UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA EDUCACIÓN

LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES Y EDUCACIÓN AMBIENTAL
Bioquímica

Profesor Jhon Edison Hernández Botia

Velocidad de reacción enzimática y determinación del punto isoeléctrico de una proteína

Introducción

Una reacción química está sujeta a distintos factores que pueden influir en su velocidad para generar
los nuevos compuestos, entre los más comunes están la temperatura, concentración, presión,
agitación, pH y el uso de catalizadores. Sin embargo, en el caso de las enzimas estos factores se
comportan de una forma diferente. La actividad catalítica de un enzima se determina midiendo la
velocidad inicial de reacción, que es la pendiente de la curva de progreso como se observa en la
Figura 1.

Figura 1. Cinética de una reacción enzimática, concentración vs el tiempo

Efecto de la temperatura en la velocidad de reacción

En la mayoría de las reacciones químicas el incremento de la temperatura aumenta la velocidad de

reacción, puesto que a mayor temperatura incrementa la energía cinética de las moléculas y hay
más probabilidad de interacción entre ellas. Pero en las enzimas, si el incremento de la temperatura
no es controlado, esto no sucede, debido a que estas especies químicas pueden sufrir una
desnaturalización molecular y dejaría de reaccionar (figura 2).
 Figura 2. Velocidad de reacción según el efecto de la temperatura. Se puede observar como es la
cinética enzimática de una enzima típica de un ser humano frente a una cinética enzimática de
organismos termófilos.

Efecto de la concentración en la velocidad de reacción

Cuando incrementa la concentración de enzima o sustrato, la velocidad de reacción incrementa,

cuando la concentración es baja este comportamiento es lineal y cada vez que va aumentando la
concentración este comportamiento desaparece hasta llegar a una velocidad constante ya sea por
un exceso de enzima o de sustrato figura 3.

Figura 3. Efecto de la concentración sobra la velocidad de reacción, cuando la concentración es

baja la gráfica es lineal.

Efecto del pH en la velocidad de reacción

Al igual que la temperatura y la concentración el pH también es un factor importante en la cinética

enzimática de las enzimas, pero este factor depende de la naturaleza de las enzimas. Muchas
enzimas actúan dentro del pH fisiológico, pero otras actúan a pH extremos como las enzimas del
estómago donde el pH es bastante ácido (figura 4).
 Figura 4. Efecto del pH sobre la velocidad de reacción en enzimas como la pepsina, tripsina y
fosfatasa alcalina.

Punto isoeléctrico de las proteínas

Al igual que los aminoácidos las proteínas también presentan un punto isoeléctrico, el cual es el pH
exacto donde las cargas se anulan, debido a que las proteínas están compuestas por una serie de
aminoácidos que poseen cargas en sus grupos R y muchos de estos no están comprometidos en las
interacciones que mantienen estable la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de las
proteínas, estos aminoácidos pueden interactuar con el agua haciendo que la proteína tenga cierta
solubilidad. Una vez la proteína se encuentra en su punto isoeléctrico esta no puede formar los
puentes de hidrógeno con la molécula del agua, es decir, que se pierde la solubilidad y está precipita.

Metodología

Efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción de la amilasa

En una gradilla se ubican 3 tubos de ensayo, se rotulan como (a), (b) y (c), posteriormente se
adicionan los reactivos de acuerdo a la tabla 1. Antes de agregar el almidón, al tubo (a) llévelo a
baño térmico de 80°C, al (b) en el congelador de una nevera, y el (c) a temperatura de 38°C en baño
termostático, todos por 5 minutos.

Tabla 1. Reactivos para observar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción de la

amilasa.

Reactivo Tubo (a) Tubo (b) Tubo (c)

Buffer pH 6.9 0.2 mL 0.2 mL 0.2 mL
KCl 0.4 mL 0.4 mL 0.4 mL
Agua destilada 1 mL 1 mL 1 mL
Enzima 1 mL 1 mL 1 mL
Almidón 2 mL 2 mL 2 mL
Después de los 5 minutos detenga la reacción con 0.4 mL ácido tricloroacético, añade 1 gota de lugol
agite suavemente y anote las observaciones.

Efecto de la concentración sobre la velocidad de reacción de la amilasa

En una gradilla ubique 4 tubos de ensayo rotulados de la (a) hasta la (d), agregue los reactivos como
se observa en la tabla 2 y llévelos a una temperatura de 38°C en baño termostático, luego de 5
minutos detenga la reacción con 0.2 mL de ácido tricloroacético, una gota de lugol y describa las
observaciones.

Tabla 2. Reactivos para observar el efecto de la concentración sobre la velocidad de reacción de la

amilasa.

Reactivo Tubo (a) Tubo (b) Tubo (c) Tubo (d)

Buffer pH 6.9 0.2 mL 0.2 mL 0.2 mL 0.2 mL
KCl 0.4 mL 0.4 mL 0.4 mL 0.4 mL
Almidón 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
Agua destilada 2.0 mL 1.6 mL 1.2 mL 0.8 mL
Enzima 0.8 mL 1.2 mL 1.6 mL 2.0 mL

Efecto del pH sobre la velocidad de reacción de la amilasa

En una gradilla se ubican 3 tubos de ensayo, adicionan los reactivos según la tabla 3.

Tabla 3. Reactivos para observar el efecto de la temperatura sobre la velocidad de reacción de la

amilasa.

Reactivo Tubo (a) Tubo (b) Tubo (c)

Buffer pH 6.9 0.2 mL 0.2 mL 0.2 mL
KCl 0.4 mL 0.4 mL 0.4 mL
Almidón 2 mL 2 mL 2 mL
Agua destilada 1 mL 1 mL 1 mL
Enzima 1 mL 1 mL 1 mL
HCl 1 N 1 mL 0 mL 0 mL
NaOH 1 N 0 mL 1 mL 0 mL

Después de 5 minutos detenga la reacción con 0.4 mL ácido tricloroacético, añade 1 gota de lugol
agite suavemente y anote las observaciones.

Extracción de caseína

En un vaso de precipitado añada 100 mL de agua destilada y 100 mL de leche, caliente hasta 40°C y
agregue gota a gota ácido acético 1N hasta que se forme un precipitado. Filtre la mezcla con papel
de filtro y lave el sólido con 20 mL de etanol. Lleve el precipitado al horno a 30°C hasta completa
sequedad. Para extraer la caseína en un vaso de precipitado pese el sólido y adicione 5 mL de éter
etílico por gramo de sólido. Deseche el líquido y conserve el precipitado (caseína).
Determinación del punto isoeléctrico

En un vaso de precipitado de 100 mL adicione 300 mg de caseína, 50 mL de agua destilada y 5 mL

de NaOH 1 N hasta que la solución quede homogénea. Posteriormente adicione 5 mL de ácido
acético 1 N y pase la solución a un balón aforado de 100 mL y llene con agua destilada.

En 10 tubos de ensayo adicione los reactivos como lo muestra la tabla 4. Posteriormente adicione 1
mL de solución de caseína y observe. Después de 5 minutos medimos la absorbancia de los tubos
de ensayo mediante el espectrofotómetro a una longitud de onda de 640 nm, en una gráfica de
columnas represente la absorbancia con respecto al pH y discuta los resultados.

Tabla 4. Reactivos para la determinación del punto isoeléctrico de la caseína, al adicionar los
reactivos de acetato de sodio y ácido acético se obtiene una solución buffer que mantiene el pH
estable.

Tubo Acetato de sodio Ácido acético Ácido acético pH resultante

0.1 N 0.1 N 0.01 N
1 0.5 mL 9.5 mL - 3.2
2 1.0 mL 9.0 mL - 3.6
3 1.5 mL 8.5 mL - 3.8
4 2.0 mL 8.0 mL - 4.0
5 3.0 mL 7.0 mL - 4.2
6 4.0 mL 6.0 mL - 4.5
7 6.0 mL 4.0 mL - 4.7
8 8.0 mL 2.0 mL - 5.1
9 6.0 mL - 4.0 mL 5.5
10 8.0 mL - 2.0 mL 6.1

Resultados para la determinación del pI de la caseína

Tubo pH Absorbancia
1 3.2 0.954
2 3.6 1.023
3 3.8 1.354
4 4.0 1.423
5 4.2 1.654
6 4.5 1.862
7 4.7 1.601
8 5.1 1.225
9 5.5 1.031
10 6.1 0.852
Recuerde que el punto isoeléctrico de la proteína es cuando se presenta mayor
cantidad de precipitado. ¿Qué significa que el punto isoeléctrico este en medio
acido?