
Introducción: •ADN monocatenario: c(pmol/µl) = A260/0,027
• ADN bicatenario: c(pmol/µl) = A260/0,020
Los ácidos nucleicos constituyen el material genético de los • ARN monocatenario: c(pmol/µl) = A260/0,025
organismos y son necesarios para el almacenamiento y la • Oligonucleótido: c(pmol/µl) = A260100/1,5NA+0,71NC+1,20NG
expresión de la información genética. Existen dos tipos de + 0,84NT
ácidos nucleicos química y estructuralmente distintos: ADN y
ARN.
Objetivo:
El ADN funciona como almacén de la información genética y
se localiza en los cromosomas del núcleo, mitocondrias y
cloroplastos de las células eucariotas. En las células Separar las bases nitrogenadas del RNA y DNA por
procariotas el ADN se encuentra en su único cromosoma y, cromatografía en capa fina a partir de hidrolizados de los mismos
de manera extracromosómica, en forma de plásmidos. identificándolas por la propiedad que tienen de absorber la luz
Mientras que el ARN interviene en la transferencia de la UV.
información contenida en el ADN hacia los compartimientos
celulares. Se encuentra en el núcleo, el citoplasma, la matriz Esquema a escala del cromatograma obtenido:
mitocondrial y el estroma de cloroplastos de células
eucariotas y en el citosol de células procariotas.
La unidad básica de los ácidos nucleicos es el nucleótido, una
molécula orgánica compuesta por tres componentes:
.
•Base nitrogenada, una purina o pirimidina.
•Pentosa, una ribosa o desoxirribosa según el ácido nucleico.
•Grupo fosfato, causante de las cargas negativas de los
ácidos nucleicos y que le brinda características ácidas.

Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría

El ADN y ARN, pueden cuantificarse directamente en
soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la
absorbancia de luz ultravioleta, (también puede hacerse en el
intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene
cantidades significativas de contaminantes como proteínas,
fenol o agarosa, la medición espectrofotométrica de la
irradiación ultravioleta absorbida por las bases es sencilla y
exacta.
La concentración de ácidos nucleicos suele determinarse
midiendo a 260 nm y comparando con un blanco. La
interferencia de contaminantes puede determinarse
calculando un cociente. Dado que las proteínas absorben a
280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la
pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes respectivos del
ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una Resultados:
absorción a 230 nm significa que la muestra está contaminada
con hidratos de carbono, péptidos, fenoles, compuestos Concentración de ADN obtenido en g/ml
aromáticos u otras sustancias.
El espectrofotómetro se fundamenta en la transmisión de la
luz a través de una solución para determinar la concentración
de un soluto presente en la misma. Cada molécula absorbe la
energía radiante a una longitud de onda específica, a partir de
la cual es posible extrapolar la concentración de un soluto en
una solución
La concentración C de un ácido nucleico determinado
presente en una solución se calcula conforme a las 2.1825 ≈ 2
ecuaciones siguientes:
En base a los valores indicativos de pureza en muestras de concentración de ADN de C=2.1825 g/ml y compararlo con los
ADN: valores de la tabla, nuestro valor es ˃2.1 lo que indica que
Radio Valor Pureza nuestra muestra tiene contaminación por ARN. Además se utilizó
el Nomograma para la determinación de concentración de ADN
As260 / As280 1.8 - 2 ADN de pureza el cual no es un método exacto porque depende mucho del trazo
que se realice , pero es un método mucho más rápido para sacar
óptima
resultados aproximados, en este método obtuvimos una
1.6 – 1.8 ADN pureza
concentración de ADN de 0.043mg/ml y 0.01mg/ml para
aceptable
proteínas, y al multiplicar por nuestro factor de dilución nos da
<1.6 Presencia de para concentración de ADN 1.72*10-3g/ml el cual es parecido al
compuestos que obtuvimos mediante la fórmula de absorbancias
aromáticos
˃2.1 Contaminación con
ARN
As260 / As 230 <1.5 Contaminación con que fue un valor de concentración de
sales, carbohidratos, Para la cromatografía se utilizó DNA y RNA pool de los cuales se
fenoles colocaron 3 aplicaciones sobre el cromatograma, y también se
colocaron 3 aplicaciones de las cada base nitrogenada. Se
desarrolló la placa de cromatografía, utilizando como fase móvil
una mezcla de butanol: ácido acético: agua (5:2:3 v/v/v). ). Una
vez desarrollado el cromatograma se revelo por exposición a la
luz ultravioleta en un cuarto oscuro, donde Las bases que
observamos en el caso de DNA y RNA pool en la cromatografía
al revelarlas con luz UV, fueron para ADN un parecido en el
Concentración de ADN mediante nomograma corrimiento con las manchas de Adenina, Guanina, Citosina y
Timina y en ARN con Adenina Guanina Citosina y Uracilo, todo
Para esto basándonos en los Rf de cada muestra y comparándolos
proteína=0.01mg/ml con nuestros testigos puros de cada base nitrogenada.
Para ácido nucleico
=0.043mg/ml Conclusión:
Multiplicando por el
factor de dilución para
Se comprobó la presencia de las bases nitrogenadas específicas
ácido nucleico
para RNA y DNA a partir de la propiedad que tienen estas para
C= 1.72mg/ml =
absorber la luz ultravioleta.
1.72*10-3g/ml
El DNA tiene un máximo de absorción a una longitud de onda de
260 nm, las proteínas a 280nm y algunos fosfolípidos a 210nm.
Muestra Rf El DNA presente en nuestra muestra no se encontraba 100%
ADN pool 0.7079 puro ya que tenía presencia de proteínas y algunos fosfolípidos
presentes en las células de la espinaca desde un principio.
ARN pool 0.6395
Adenina 0.5277 Bibliografía:
Timina 0.6941
Citosina 0.4120 •Voet Donald, “Fundamentos de Bioquímica”, Editorial Médica
Panamericana, 2ª Edición, 2007, Madrid, España. pp ( 176-183)
Guanina 0.4910 •Lehninger Albert L. PRINCIPIOS BIOQUÍMICA. 2ª Edición.
Uracilo 0.6391 Ediciones Omega. (p.584).

Rf= distancia recorrida por el producto/distancia recorrida por

la fase móvil

Discusión:

Se obtuvieron las absorbancias del extracto de ADN a

diferentes longitudes de onda, el espectro de absorbencia
del ADN puro tiene un máximo de absorción a una longitud
de onda de 260nm correspondiente a ácidos nucleicos y una
longitud de onda de 280 correspondiente para proteínas o
enlaces peptídicos. Mediante estos valores de absorbancia
se determinó la concentración de ADN que había presente
en nuestra muestra el cual nos dio un valor de 2.18255 g/ml
usando la formula presente en el apartado de cálculos y en
base a los valores indicativos de pureza en muestras de
ADN nuestra muestra al haber obtenido un valor de