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PROTEÍNAS

OBJETIVOS

1- Identificar por métodos colorimétricos los 20 L-α aminoácidos (AA), que forman las
proteínas, basados en las reacciones de los grupos R.
2- Efectuar pruebas cualitativas para diferente aminoácido
3- Determinar la importancia de las proteínas para el cuerpo humano.

TEORÍA

Las proteínas son bipolímeros de alto peso molecular, conformadas por unidades
monoméricas básicas, denominadas α aminoácidos, de los que 20 son biológicamente
importantes. La unión entre aminoácidos se forma mediante la interacción del grupo
carboxilo de un aminoácido con el grupo amino de otro para formar un enlace peptídico.
Siendo así que la adición secuencial de aminoácidos origina un péptido y finalmente una
proteína. Las proteínas forman estructuras de diversas complejidad que podemos
resumir en las siguientes características biológicas:

 Ejercen y tienen relación estrecha entre estructura y función (las del músculo
actúan transluciendo energía mecánica).
 Disponen de flexibilidad importante de su estructura, de ahí su diversidad infinita
(hemoglobina, miosina , albúmina, colágeno y todas en sí).
 Disponen de un mecanismo de formación que posee fidelidad absoluta e
inmutable para cada proteína (esto quiere decir que cada proteína tiene una
función determinada en el organismo).

Entre las características físicas y químicas de las proteínas señalamos las siguientes :

La gran masa molecular de las proteínas determina su carácter coloidal en soluciones


acuosas, por lo que su diámetro en solución es mayor a 0,001 um. Esta propiedad
coloidal les confiere una gran afinidad hacia el agua, siendo por esto muy soluble en ella.
Otras propiedades coloidales características de las proteínas son: sus diluciones tienen
aspecto opalescente; producen el fenómeno de Farady-Tyndall ; movimiento browniano
(es el movimiento permanente y desordenado de las partículas de materia muy pequeña
(de micrómetros solamente) en el seño del agua y otros líquidos; se debe a los choques
de las partículas con las moléculas del líquido, las cuales según la teoría cinética de la
materia, se hallan sometidas constantemente a la agitación térmica); no son filtradas por
ultrafiltración; poseen presión osmótica, pueden ser separadas de otros compuestos por
diálisis a través de una membrana semipermeable.

La solubilidad proteica en agua, les permite formar sales en agua y disoluciones acuosas
de sustancias polares. Esta propiedad está ligada a la hidratación de sus moléculas, por
esto, cualquier factor que altere esta propiedad provocará la disminución de su
solubilidad en agua y su consecuente precipitación. Esto último podría lograrse al
agregar a una solución acuosa proteica compuesta deshidratantes como alcohol,
acetona, soluciones de sales neutras de metales alcalinos y otros compuestos que
lograrían la precipitación proteica. Esta precipitación (con sales alcalinas) no produce la
desnaturalización de las proteínas, es así, que este procedimiento es usado para separar
proteínas y mantener su actividad biológica; l que no ocurre si se utiliza metales pesados
(acetato de plomo). En resumen, la precipitación de proteínas, consiste en la pérdida de
sus propiedades hidrófilas, adquiriendo características hidrófobas, con pérdida de carga
eléctrica.
 Las proteínas se comportan también, como electrólitos anfóteros, es decir que
poseen simultáneamente características de ácidos y bases; se debe tomar en
cuenta que esta propiedad proteica deriva de sus bases estructurales, los
aminoácidos. Un grupo anfótero, como un aminoácido, puede disociar sus grupos
amino y carboxílico de acuerdo al pH del medio, siendo así que en medio ácido,
una proteína se cargará positivamente y en el medio alcalino ocurrirá lo contrario.
 Esta propiedad de los aminoácidos en la estructura proteica, es utilizada para la
identificación de las proteínas por medio de la electroforesis o cromatografía (esta
última para diferenciar aminoácidos y proteínas).
Todas las reacciones para identificar aminoácidos y proteínas están basadas en la
presencia de grupos químicos, en los enlaces o en sus propiedades físico-químicas. Las
reacciones de reconocimiento pueden dividirse en dos grupos independientes:
a. Reacciones de precipitación: que a su vez, pueden subdividirse en dos grupos:
Precipitación de proteínas sin desnaturalización, por ejemplo utilizando sulfato de amonio
((NH4)2SO4), cloruro de amonio (NH4Cl) o sulfato de sodio (Na2SO4)
Precipitación de proteínas con desnaturalización que utilizan sales de metales pesados
(sales de plomo, de cobre, de mercurio y otras), o la temperatura mayor a 80ºC, ácidos
inorgánicos y orgánicos
b. Reacciones coloreadas: como la reacción de Biuret, de la Ninhidrina, la Xantoproteíca,
la de Millon y muchas otras. Estas reacciones permiten identificar a ciertos grupos de
aminoácidos de acuerdo a los grupos funcionales que contengan.

El Biuret es una reacción típica de los enlaces peptídicos, en la cual los átomos de cobre
del reactivo se unen a varios grupos NH (amino), lo que produce una coloración rosa-
violácea. Es una prueba general para polipéptidos y proteínas ya que sirve para
reconocer las uniones peptidicas. La formación de un complejo de coordinación entre los
cationes cúpricos en medio alcalino con las uniones peptídicas. La reacción
Xantoproteíca es una prueba que consiste en la nitración de anillos de fenol presentes
en ciertos aminoácidos, con la consiguiente formación de nitrocompuestos de color
amarillo. Es una reacción que reconoce los aminoácidos que poseen el grupo bencénico
(tirosina, fenilalanina, triptófano). Las proteínas que tienen en su composición estos
aminoácidos también darán la reacción.

Todas aquellas sustancias que presentan al menos un grupo amino y uno carboxilo libre,
reaccionaran con la ninhidrina. La positividad se manifiesta por la aparición de un color
violáceo o amarillo. Debido a que las proteínas y los aminoácidos, poseen esta
característica, la reacción sirve para identificarlos. Algunas soluciones de amonio y
aminas, dan la coloración característica, aparentemente debido a una oxidación y
reducción intramolecular de la ninhidrina en presencia de amoníaco. Los aminoácidos
porina e hidroxiprolina, que no poseen grupo amino sino imino (-NH-), dan un color rojo
que pasa rápidamente a amarillo.

La prueba de los grupos SH es una prueba para identificar aminoácidos azufrados y las
proteínas que los contienen, se reconocen por la formación de una coloración negra o
gris. Se basa esta reacción en la separación mediante un álcali, del azufre de los
aminoácidos, el cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro
de plomo

La prueba de Hopkins- Cole es para identificar el triptófano y las proteínas que lo


contienen. La positividad se reconoce por la aparición de un anillo color violeta-rojizo.

La reacción de Millón es debida a la presencia del grupo hidroxifenílico (-C6H4OH) en la


molécula proteica. Cualquier compuesto fenólico no sustituido en la posición 3,5, como
la tirosina, fenol y timol, dan positiva la reacción. El mecanismo de la reacción es poco
conocido, posiblemente se deba a la formación del complejo oxido de mercurio y fenol.

MATERIALES DE VIDRIO

- Tubos de ensayo
- vasos químicos de 250 ml
- probetas de 25 ml
- policial o agitador de vidrio

EQUIPO

- Pinzas para tubos de ensayo


- platos calientes
- goteros.

REACTIVOS

- CuSO4 al 1%
- NaOH al 20%
- HNO3 concentrado
- soluciones al 5% de: ovoalbúmina, caseína, gelatina
- reactivo de Millón
- reactivo de Hopkins-Cole
- Acetato de Plomo al 5%
- NaOH al 40%
- H2SO4 concentrado.

EXPERIMENTACION
A. PRUEBA DE BIURET

Coloque en tubos diferentes 2 ml de las disoluciones proteínicas, añadir a cada tubo 10


gotas de una disolución de NaOH al 20 %, agitar y dejar caer 4 o 5 gotas de CuSO 4 al 1
%. Interpretar los resultados.

SOLUCIONES PRUEBA DE BIURET


Ovo albúmina
Gelatina

Caseína

B. PRUEBA XANTOPROTEICA

Añadir en tres tubos de ensayo diferentes 2 ml de cada disolución de proteína, añadir


unas 10 gotas de HNO3 concentrado, anotar la coloración, calentar al baño María y
anotar los resultados.

SOLUCIONES PRUEBA XANTOPROTEÍCA


Ovo albúmina
Gelatina

Caseína

C. PRUEBA DE NINHIDRINA

Coloque en tres tubos de ensayo diferentes 2 ml de las soluciones proteínicas


respectivamente, añada a cada tubo 1 ml de la solución de ninhidrina. Caliente hasta
ebullición, deje enfriar y observe lo sucedido.

SOLUCIONES PRUEBA DE NINHIDRINA


Ovo albúmina
Gelatina

Caseína
CH. PRUEBA PARA GRUPOS SH (AMINOÁCIDOS AZUFRADOS)

Coloque en tres tubos de ensayo 2 ml de las soluciones proteínicas respectivamente,


adicione 1 ml de NaOH al 40% y 1 ml de Acetato de Plomo al 5%. Mezcle bien y caliente
por 5 minutos. Anote los resultados.

SOLUCIONES PRUEBA PARA SH


Ovo albúmina
Gelatina

Caseína

D. PRUEBA DE HOPKINS-COLE

Coloque 2 ml de las soluciones proteínicas en cada uno de tres tubos de ensayo, añada
3 ml del reactivo de Hopkins-Cole, adicione 1 ml de H2SO4 concentrado dejando caer el
reactivo por las paredes del tubo sin agitar. Anote los resultados.

SOLUCIONES PRUEBA DE HOPKINS-COLE


Ovo albúmina
Gelatina

Caseína

E. PRUEBA DE MILLÓN

En tres tubos de ensayo diferentes, coloque 2 ml de las soluciones proteínicas, a cada


uno añada 4 gotas del reactivo Millón, caliente y observe la aparición de un precipitado
color rosa.

SOLUCIONES PRUEBA DE MILLÓN


Ovo albúmina
Gelatina

Caseína
CUESTIONARIO

1. Investigar la clasificación de los aminoácidos desde los siguientes puntos de vista:


Esenciales y no esenciales para el hombre, ácidos y básicos en forma molecular,
polares con carga y sin carga, apolares.
2. Investigar las estructuras, nombres y abreviaturas para los veinte aminoácidos
que son usados en la biosíntesis de proteínas.
3. Para cada aminoácido señale la cadena lateral o el grupo R e identifique las
funciones presentes.
4. Estudie que aminoácidos están presentes en las siguientes proteínas: Colágeno,
albúmina.
5. Con base en los resultados obtenidos para la solución problema, indique las
características estructurales e identifique hasta donde sea posible el tipo de
aminoácidos que contienen las proteínas analizadas.
6. Con base en los resultados obtenidos para los materiales biológicos que se
ensayaron indique qué tipo de aminoácidos se encuentran presentes.
7. Escriba las estructuras de los aminoácidos que analizó en cada prueba e
identifique el grupo que estaba reaccionando o el responsable de la coloración
positiva del ensayo.

PRÁCTICA #. 12
REACCIÓN, SEPARACIÓN Y DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS.

I- OBJETIVOS:
1-Practicar la separación de la albúmina y las globulinas, dos proteínas presentes
en la clara del huevo.
2-Familiarizarse con la reacción general de la proteínas (el ensayo de Biuret).
3-Observar la importancia del punto isoeléctrico en una proteína o también en un
α-amino-ácido.
4-Reconocer los componentes de las proteínas.

II-TEORÍA:

El nombre proteína proviene de la palabra griega proteios que significa lo primero.


Las proteínas constituyen gran parte del cuerpo animal; lo mantienen como unidad y lo
hacen funcionar. Se les encuentran en todas las células vivas. Las proteínas son el
material principal de la piel, los músculos, tendones, nervios, la sangre, enzimas,
anticuerpos y muchas hormonas.

Desde el punto de vista químico, las proteínas son polímeros grandes. Son poliamidas y
los monómeros de los cuales derivan son los α-amino-ácidos.

Las moléculas de aminoácidos se utilizan principalmente para la síntesis de largos


polímeros complejos denominados polipéptidos. Los polipéptidos cortos, con una
longitud inferior a 50 aminoácidos, se denominan péptidos. A los polipéptidos más largos
se les suele denominar proteínas.

Los aminoácidos individuales están unidos en péptidos y polipéptidos en enlace


peptídico, un enlace amida que se forma en una clase de reacción se sustitución
nucleofílica con participación de un grupo carbonilo, que se produce entre el grupo amino
de un aminoácido y el grupo carbonilo del otro.

Tanto aminoácidos como proteínas tienen carácter anfótero, propiedad que deriva de la
presencia de los grupos ácidos (carboxilo: -COOH); y básicos (amino: -NH2),
simultáneamente en la molécula, cuya interacción intramolecular ácido-base origina una
forma bipolar: Zwitterion. Cualquier variación del pH del medio dará lugar a que
predomine una de las cargas, de aquí que se puede comportar como ácido ó base, según
el pH del medio, así:

Las proteínas pueden ser desdobladas para crear formas intermedias de tamaño y
diferentes propiedades, y esto se logra por medio de ácidos, bases, enzimas: los
productos de la degradación proteica, en orden decreciente de tamaño y complejidad son:
Proteínas – proteasas – peptonas – polipéticos - pépticos – aminoácidos – amoniaco –
nitrógeno elemental.
Las desnaturalización de proteínas está relacionada con cualquier modificación de su
estructura, sin rompimiento del enlace peptídico. Esta se puede lograr con el calor,
sustancias químicas, alcoholes, bases, etc.

De todas las moléculas que se encuentran en los seres vivos, las proteínas son las que
tienen las funciones más diversas, como sugiere lo siguiente:

1- Catálisis: Ejemplo, enzimas.


2- Estructura: Colágeno, la elastina.
3- Movimiento: la actina.
4- Defensa: Queratina, Las inmunoglobulinas, las de la coagulación de la sangre
(fibrinógeno y trombina).
5- Regulación: Hormonas reguladoras ( Insulina y Glucagón).
6- Transporte: Na+-K+ATPasa, Transportadora de glucosa.
7- Almacenamiento: Ovoalbúmina, la caseína de la leche.

Muchos agentes físicos y químicos pueden romper la conformación nativa de una


proteína. El proceso de destrucción de la estructura se denomina desnaturalización. La
desnaturalización normalmente no incluye la ruptura de los enlaces peptídicos.
Dependiendo del grado de desnaturalización, la molécula puede perder parcial o
totalmente su actividad biológica.

Las principales condiciones desnaturalizantes son: Ácidos y bases fuertes,


disolventes orgánicos, detergentes, agentes reductores, concentración salina, iones
metálicos pesados, cambios en la temperatura y agresión mecánica.

Una proteína o α-amino-ácido que posee en su estructura el mismo # de cargas


positivas (+) y cargas negativas(-) se encuentra sin carga, es decir carga 0. Esta
condición se conoce como punto isoeléctrico. La biomolécula es eléctricamente neutra y
a este pH las proteínas y los amino-ácidos son menos solubles en el medio.
III- MATERIAL DE VIDRIO:
1- Vasos químicos de 500 mL.
2- Pipetas de 5 mL
3- Tubos de ensayos
4- Policial

IV- EQUIPO DE LABORATORIO:


1- Centrífuga
2- Papel indicador universal

V- REACTIVOS:
1- Caseína en polvo y diluída
2- Clara de huevo
3- Albúmina diluída
4- Reactivo de Biuret
5- HCl 6M
6- NaOH 1.0M y 6M
7- Acetato de plomo 0.1M
8- Ácido acético 1M ; 0.1M y 0.01M.

VI- EXPERIMENTACIÓN:
1- SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS:
En un vaso químico adicione 100 mL de agua, agregue una clara de huevo y agite con
un policial.

La albúmina queda en solución y las globulinas precipitan.


Centrifugue una porción de la mezcla. Reserve las fracciones para realizar la prueba de
Biuret.

Separe el líquido sobrenadante por decantación.

2-REACCIÓN DE BIURET-RECONOCIMIENTO DEL ENLACE PEPTÍDICO:


Coloque en los respectivos tubos de ensayos , 1 mL de la muestra de
proteínas( ovoalbúmina, globulinas, caseína diluída) y agregue 0.5 mL del reactivo de
Biuret.
La presencia de una coloración violeta es positiva. De acuerdo a la intensidad
del color, se interpreta por mayor concentración de enlaces peptídicos.

3-PRECIPITACIÓN POR METALES PESADOS:


A 2 mL de las distintas soluciones de proteínas, adicionar 1 mL de Acetato de
Plomo 0.1M. Anote su observación.
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4- SOLUBILIDAD DE PROTEÍNAS:
Coloque en cada uno de tres tubos de ensayo, 5 mL de solución de albúmina
diluída 1:1 con agua.
Adicione 2 mL de HCl 6M al tubo #1.
Adicione 2 mL de NaOH 6M al tubo #2.
Adicione 2 mL de agua al tubo #3.
Anote sus observaciones.
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5- PUNTO ISOELÉCTRICO:

a)- Preparación de la solución de caseína:


En un tubo de ensayo de 25 mL, limpio y seco, coloque 3 mL de agua.
Agregue 0.1 g de caseína en polvo y mezcle suavemente, por rotación, evitando formar
espuma( no se va a disolver completamente.
Agregue 1.5 mL de NaOH 1M y mezcle, luego 1.5 mL de ácido acético 1M y siga
mezclando.
Adicione 9 mL de agua y siga mezclando, luego deje reposar por 5 min.

b) Prepare los tubos de ensayos según el cuadro:

Tubos + mL 1 2 3 4 5 6
Ácido acético 0.01M 2 5
Ácido acético 0.1M 1 6
Ácido acético 1.0M 1.5 3
Agua 7 4 8 3 7.5 6
pH aproximado 5.4 5.0 4.7 3.9 3.5 3.0

Adicione a cada uno de los tubos de ensayos con ácido acético, 1 mL de la solución de
caseína.
Agite suavemente, evitando la formación de espuma.
Observe la turbidez que ocurre de inmediato y a los 10 min.
Ordene los tubos según la intensidad de la turbidez en cada uno.
Anote sus resultados.

VII- CUESTIONARIO:
1- ¿Por qué la diferencia de solubilidad en agua de la albúmina y las globulinas?
2- Mencione una función de la albúmina y de las globulinas en el sistema sanguíneo
humano.
3- El aspartame es un edulcorante sintético, es un metil èster de un dipèptido de L-
aspartato y L-fenilalanina. Cuàles productos se obtienen cuando el aspartame se
hidroliza en presencia de un catalizador ácido?
4- ¿Qué tipos de interacciones afecta el acetato de plomo en una proteína?
5. El glutatión es un tripeptido que destruye los agentes oxidantes nocivos del organismo,
compuestos que se piensa son causantes de algunos efectos del envejecimiento. El
glutatión reduce los agentes oxidantes y los destruye, como consecuencia se oxida.
a. Cuáles aminoácidos forman el tripeptido?
b. Dibuje la estructura del glutatión oxidado.