TEMA 2: REPLICACION DEL DNA EN EUCARIOTAS

1.PROCARIOTAS VS EUCARIOTAS:

2.PROTEÍNAS CONSERVADAS:

Proteínas celulares → se analizaron por virus SV40, la dif es q tienen un único ori y sus protes
iniciadoras y la helicasas (antígeno T) son distintas. Se determinaron x el experimento de Kelly y
Stillman, en el q emplearon el DNA viral, el antígeno T, ATP marcado en el P alfa y extractos de cels
eucariotas. El genoma del virus se integra en el genoma de la cel q infecta y la replicación se da
conjunta en la fase S.

Las proteínas q destacan:

 2 DNApol equivalentes a la III →

 Épsilon → elonga la hebra continua. Procesividad media q aumenta con la pinza. 
Delta → elonga la hebra discontinua con act de desplazamiento de banda.
 DNApol alfa/primasa → sintetiza el primer, es compleja con 2 subud. comete más errores
ya q no tiene act proofreading.

Síntesis del primer mixto (RNA por la subud primasa y DNA por la subud de la pol alfa).

La DNA pol alfa primasa → sintetiza el primer en ambas hebras → alta tasa de error (sin act
exonucleasa), y está formada por varias subud: una con act exonucleasa, dos subud con act
primasa (RNApol), una subud para ensamblar la enzima y su primer son 10 nt de RNA y 20-30 de
DNA → baja procesividad (cuando sintetiza el primer se cae).

 RFC → gamma complex (cargador de la pinza)

 PCNA → pinza deslizante → factor de procesividad y marcador de proliferación →
tiene 3 subud.
 MCM 2-7 → DNA helicasa
 RPA → SSB

3.ORIGEN DE REPLICACIÓN:

Estructura conservada, no hay orígenes de replicación en eucariotas superiores. Hay de E. coli, del
sv40 y de S. Cerevisiae → eucariota con muchos oris llamados ARS → fragmento q permite la
replicación autónoma de DNA, los reconoce el complejo ORC y son modulares.

Se caracterizan por secuencia, estructura, cromatina o transcripción. En eucariotas superiores no

hay secuencia definida, en inferiores hay zonas equivalentes a DUE, islas CpG y regiones ricas en
AT. En cuanto a estructura: DNA plegado (o cruciforme) o formación de bucles. Y en cuento a la
cromatina: se acetilan histonas, se generan zonas libres de nucleosomas (NFRs) y sitios sensibles a
Dnasa I. Además, poseen sitios cercanos implicados en la transcripción.

En cada ori se genera una hebra libre y otra rezagada, en ambas hay primers mixtos (DNApol α
primasa) → tras el primer, se recluta la DNA pol delta y épsilon → no hay terminación, las
horquillas se juntan.

Los pre-RC (pre-replication complexes), se unen a los oris en la fase G1 y la replicación comienza en
la fase S. La selección del orden de activación se da en la fase S y depende del tejido o entorno.

El orden de activación se debe a los tipos de origen:

 Constitutivo → siempre en la misma posición y siempre se emplean sin importar las

condiciones de la cel. Hay pocos.
 Inactivo o latente → no se suelen activar, son de emergencia, si se activan es durante
estrés replicativo o cuando se bloquee la replicación en otro origen.
 Flexible → son los más frecuentes, dependen del tipo celular y de las condiciones
ambientales (aumenta el no de oris por cluster de replicación).

Son interconvertibles, los inactivos ante estrés celular se convierten en flexibles, y los
flexibles en constitutivos por diferenciación.

Fases del ciclo celular → profase, metafase, anafase y telofase. Los ori se definen durante
la mitosis G1, se activan solo en la fase S y en G2 se inactiva para q no vuelvan atrás.

Niveles de organización:

1. Los PRE-RC van a todos lo oris, se activen o no y se ensamblan → formando la ud. de

replicación.
2. Ud. de replicación o replicón → contienen varios PRE-RC potenciales, de los q usara uno, y
el resto se reprimen (interferencia de origen negativo).
3. Los PRE-RC activos se sitúan juntos generando un dominio/cluster de replicación
(interferencia positiva), y durante su formación se forman bucles.

Ante situaciones de estrés en el cluster, uno inactivo se activa gracias al resto.

Los oris se activan de forma programada lo largo de la fase S. En cuanto a su disposición: los de rep
temprana se sitúan en el interior y los tardías en la periferia asociados a láminas nucleares →
cuando eliminas las láminas se inhibe la elongación, no están implicadas en la asociación de los
PRE-RC.

4.INICIACIÓN:

La replicación se da en 2 pasos en distintas fases del ciclo cel: G1 (carga) y S (activación).

Primero se selecciona el replicador (ori) o “licensing” (origin decisión point, ODP) → se identifican
las secuencias q van a dirigir la replicación (G1) → formación y ensamblaje de PRE-RC → cargador
de helicasa y helicasa.

Después se activan de oris → inicio de polimerización (apertura de la doble hélice y comienzo de

replic) (S) → activación de PRE-RC. (En procariotas la selección del replicador estaba acoplada a la
apertura de la doble hélice y el comienzo de la rep, en eucariotas se separan los procesos).
Prote iniciadora: ORC (origin recognition complex), equivalente a DnaA → complejo de 6 protes q
hidroliza ATP y recluta a otras helicasas, se une a ARS (autologous replication requence)
reconociendo los elementos A y B1.

Ensamblaje de PRE-RC: ORC + ATP → se le unen protes de división cel, cargadores de helicasas,
ATP y 2 helicasas (MCM 2-7) → se une todo al DNA (fase G1) → PRE-RC es activado por CDC45,
GINS, CDC7 y CDK2 (kinasa dependiente de clicina) → activa la asociación de la DNApol y a MCM 2-
7 a viajar por la horquilla para abrir la doble hebra → las cels entran en la fase S → el cargador de la
helicasa, junto con las protes de división cel, se inactivan por la gemina, liberan y degradan por
fosforilación (se evita otro ciclo de replicación). Entran PCNA, RFC (cargador de la pinza) y los
factores de replicación.

Las CDKs, q intervenían en la formación y activación de PRE-RC, tienen 2 funciones → activan las
helicasas ya cargadas e inician la replicación en fase G1, y en S, G2 y M inhiben la carga de la
helicasa.

Las ciclinas oscilan en todo el ciclo → controlándolo → llegan al mínimo de expresión en G1:
“ventana de oportunidad”. Las CDKs se anclan a las ciclinas y las activan por fosforilación →
después la ciclina se degrada y así la kinasa no da la segunda fase hasta q no se le une otra ciclina.
Estas combinaciones son cíclicas y van en sentido progresivo → experimento: si se fusiona una cel
en G1 con otra cel en S → la G1 entra directa a S porq los factores de la S sirven. Si se fusionan S y
G2, S no entra en G2 ni al revés pq el DNA no está preparado para replicarse, eso solo pasa en la
fase S.

En la ventana de oportunidad (G1, no hay ciclinas) se ensambla el PRE-RC → estos controles se dan
pq solo puede darse un ciclo replicativo x división celular. Se permite solo en la fase S para q no
haya solapamiento de rondas y se mantiene el patrón de activación de oris. Se inhiben las
reiniciaciones y cuando la cel se divide, la ctdad de ciclinas tb se divide, por lo q disminuyen sus
niveles.

La replicación del DNA se da tras la acción de la helicasa → activación de las DNA pol → el complejo
CMG (GINS MCM 2- 3 y cdc45) forman el core o centro de helicasa replicativa. GINS y CDC45
aumentan la acción de las helicasas asociándose a ellas.

El complejo CMG helicasa es parte de un complejo más grande → RPC (replisome progression
complex) → CDK y DDK fosforila sus subud. Las Pol sintetizan las hebras tras la síntesis del primer, q
se elimina por la FEN 1 (flap endonucl 1) y la ligasa I. PCNA ancla la pol a la hebra y aumenta la
procesividad, RFC (cargador de la pinza) ancla a PCNA y facilita la síntesis coordinada en ambas
hebras. Se ancla CMG a la pol épsilon y se facilita el acceso a la pol alfa primasa.

Unión de fragmentos de Okazaki: 2 modelos:

 Modelo RNasaH → reconoce dobles cadenas de RNA y DNA, elimina hasta el último ribont
sin eliminar, q es eliminado por Fen1 junto con el resto de DNA. Posteriormente la ligasa
une los fragmentos.
 Flap model → como la pol delta tiene act de desplazamiento de banda, al finalizar el
fragmento, alcanza el primer y lo levanta rompiendo los puentes de H. El primer queda
suelto x lo q la enzima FEN1 corta lo corta y elimina, y la ligasa une.

La act del ori se da 1 vez cada ciclo. A veces se vuelve a dar justo después de comenzar la síntesis
de DNA por una sobreproducción de algunas protes → re-replicacion → daño en el DNA, estrés
genómico.
 

Prevención de re-replicación:

La activación del ori se da una vez cada ciclo (duplicación precisa y correcta).

Hay veces q los oris se activan de forma incorrecta justo al comenzar la síntesis de DNA → x) →
rereplicación → sobre expresión del cargador de la helicasa → las cels muestran daños en el DNA,
estrés genómico e inestabilidad → senescencia, apoptosis...

Para prevenir la re-replicación existen 3 mecanismos:

 Geminina → restringe la reactivación del ori inhibiendo la unión al cargador de la

helicasa.
 Fosforilación x CDKs de los componentes de PRE-RC para inhibir la reactivación.
 Ruta ubiquitina-proteasoma en la entrada de la fase S gracias a las E3 ubiquitinas
ligasas.
 Complejo inductor de anafase el APC cíclico, junto con sus reguladores →
controlan la activación de los orígenes tanto positiva (geminina) como
negativamente (cargador de la helicasa, protes de división cel).

En ocasiones la re-replicación es necesaria → aumentar la expresión de protes de manera drástica

(asociado con niveles altos de acetilación de histonas) → el cargador de la helicasa y la sprotes q
regulan el ciclo cel son proto-oncogentes (regulan el ciclo cel).

5.ESTRÉS REPLICATIVO:

Implica q la cél no puede llevar a cabo la replicación.

Fuentes → lesiones en el DNA, mala incorporación de nt, elementos de DNA repetitivos, por
oncogenes.... → se soluciona reparando el daño, por la RnasaH, helicasas, y regulando la activación
del origen.

Se pueden dar en regiones difíciles de replicar (asociadas a estr. Secundarias o terciarias de DNA, q
eliminan helicasas específicas).

 R-loops: híbridos de DNA y RNA con DNA monocat no asociado. Se eliminan por la RasaH o
se desensamblan por helicasas específicas imp en la terminación de la transcripción. Se
puede prevenir por la topoisomerasa I (resuelve las supervueltas – para q no se generen
las estructuras de tres hebras).
 Oncogenes: hacen q no se activen los oris en el orden en el q deberían → DNA under-
replicated. O al revés, sobreactivan un ori: re-replicacin, tb pueden activar un ori de forma
 prematura o provocar una progresión desregulada de la activación de oris (por oncogenes
o por especies reactivas de oxígeno) → estas 3 hacen q se bloqueen las horquillas de
replicación.

6.RESOLUCIÓN DE ERRORES:

Tras un estrés replicativo → activación local del PRE-RC o la inhibición total de los oris.

Tras la parada de replicación (se bloquea la horquilla), el complejo de la helicasa MCM 2-7 se libera
de la hebra de DNA y queda en DNA monocat cubierto por RPA → se activan protes q activan
sensores de daño, se recluta la kinasa ATR, q fosforila a la kinasa CHK1, q activa un ori cercano
(flexible o inactivo) → bloqueo de activación de oris tardíos x difusión de la señal del daño a través
de la fosforilación de la DDK y de CDC25, q terminan bloqueando la formación del PRE-RC y se
paraliza el ciclo celular (hasta q se resuelva el daño).

Existen puntos de control en respuesta al estrés replicativo q causen lesiones en el DNA: rad UV,
ROS, drogas, starvation → retraso o represión del avance de la horquilla → se activa una cascada de
señalización con checkpoints para mantener la integridad de las horquillas y facilitar la reparación
→ consecuencia: se elimina la regulación negativa de oris cercanos gracias a la ruta ATR.

Puntos de control ATM y ATR:

Activan DDR (DNA Damage Response) → genera roturas de doble hebra (DSB, double strand
breaks) o simple.

Las roturas de doble cadena activan a ATM y las sencillas, recubiertas con RPA, activan a ATR →
ATR y ATM fosforilan a la histona de daño H2Ax, q recluta protes de reparación y daño cel →
activan otra cascada de señalización para bloqueo y protección de la horquilla, además de la
inhibición de otros oris cercanos.

7.TERMINACIÓN:

Se desconocen secuencias específicas.

Fusión de ambas horquillas, varía según donde comience la formación de la horquilla. Tras la
ligación del ult fragmento → se desensambla todo el complejo de rep a través de la ubiquitinación
de MCM7 al proteasoma → el replisoma se desensambla y se separan los dos DNAs.

PROBLEMAS CON LA REPLICACIÓN DE EXTREMOS DE DNAS LINEALES

El extremo 3’ siempre qda libre pq la DNA pol alfa primasa no tiene molde para sintetizar primer
(replicación incompleta en la hebra discontinua). Por lo q en la siguiente ronda, cuando la hebra
molde es la q se ha sintetizado como discontinua, se pierde información. A medida q se va
replicando, cuando sea la hebra discontinua la q se usa como molde, se perderá más y más
información. Para evitar estos errores se usan protes como primers (bacterias, fagos y virus) → se
copia la hebra molde completa.

8.TELÓMEROS:

Los telómeros son los extremos de los cromosomas lineales, q son sensibles ya q sufren
acortamientos progresivos tras varias rondas de replicación. Para evitarlos están los telómeros:

Conjunto de DNA y protes → el DNA en secuencia hace repeticiones en tándem, cuando se va

acortando y entra en punto crítico en el q no hay protes q protejan: se desencadena una respuesta
de daño → los telómeros activan mecanismos de daño y reparación → la cel entra en senescencia o
parada d replicación → envejecimiento (su acortamiento está ligado a la división cel), las
telomerasas son enzimas encargadas de contrarrestar el acortamiento, pero no están en todos los
tipos cel, es una DNA pol RNA dependiente. Hay cels q mantienen la capacidad proliferativa como
las cancerígenas, las embrionarias y las cels madre.

Los telómeros están al final de un cromosoma, constan de una secuencia de DNA lineal específica, y
confieren

estabilidad. Experimento: En levaduras el cromosoma es circular → Cuando introduces una

secuencia lineal de DNA en levaduras, se degrada. Pero si se añade la secuencia lineal con
telómeros, no se degradaba.

La maquinaria de reparación puede confundir el DNA lineal con una rotura de la doble hebra, el
telómero bloquea esa respuesta por su estructura, q está caracterizada por:

 Conformación específica del DNA.

 Organización específica de la cromatina.
 Protes asociadas a doble hebra y a cadenas sencillas.
 Plegamiento de los telómeros en t-loop → provoca q la hebra sencilla forme un dúplex de
DNA.
 Posible plegamiento en G-quadruplex DNA (conformación especial de guaninas).

Su DNA está organizado en nucleosomas muy compactos, tienen marcas de heterocromatina, con
la unión de la prote HP1 (prote Heterocromatina 1). Sus protes están formando el complejo
Shelterin, 6 protes con funciones d protección y mantenimiento de longitud reclutando a la
telomerasa siempre q sea posible. Están unidas de forma repetida y en forma de complejo a lo
largo del telómero.

De esta forma, los telómeros evitan q se den daños en el DNA, el extremo 3’ invade la doble hebra
(t-loop) → ya no se expone ningún corte de hebra al entorno → los t-loops se forman gracias a
TRF2.

La TPP1 recluta a la telomerasa cuando sea posible, la DNA pol dependiente de RNA, es un a
retrotranscriptasas, y la telomerasa se expresa en cels troncales adultas, en tejidos fetales, en
tumorales y cels de la línea germinal. En cels somáticas no se detectan y por ello envejecen.
Las proteínas van a unirse a la cadena doble (TRF1 y 2) y a la sencilla → POT 1 se une a TRF1 y 2 en
regiones ricas en guanina → el complejo se repite para mantener su estructura del t-loop gracias a
la unión doble de POT 1 (cadena sencilla y simple).

La capacidad de proliferación de las cels primarias está ligada a la longitud de los telómeros →
cuando el acortamiento llegue a una región específica más sensible (límite de Hayflick), saltan los
mecanismos de reparación de daño → freno de aparición de tumores → activación de rutas de
respuesta a daño q desencadenan la parada la de la replicación → senescencia/muerte.

La telomerasa, responsable de mantener los telómeros, tiene una parte polimerasa con act
retrotransciptasa (parte prote TERT) y una región q estimula la act enzimática (parte prote
DYSKEIN); y el molde q usa en un RNA-template.

La telomerasa se engancha en el extremo 3’ (elongándolo) y usando su molde de RNA, sintetizar en

sentido 5’-3’ para q la DNA pol alfa primasa pueda sintetizar un primer y se forme un nuevo
fragmento de Okazaki. Cuanto más largo sea el telómero, tendrá mas protes unidas y se reclutará la
telomerasa más débilmente (regulación x inhibición).

En las cels somáticas se acortan los telómeros cuando las cels se van replicando → cuando se
acortan demasiado, el mecanismo de detección d daño DDR, activa a ATM y ATR, q a su vez
desencadenan rutas de senescencia y muerte cel (p53).

Cuando las vías implicadas en la detección del ciclo cel fallan, no se puede responder a la
señalización de ATM y ATR → los telómeros se siguen acortando ya q las cels siguen dividiéndose.
En una cel con indicios a ser tumoral hace q la telomerasa se activa → se generan nuevos
telómeros → perpetuación de los cromosomas mal organizados.

RESUMEN:

La replicación de DNA lineales conlleva la perdida de DNA en los extremos, para evitar esto hay
diferentes estrategias:

 Proteínas que actúan como primers.

 Telómeros:

o Protegen el DNA, evitan que se desencadene una respuesta de daño al DNA o Estructura
secundaria en forma de loop
o Tres componentes:
 -DNA: Secuencias repetidas 13
- Proteico: constituye el Shelterin (TRF1, 2, PPT1, TPP

-Componente enzimatico: Telomerasa:

-Enzima retro transcriptasa

-Requiere RNA como templete

-Función evitar el acortamiento de los telómeros.

-La telomerasa se expresa en cels germinales y disminuye su expresión

en células adultas.

• Los telómeros se acortan con las divisiones celulares, eso determina el Límite Hayflick: Parada en
ciclo y entrada en senescencia, si este sistema falla las células pueden acumular mutaciones y
transformarse.