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Control calorimétrico de crecimiento de
Saccharomyces cerevisiae para la producción de
proteı́nas recombinantes
Oriana Abarca, Domingo Bindis, Montserrat Bisbal, Valentina Espinoza y Camila Pavesi
Abstract—The calorimetric study of yeast cultures developing
under high-cell-density fed-batch conditions has proven to be an
effective and innovative procedure to elaborate control mecha-
nisms for growth rate modulation. Within this work, the use of
calorimetric analysis is proposed to control the biomass growth
rate of a Saccharomyces cerevisiae culture by manipulating both
the glucose feed to the biorreactor and refrigerant inlet flow to
the jacket heat exchanger. This is done in order to maintain an
optimal biomass specific growth rate and achieve a high density
culture capable of producing recombinant proteins of commercial
interest while avoiding Crabtree effect and aerobic ethanol gener-
ation. A control system is therefore simulated using SIMULINK
from MATLAB, selecting two separate control loops: glucose
feed flow - apparent specific growth rate and refrigerant feed
flow - culture temperature. As suggested in previous published
studies, a state observer is also applied to quantify the culture’s
apparent specific growth rate through calorimetric analysis of
the sensed temperatures inside the reactor and jacket volume.
Separate controller algorithms are designed for each control loop
choosing PID for refrigerant flow and IMC for glucose feed flow
as two of the most suitable controllers allowing for fast action,
low overshoot and offset and comparative low error indicators
IAE and IAVU.
Keywords—Calorimetry, apparent specific growth rate, control
loop, Saccharomyces cerevisiae, PID, IMC.
I. I NTRODUCCI ÓN
Saccharomyces cerevisiae es un hongo unicelular que
presenta una alta versatilidad para la modificación genética
y metabólica; lo que implica que sea idóneo para procesos
industriales de biosı́ntesis (Goffeau et al., 1996). La ecologı́a
de esta levadura presenta resistencia a altas concentraciones
de azúcar y etanol, un metabolismo fermentativo y una alta
selectividad por compuestos aromáticos de utilidad para la
industria vitivinı́cola (Dunn et al., 2012; Tristezza et al., 2016).
En el último tiempo, esta levadura ha surgido como
candidata para la producción de proteı́nas recombinantes
(Wang, Huang & Nielsen, 2017). Normalmente, estos
complejos orgánicos se derivan de cultivos celulares de
alta densidad (HCDC) que se desarrollan en biorreactores
fed-batch, que suministran altas concentraciones de glucosa
o sacarosa. Frente al alto contenido de sustrato en la
alimentación y la limitación de O2 disuelto, es necesario
contar con mecanismos de respuesta y control eficientes que
Departamento de Ingenierı́a Quı́mica y Bioprocesos, Facultad de Ingenierı́a,
Pontificia Universidad Católica de Chile, Av. Vicuña Mackenna 4860, Casilla
306 Correo 22, Santiago, Chile
eviten la aparición del efecto Crabtree y posterior generación
de subproductos citotóxicos inhibidores del crecimiento
celular como el etanol (Malairuang et al., 2020).
Con el objetivo de controlar la tasa de crecimiento celular
de cultivos HCDC, se han propuesto estrategias de control
basadas en la captura de señales. De estas propuestas destacan
la espectroscopı́a dieléctrica (Bao et al., 2018), absorción
de glucosa medida desde la corriente de salida en fed-batch
hı́brido al cabo de un ciclo completo (Çalik, Hoxha, Çalik &
Özdamar, 2018) y el perfeccionamiento de métodos de control
más comunes en la industria que miden variables como la
concentración de oxı́geno disuelto (DO), pH, composición del
aire de salida (XAE ) y demás, que se encuentran resumidas
en la Tabla (IV) del Anexo (A).
Entre los diferentes modelos de control que se han
propuesto para regular la tasa de crecimiento de cultivos
HCDC, se encuentra la temperatura y el estudio calorimétrico
de los fenómenos que se suscitan al interior de un biorreactor
fed-batch. La ventaja de esta estrategia de control es que
al representar una herramienta de monitoreo Online su
empleo permite la automatización (Ehgartner et al., 2017),
optimización (Mears, Stocks, Sin & Gernaey, 2017) y
ajuste inmediato de las variables controlables (Habegger,
Rodrigues & Dabros, 2018). Paralelamente, el estudio
calorimétrico es capaz de asociar una variable controlada de
compleja medición, con otra variable directa del proceso de
crecimiento celular como lo es la temperatura derivada del
calor desprendido de reacciones metabólicas en el cultivo
(Kottelat, Freeland & Dabros, 2021). El estudio calorimétrico
como estrategia de control supone una utilidad extraordinaria
para cultivos de microorganismos Crabtree-positivo como
en el caso de S. cerevisiae, que modifican su metabolismo
cuando la concentración de glucosa en el medio de cultivo
atraviesa lı́mites crı́ticos. Ası́, la entalpı́a de metabolización
puede ser estimada en razón del calor eliminado al ambiente,
logrando ası́ una relación entre la temperatura del medio y la
tasa de crecimiento especı́fica (Dabros et al., 2009).
El objetivo de este trabajo consiste en emplear el análisis
calorimétrico de un cultivo de S. cerevisiae contenido en un
biorreactor fed-batch para controlar su tasa de crecimiento
especı́fica en las condiciones de operación adecuadas. Esto
es útil para conseguir un cultivo HCDC que promueva la
producción de proteı́nas recombinantes evitando el efecto
 2

Crabtree y la formación de subproductos inhibidores del
crecimiento como el etanol. Para este propósito, en el
presente estudio se diseñan dos lazos de control: el primero
que controla la tasa de crecimiento especı́fica a través de
la regulación sobre el flujo de alimentación de glucosa y el
segundo que regula la temperatura del mosto manipulando el
flujo de refrigerante que ingresa por la chaqueta que cubre el
biorreactor.
Ambos lazos de control junto al proceso metabólico de S.
cerevisiae y los balances de masa y energı́a ocurridos en el
biorreactor son simulados a través del software SIMULINK
de MATLAB. Tras la integración de actuadores, sensores y el
proceso, se obtiene la función de transferencia de cada lazo de
control propuesto bajo configuración abierta, las cuales sirven
para la sintonización de diferentes algoritmos de control. De
este modo, el presente estudio no solo busca la aplicación
de un mecanismo innovador para la regulación de la tasa de
crecimiento celular basado en calorimetrı́a, sino que también
pretende emplear un algoritmo de control novedoso que supere
a otros tipo PI feedback y adaptativos no-lineales descritos por
Dabros et al. (2009) y Biener et al. (2010) respectivamente de
los cuales numerosos otros estudios calorimétricos hacen uso
(Kottelat et al., 2021; Schuler et al., 2012; Biener et al,. 2012;
Müller et al., 2018). Con esto, se pretende que la sintonización
de un algoritmo que incorpore la acción derivativa como PID
o que supere las inexactitudes del modelo como IMC presente
mejores ı́ndices de rendimiento IAE e IAVU junto a un menor
overshoot sobre el set-point establecido y mayor velocidad
de respuesta frente a perturbaciones. Estos dos indicadores
de error fueron seleccionados para conocer el efecto que
la agresividad de las variables manipuladas tienen sobre la
variable controlada (IAVU) e IAE para estimar la desviación
de la variable controlada sobre su set-point bajo un algoritmo
de control particular.
II. M ETODOLOG ÍA
crecimiento especı́fica donde la variable controlada es la
tasa de crecimiento especı́fica aparente (µapp ) que se estima
en base a un observador de estado (Bastin & Dochain,
1990) y las lecturas de las temperaturas del mosto y de
chaqueta que se le suministran. Los observadores de estado
consisten, a su vez, en un algoritmo que permite cuantificar
los valores aproximados reales de cierta variable o estado de
un sistema mediante la medición de entradas y salidas del
sistema sin que estas últimas guarden relación directa con
la variable a estimar. Con la implementación del observador
de estado y la obtención de valores de µapp , se puede fijar
un set-point óptimo aplicando un controlador que actúe
sobre la variable manipulada que corresponde al flujo de
alimentación de sustrato. Por otra parte, el segundo lazo de
control corresponde al Flujo de refrigerante - Temperatura
del reactor, donde la variable controlada y medida es la
temperatura del mosto y la variable manipulada es el flujo de
refrigerante que se suministra a la chaqueta a través de una
bomba peristáltica.
Ambos lazos de control permiten conocer parámetros in-
ternos del biorreactor (µapp y Tm ) con tal de poder ejecutar
acciones sobre las variables que ingresan al proceso. De esta
forma se podrá controlar el crecimiento de la levadura y evitar
excesos de sustrato que lleven al cultivo hacia un metabolismo
fermentativo (efecto Crabtree).
B. Ecuaciones diferenciales y constitutivas del proceso
A continuación se presentan los balances de masa y energı́a
que gobiernan el comportamiento de las especies y energı́a
en el proceso de crecimiento celular. El desarrollo diferencial
de estas ecuaciones se indica en el Anexo B.
1) Balance de biomasa:
dX
= (kX1 r1 + kX2 r2 + kX3 r3 )X − DX (1)
dt
Donde,
min(rS , rS crit )
r1 = (2)
kS1

max(0, rS − rS crit )
r2 = (3)
kS2

−rS )
max(0, kos (rSkcrit
op
P
P +KP )
r3 = (4)
kP 3
Siguiendo la ecuación (1) para el balance de biomasa como
la ecuación de crecimiento celular de Monod, se tiene:
Fig. 1. P&ID del control de tasa de crecimiento y temperatura del reactor.
µreal = kX1 r1 + kX2 r2 + kX3 r3 (5)
A. P&ID del proceso simulado y lazos de control
En la Figura 1 se detalla el P&ID propuesto. En este 2) Balance de masa por sustrato:
se ilustran los dos lazos de control implementados. El dS
primer lazo corresponde al Flujo de glucosa - Tasa de = DSin − (kS1 r1 + kS2 r2 )X − DS (6)
dt
 3

3) Balance de masa por producto: C. Metodologı́a para ajustar e identificar las funciones de
transferencia
dP
= (kP 2 r2 + kP 3 r3 )X − DP (7) Dada la naturaleza fed-batch del biorreactor seleccionado
dt
para el crecimiento del cultivo, se tiene que el proceso no
Otros balances diferenciales relativos a especies como O2 alcanza el estado estacionario. Por esta razón, se decide
y CO2 no serán abordados dentro de este estudio pues se ejecutar la simulación en un perı́odo de 35 horas, con una
suponen concentraciones saturadas de estos gases al interior alimentación de sustrato que mantenga el volumen contenido
del biorreactor. interior del reactor inferior a su capacidad máxima de 20
lts. Para conocer las variables de desviación propias de
4) Balance de masa por volumen: cada lazo de control, se lleva a cabo la simulación por
duplicado: una corresponde a la referencia y la otra al sistema
dV perturbado. Posteriormente se restan ambas señales para
= Fin (8)
dt obtener la respuesta generada por el escalón y, con ello, se
cuantifican los parámetros k, τ y θ, propios de la función de
5) Balance de energı́a para el mosto:
transferencia, a través de ajuste por mı́nimos cuadrados en
q̇m = q̇alim − q̇j + q̇p + q̇s (9) la planilla FOPDT.xlsx, a partir de la Macro implementada
| {z } |{z} | {z } en el ambiente de MATLAB, o bien, a partir de la app PID
Entrada Salida Generación Tuner al momento de diseñar el algoritmo de control.

dTm Fin U Aj (Tm − Tj ) 1) Función de transferencia del lazo ”Flujo de ali-

= (Tin − Tm ) − (10)
dt V ρm cpm V
∆HrO 2 Ws
+ +
M MO 2 ρm cpm V ρm cpm V
A su vez, q˙p se refiere al calor emanado por el proceso
de crecimiento y mantención celular como se indica en la
ecuación (39) y que es equivalente a la ecuación (11) (Biener
et al., 2010) en su notación diferencial.
dqp
= µapp qp (11)
dt
Esta ecuación puede ser resuelta directamente desde la
ecuación (11) por parte del observador de estado, aunque
autores más recientes como Kottelat et al., (2021) la discretizan
como se expresa en la ecuación (44) con tal de reducir el
tiempo y los recursos de simulación asociados a su resolución
en intervalos temporales definidos. Paralelamente, Kottelat et
al., (2021) argumenta que la fracción logarı́tmica presente en
la ecuación (44) puede generar sobre o subestimaciones en
µapp en caso de haber ruido en la señal de los calores; por
lo cual enfoca su estudio en el control del calor para estimar
de manera indirecta µapp . Ası́ es, pues, como se relaciona el
estudio calorimétrico dado por los sensores térmicos con la
tasa de crecimiento especı́fica aparente que se desea controlar.
6) Balance de energı́a para la chaqueta:
dTj U Aj (Tm − Tj ) Fin
= − (Tj − Tjin ) (12)
dt V ρj cpj V
La validez de las ecuaciones diferenciales expresadas an-
teriormente se confirma según las expresiones de Dewasme,
Coutinho & Wouwer (2011) y Petre, Selişteanu & Roman
(2021) y son empleadas en el ambiente sfunction. Los valores
de los parámetros incluidos en estas ecuaciones junto a sus
respectivas referencias bibliográficas se resumen en la Tabla
V del Anexo C.
mentación - Tasa de crecimiento especı́fica aparente”: Se
obtuvo a partir de la app PID Tuner de MATLAB el cual,
luego de utilizar los datos de la respuesta a una perturbación
de 0,05 g/L en el flujo de alimentación en un tiempo de 0,2
horas, arrojó un ajuste de 99.99% para una función de primer
orden. −1, 12 · 109
(13)
2, 92 · 10−3 s + 1
2) Función de transferencia del lazo ”Flujo de ali-
mentación - Temperatura del mosto”: Se obtuvo a partir de
la implementación de una macro en MATLAB, que emplea el
comando tfest al que se le entregan datos de la respuesta a
la perturbación, un tiempo de muestreo y el número de polos
y ceros con el que se desea realizar el ajuste. Una primera
aproximación del número de polos y ceros se determinó
observando el gráfico de la función de transferencia obtenido
en la simulación. A partir de un escalón de 200 rpm a las 3
horas, se obtiene un ajuste de 81,63%, correspondiente a una
función de primer orden.
−1, 46 · 10−6
(14)
0, 20798s + 1
D. Metodologı́a para ajustar la sintonı́a de controladores
1) PID: Para sintonizar los controladores PID, se emplea
la función de transferencia caracterizada anteriormente
para lazo abierto. En el caso del lazo de temperatura, los
parámetros KP , KI y KD del controlador se ajustan con
la planilla AJUSTE PID.xlsx. Para el lazo de control de
la tasa de crecimiento, se utilizó la herramienta PID tuner
de Simulink, donde se ajustan los parámetros de control
para una respuesta tipo escalón seleccionando la cantidad de
polos correspondientes. Para esta simulación en particular,
el controlador PID implementa un control avanzado tipo
feedback que recoge la variable controlada a la salida del
proceso y la reincorpora a la entrada del algoritmo. La Figura
6 del Anexo D ilustra el comportamiento de la biomasa bajo
este control.

2) IMC: Otro algoritmo de control abordado en este
estudio corresponde a IMC que, de manera análoga a PID,
requiere de la caracterización de la función de transferencia
del modelo G(s) y su inversa G̃(s,) útil para definir la
función del controlador. Esta última función recibe el output
de la función de transferencia y la reincorpora a modo de
comparar el error  en cada instante de lectura. A diferencia
del PID la ventaja que presenta este control por sobre el PID,
es que sólo posee un parámetro de ajuste (), mientras que el
controlador anterior posee tres. La adición de este elemento
de control al proceso simulado se describe en la Figura 7 del
Anexo E.
3) Alimentación exponencial y Feedforward: Dentro de
las consideraciones de metodologı́as de innovación del sistema
de control se tiene la incorporación de una alimentación expo-
nencial presentada por Kottelat et al., (2021). La alimentación
exponencial se describe mediante la ecuación (39) que recoge
los procesos de metabolización y mantención celular descritos
por Biener et al., (2010).
   dado por el controlador PID/PI, ya que ajusta muy bien en el
µsp mr,o X0 µsp (t−t0 )
FF = + mS e (15)
YX/S Sf eed
Este bloque de simulación de naturaleza feedforward, al incor-
porarse al observador de estado, puede ser reescrito como un
término energético qr,sp (t) que finalmente es comparado con
otra equivalencia energética qr (t) que corresponde al calor del
reactor que se reincorpora al lazo de control como feedback.
Esta comparación, finalmente, da forma a la desviación de
control:
(t) = qr,sp (t) − qr (t − ∆t) (16)
Siendo (t) el error que el controlador implementado debe
minimizar.
Pese a la elección de Kottelat et al., (2021) de controlar
q y de que la totalidad de la alimentación exponencial se
haya diseñado con este propósito; la presente investigación
decide implementar este tipo de alimentación avanzada de
manera indistinta siendo µapp la variable controlada que es
finalmente comparada en .
El comportamiento simulado para la alimentación exponen-
cial se ilustra en la Figura 8 del Anexo F y su implementación
en el lazo de control propuesto por Kottelat et al., (2021) de
la figura 9 del mismo anexo.
III. R ESULTADOS
Una vez implementadas las ecuaciones diferenciales junto
a los inputs requeridos de la sfunction, se construye el
esquema del proceso en Simulink tanto para el lazo de la
tasa de crecimiento especı́fica aparente como para el de la
temperatura del mosto (ver Anexo G). Con ello, se modela
el comportamiento temporal de X, S, P, V, Tm y Tj durante
35 horas, el cual se ilustra en las Figuras 12 - 13 del Anexo
H. Además, se realiza la comparación de la respuesta de
las variables controladas frente a perturbaciones instantáneas
4
en las variables manipulables. De esto último se ajustan
las funciones de transferencia correspondientes a cada lazo
abierto.
Tras el ajuste y obtención de las funciones de transferencia,
se implementan los algoritmos de control avanzado PI, PID
feedback e IMC sobre el primer lazo de control y PID feedback
e IMC en el segundo lazo, con tal de conocer el mecanismo
de acción de cada algoritmo evaluando su rendimiento según
indicadores IAE e IAVU.
A. Control de la temperatura del reactor
Respecto al control de temperatura del reactor se presenta
una comparación de los controladores PI, PID e IMC en la
Figura 2. Para el análisis se realizó un escalón negativo de un
grado de temperatura en un tiempo de simulación de 35 horas.
En base a esto, se puede analizar que para ambos controladores
existe un offset, de 0,3 ºC grado para PID/PI y 1,2 ºC grado
para IMC. Sin embargo, se tiene que el mejor ajuste viene
lı́mite inferior del escalón, además de poseer un menor error
IAE e IAVU como se aprecia en la Tabla I.
Fig. 2. Comparación controladores lazo de temperatura mosto - flujo de
refrigerante
TABLA I
C OMPARACI ÓN FUNCIONES DE COSTO PARA PI, PID E IMC
Control IAE IAVU
PI 6,313 -0,0163
PID 6,313 -0,0163
IMC 26,745 -0,0427
B. Control de la tasa de crecimiento especı́fica
Respecto al control de la tasa de crecimiento especı́fica
aparente y flujo de glucosa se presenta una comparación
entre las alternativas estimación de µapp (Biener, Kottelat
y sensor de biomasa) mediante un controlador IMC, esto
se presenta en la Figura 3. Dentro de las consideraciones
del sistema, el setpoint se efectúa en µsp = 0,1 hr−1 , se
utiliza una alimentación exponencial y la implementación de
un observador de estado. Con ello se observa que ambos

métodos de estimación de la tasa especı́fica aparente poseen un
excelente y muy similar desempeño, sin embargo, calculando
los errores respectivos presentes en la Tabla II el mejor ajuste
viene dado por Kottelat.
Fig. 3. Comparación alternativas µapp con control IMC del lazo tasa de
crecimiento especı́fica aparente - flujo de glucosa
TABLA II
C OMPARACI ÓN FUNCIONES DE COSTO PARA B IENER Y KOTTELAT
Control IAE IAVU
Kottelat 1,07 −5, 955e−5
Biener 1,071 −5, 895e−5
En base a la selección del método de Kottelat como
mecanismo de estimación de la tasa de crecimiento especı́fica
aparente, se procedió a hacer un análisis del sistema y su
comportamiento respecto a la biomasa, sustrato, producto y
volumen con un control IMC. En la Figura 4 se aprecia
que el volumen no supera los 20 lts, se controla y limita
correctamente la producción de etanol (P), el sustrato es
consumido y la biomasa llega a un valor de 86,16 g/L de
concentración.
Por otro lado, se realizó una comparativa en base a la
producción final de biomasa. Esta se puede apreciar en los
Anexos D y E, donde se obtiene que el controlador por IMC
es quien tiene el mejor desempeño de producción de biomasa,
el cual tiene un valor 86,16 g/L, en comparación al controlador
PID.
Fig. 4. Control tasa de crecimiento especı́fico aparente - flujo de glucosa
método Kottelat
5
Como último análisis se procedió a comparar los contro-
ladores PID e IMC con el cálculo de la tasa de crecimiento
especı́fica propuesta por Kottelat. Esta comparativa se presenta
en la Figura 5. En ambos controladores se tiene un ajustes
similares y muy buenos. Sin embargo, cabe mencionar que
de los errores estimados y presentados en la Tabla III, ambos
controlares presentan la misma agresividad (igual IAVU), pero
el control PID tiene un mayor error acumulado (mayor IAE).
Por ende, el mejor ajuste viene dado por el controlador IMC.
Fig. 5. Comparación controladores tasa de crecimiento especı́fico aparente -
flujo de glucosa método Kottelat
TABLA III
C OMPARACI ÓN FUNCIONES DE COSTO PARA PID E IMC
Control IAE IAVU
PID 1,914 −3, 116e−5
IMC 1,773 −3, 116e−5
IV. C ONCLUSI ÓN
El presente trabajo propone la implementación de dos
lazos de control que manipulan el flujo de alimentación
de glucosa y flujo de refrigerante: dos variables que, de
manera directa o indirecta, repercuten sobre las condiciones
metabólicas de S. cerevisiae con tal de controlar su tasa de
crecimiento. Para ello, se simulan las ecuaciones diferenciales
que modelan el comportamiento metabólico de la levadura
y que se encuentran ampliamente validadas en la literatura.
Se simula el comportamiento simultáneo de ambos lazos de
control. Por otro lado, se integran los componentes de cada
lazo para la caracterización de sus respectivas funciones de
transferencia de primer orden cuyo ajuste a las variables
medidas de referencia es 99.99% y 81.63%.
Adicionalmente, se incorpora de manera satisfactoria el
observador de estado que estima µapp a partir del estudio
calorimétrico del biorreactor según las descripciones hechas
por Biener et al., (2010) y Kottelat et al., (2021). Junto con
esto, se implementan tres controladores (PID, PI e IMC)
para ambos lazos de control y se estima su ı́ndice costo
asociado IAE e IAVU. Luego se compara la respuesta de
cada controlador frente a distintos setpoints de temperatura y

µapp óptimo para la producción de proteı́na recombinante.
Para el lazo de control de tasa de crecimiento especı́fica -
flujo de alimentación de glucosa se seleccionó el controlador
IMC, con IAVU = −3, 116e−5 e IAE = 1, 773. Por otro lado,
para el lazo de temperatura del reactor - flujo de refrigerante
se seleccionó el controlador PID, con IAVU = −0.0163 e IAE
= 6, 313. En base a esto se logro obtener una concentración
de biomasa de 86 g/L utilizando las fórmulas de estimación
propuestas por Kottelat et al, (2021).
Finalmente, como trabajo futuro se propone en primer
lugar, comparar los valores de µapp con los de µreal para
validar y robustecer el estudio calorimétrico. Por otra parte,
se propone evaluar el rendimiento de un controlador tipo
MPC y otros elementos avanzados que finalmente permitan
cuantificar estimadores de costo relativo RIAE y RIAVU entre
los dos controladores seleccionados y los que se propongan
en el futuro.
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Tristezza, M., Tufariello, M., Capozzi, V., Spano, G., Mita, G.,
Grieco, F. (2016). The oenological potential of Hanseniaspora uvarum
in simultaneous and sequential co-fermentation with Saccharomyces
cerevisiae for industrial wine production. Frontiers in Microbiology, 7,
670.
Wang, G., Huang,M., Nielsen, J. (2017). Exploring the potential
of Saccha-romyces cerevisiae for biopharmaceutical protein
production.Current opinion in biotechnology, 48, 77-84.
Well-known. (s.f.). 30L Jacket Glass Reactor. https://www.rotovap-
wellknown.com/jacketed-glass-reactor/30L-jacket-glass-reactor.html
 7

A NEXO A
E STADO DEL ARTE EN M ÉTODOS DE CONTROL Y VARIABLES MEDIDAS

TABLA IV
VARIABLES MEDIBLES DEL ESTADO DEL ARTE

Variable Definición On/Off-line

Base Adición de Base On-line
DO Concentración de oxı́geno disuelto On-line
F Tasa de alimentación de sustrato On-line
HSP Presión On-line
M Masa On-line
N Velocidad de agitación On-line
pH pH On-line
Qair Tasa de aireación On-line
T Temperatura On-line
XAE Composición del flujo de aire de salida On line
µ Viscosidad Off-line
P Concentración de producto Off-line
Sf Concentración de sustrato en la alimentación Off-line
U Actividad de producto enzimático Off-line
X Concentración de biomasa Off-line
Xac Concentración de acetato Off-line
Xal Concentración de alcohol Off-line
XS Concentración de sustrato en el sistema Off-line
CER Tasa de evolución de carbón Calculado
DS Demanda de sustrato Calculado
OTR Tasa de transferencia de oxı́geno Calculado
OUR Tasa de uptake de oxı́geno Calculado
QS Tasa especı́fica de uptake de sustrato Calculado
RQ Cociente de respiración Calculado
YXS Rendimiento de biomasa en sustrato Calculado

Variables medidas en distintos métodos de control propuestos en la literatura (Mears et al., 2017). El atributo Online se
refiere al método de monitorización de la variable medida en tanto puede realizar lecturas de forma continua e in vivo. En
contraposición, Offline se refiere a la realización de lecturas en forma discreta con intervalos de tiempo normalmente extensos.
”Calculado” indica que la variable en cuestión no es directamente medida a través de sensores y, en su lugar, se vale de
observadores de estado u otros algoritmos capaces de cuantificar una variable de interés a partir de otra variable sensada.
 8

A NEXO B
D EDUCCI ÓN DE LOS BALANCES DE MASA Y ENERG ÍA PARA LA MODELACI ÓN
1) Balance de biomasa:
 :−0Salida :0
:+0Generación − Consumo

Entrada
Acumulación =    (17)

dm
= rX m (18)
dt
d(XV )
= rX XV (19)
dt
Donde X corresponde a la concentración de biomasa (g/m3 ) y V el volumen de la solución que varı́a linealmente en el tiempo
en proporción al flujo de alimentación según su expresión:
V (t) = V0 + Fin t (20)
Donde V0 corresponde al volumen inicial contenido en el biorreactor, y Fin al flujo volumétrico entrante. Finalmente, se
resuelve la ecuación 19:
d(XV ) dX dV
=V +X = rX XV
dt dt dt
dX Fin
+X = rX X
dt V
dX Fin
= rX X − X (21)
dt V
Donde rX corresponde a la tasa de generación de biomasa global que puede articularse como µreal y que se descompone según
las tres reacciones metabólicas por las que atraviesa S. cerevisiae: (2) Oxidación de sustrato, (3) Fermentación de sustrato y
(4) Oxidación de producto (Dewasme, Coutinho & Wouwer, 2011).
min(rS , rS crit )
r1 = (22)
kS1
max(0, rS − rS crit )
r2 = (23)
kS2
−rS )
max(0, kos (rSkcrit
op
P
P +KP )
r3 = (24)
kP 3
Estas tres tasas no lineales de consumo describen la etapa metabólica en la que se encuentra el cultivo y que depende tanto
de la disponibilidad de sustrato como de la concentración de etanol. Finalmente, se multiplica cada tasa de generación ri por
un coeficiente kXi que estima el rendimiento en la generación de biomasa de cada reacción, obteniendo finalmente la tasa
de generación global rX (equivalente a la tasa de crecimiento especı́fica real). De este modo, se reescribe la ecuación 21 en
términos de la tasa de dilución D (= FVin ) y se obtiene el mismo comportamiento para la concentración de biomasa descrita
por Dewasme, Coutinho & Wouwer (2011):
dX
= (kX1 r1 + kX2 r2 + kX3 r3 )X − DX (25)
dt
donde kX1 r1 + kX2 r2 + kX3 r3 = µreal .

2) Balance de masa por sustrato:

  :0
:+0Generación
Acumulación = Entrada − 
Salida  − Consumo (26)

d(SV )
= Sin Fin − rS XV (27)
dt
Donde Sin representa es la concentración de sustrato que ingresa al biorreactor y rSX el consumo de sustrato por parte del
cultivo equivalente a kS1 r1 + kS2 r2 .
dS dV
V + S = Sin Fin − rS XV (28)
dt dt
dS
+ DS = DSin − rS X (29)
dt
dS
= DSin − (kS1 r1 + kS2 r2 )X − DS (30)
dt
 9

3) Balance de masa por producto:

 :−0Salida :0
:+0Generación − Consumo

Entrada
Acumulación =    (31)

De manera análoga al balance de biomasa, se conoce la ecuación diferencial que describe la concentración de producto (etanol)
generada por el cultivo:
dP
= rP X − DP (32)
dt
Donde rP corresponde a la tasa de producción de etanol equivalente a kP 2 r2 + kP 3 r3 resultando en:
dP
= (kP 2 r2 + kP 3 r3 )X − DP (33)
dt
Otros balances diferenciales relativos a especies como O2 y CO2 no serán abordados dentro de este estudio pues se supone
concentraciones de saturación de estos gases.

4) Balance de masa por volumen: .

Se procede a establecer el balance de masa relativo al volumen y temperatura del mosto junto a la temperatura de chaqueta.
Para ello, sencillamente se recoge la expresión diferencial de la ecuación 20:
dV
= Fin (34)
dt
5) Balance de energı́a para el mosto:
:0

Acumulación = Entrada − Salida + Generación − 
Consumo
 (35)

q̇m = q̇alim − q̇j + q̇p + q̇s (36)

| {z } |{z} | {z }
Entrada Salida Generación
Donde q̇alim corresponde a la tasa de calor que ingresa al volumen de control vı́a la alimentación de sustrato. q̇j la tasa de
calor cedido a la chaqueta contenedora de refrigerante. Por su parte, los términos de generación q̇p y q̇s corresponden al calor
que aporta la metabolización de sustrato por parte del cultivo (de naturaleza exotérmica) y el calor aportado por la agitación
respectivamente.
dTm ∆HrO 2
V ρm cpm = cpm (Tin − Tm )Fin ρm − U Aj (Tm − Tj ) + + Ws (37)
dt M MO 2

Donde Tin es la temperatura del flujo de alimentación al fed-batch y Tj la temperatura de la chaqueta. U es el coeficiente
global de transferencia de calor y Aj la superficie de intercambio de calor entre el biorreactor y la chaqueta. El término ∆Hr O2
M MO 2
corresponde al calor generado por el cultivo debido al uptake de O2 y M MO 2 la masa molar de este gas. Ws es la energı́a
aportada por agitación cuyo valor es fijo y corresponde a la potencia del agitador. Reestructurando la ecuación 37 se tiene:
dTm Fin U Aj (Tm − Tj ) ∆HrO 2 Ws
= (Tin − Tm ) − + + (38)
dt V ρm cpm V M MO 2 ρm cpm V ρm cpm V

Cualquier otro aporte calorı́fico al volumen de control se considera despreciable frente a los ya descritos (Biener et al. 2012).

A su vez, el calor liberado por la metabolización de sustrato q˙p se representa según la ecuación (39) aportada por Biener et
al., (2010):
µ
qp = ( + mainδ )V X (39)
Yδ
Donde Yµδ corresponde al calor asociado al crecimiento celular y mainδ a las reacciones de mantenimiento (ambas se consideran
constantes). Luego, la diferenciación temporal de 39 da lugar a:
dqp µ d(V X)
= ( + mainδ ) (40)
dt Yδ dt
Incorporando la expresión de 25 en 40 se tiene:
dqp µ dX
= ( + mainδ )(Fin X + V ) (41)
dt Yδ dt
Incorporando nuevamente la expresión de 25:
dqp µ
= ( + mainδ )(Fin X + V µX − Fin X) (42)
dt Yδ
 10

Retomando la expresión integral para q˙p en 39 se tiene:

dqp µ dqp
= ( + mainδ )V µX = µapp qp (43)
dt Yδ dt
Cuya resolución discreta resulta en:
Xt
ln( Xt−∆t )
µapp,t = (44)
∆t
6) Balance de energı́a para la chaqueta: Tomando como volumen de control la chaqueta que cubre el biorreactor:
:0
 :0
Acumulación = Entrada − Salida +   − 
Generación 
Consumo (45)

q̇j = q̇m − q̇jin (46)

|{z} |{z}
Entrada Salida

De forma análoga a las expresiones para q̇i presentadas en la ecuación 37 y siguiendo la ley 0 de la termodinámica, se tiene:
dTj
V ρj cpj = U Aj (Tm − Tj ) − cpj (Tj − Tjin )Fjin ρj (47)
dt
Donde el primer sumando considera Tm > Tj , por lo que representa el aporte energético desde el biorreactor hacia la chaqueta.
El segundo sumando, por su parte, da cuenta del calor que se pierde por el continuo recambio de refrigerante proporcional a
Fjin .
dTj U Aj (Tm − Tj ) Fin
= − (Tj − Tjin ) (48)
dt V ρj cpj V
Se considera el supuesto de que la chaqueta cubre la totalidad del biorreactor y que es de naturaleza adiabática, por lo que se
descartan pérdidas de calor hacia el ambiente.
 11

A NEXO C
PAR ÁMETROS EMPLEADOS PARA LA MODELACI ÓN MATEM ÁTICA

TABLA V
PAR ÁMETROS

Parámetro Valor Fuente Parámetro Valor Fuente

D Falim /V [h] Dewasme (2011) rs µs · S/(S + Ks) Dewasme (2011)
O 0,035 [g/L] Dewasme (2011) rscrit µo · O · Kip/(kos · (O + Ko) · (Kip + P )) Dewasme (2011)
Sin 350 [g/L] Dewasme (2011) rO2 0,1184 [gO2/gDCWh] Hagman, Säll & Piškur (2014)
kx1 0,49 Dewasme (2011) Vj 10 [L] Well Known (s.f.)
kx2 0,05 Dewasme (2011) U Aj 3750 · 4184 [J/(h*K)] Taller 3 (2020)
kx3 0,72 Dewasme (2011) ρs 1,13 [kg/L] Engineering ToolBox
ks1 1 Dewasme (2011) ρm 1080 [kg/m3] Petre, Selişteanu & Roman (2021)
ks2 1 Dewasme (2011) ρj 1000 [kg/m3] Biener (2010)
kp2 0,48 Dewasme (2011) masam V·rhom/1000 [kg] Calculado
kp3 1 Dewasme (2011) mf Falim ·1,13 [kg/h] Biener (2010)
µs 3,5 [gS/gX/h] Dewasme (2011) mj Fj [kg/h] Biener (2010)
µo 0,256 [gO2/gX/h] Dewasme (2011) cpf 4184 [J/kg/k] Biener (2010)
Ks 0,1 [gS/L] Dewasme (2011) cpm 4184 [J/kg/k] Biener (2010)
Kip 10 [gE/L] Dewasme (2011) cpj 4184 [J/kg/k] Biener (2010)
Ko 0,0001 [gO2/L] Dewasme (2011) dH 91, 2 · 106̂/180 Petre, Selişteanu & Roman (2021)
Kp 0,1 [gE/L] Dewasme (2011) Tjin 285 [K] Giovanetti (2018)
kos 0,3968 [gO2/gS] Dewasme (2011) Talim 293 [K] Biener (2010)
kop 1,104 [gO2/gE] Dewasme (2011) qs 250 [W] Biener (2010)

A NEXO D
C ONTROLADOR PID

Fig. 6. Concentraciones dentro del reactor cuando se usa un controlador PID.

 12

A NEXO E
C ONTROLADOR IMC

Fig. 7. Concentraciones dentro del reactor cuando se usa un controlador IMC.

A NEXO F
A LIMENTACI ÓN EXPONENCIAL Y LAZO DE CONTROL

Fig. 8. Alimentación exponencial

Fig. 9. Lazo de alimentación exponencial diseñado por Kottelat et al., (2021).

 13

A NEXO G
I MPLEMENTACI ÓN DEL PROCESO EN S IMULINK

Fig. 10. Lazo 1: Tasa especı́fica de crecimiento - Flujo de alimentación

Fig. 11. Lazo 2: Temperatura del mosto - Flujo de refrigerante

 14

A NEXO H
S IMULACIONES DEL PROCESO

A. Concentraciones y volumen

En la Figura 12 se muestran las concentraciones y el volumen del reactor en el tiempo. Se observa que se tienen condiciones
de sustrato limitante, frente a lo cual la biomasa opta por reproducirse por sobre la producción de etanol. La tasa de crecimiento
varı́a según la concentración de sustrato y producto en el medio, manteniéndose constante una vez se agota el etanol. Por otra
parte, se observa que el volumen va aumentando progresivamente según ingresa flujo de alimentación.

Fig. 12. Simulación de las concentraciones de X, S, P y del volumen V durante 35 horas.

B. Temperaturas

En la Figura 13, se ilustra el comportamiento de la temperatura del mosto y la de la chaqueta a lo largo de 35 horas de
simulación. Se observa que ambas convergen a la temperatura del refrigerante, lo que se debe a la ausencia de control y al flujo
constante de refrigerante. Cabe mencionar que si se aumenta la temperatura del refrigerante, ambas temperaturas simuladas
convergen a valores fijos pero distintos entre sı́ debido a que se produce un equilibrio termodinámico.
 15

Fig. 13. Simulación de las temperaturas del mosto y de la chaqueta durante 35 horas.
 16

A NEXO I
S ENSOR DE NIVEL DE L ÍQUIDO

TABLA VI
DATOS SENSOR DE NIVEL

Parámetro DLF 8980

Altura máxima [m] 2
Rango de salida [mA] 4 - 20
Exactitud 0.01
Tiempo de muestreo [s] 0.1
Retardo 0
Desviación estándar 0.005
Sensibilidad 0.08
Constante de tiempo [s] 0.033
Sesgo 0

Fig. 14. Datasheet del sensor de nivel DLF 8980

Link al datasheet: https://media.trafag.com/datasheet/H72450b EN 8980 DLF Level Switch with display.pdf
 17

A NEXO J
S ENSOR DE BIOMASA

TABLA VII
DATOS SENSOR DE BIOMASA

Parámetro proBE 3000

Rango de entrada [g/L] 0.005 - 200
Rango de salida [mA] 4 - 20
Exactitud 0.15
Tiempo de muestreo [s] 0.01
Retardo 0
Desviación estándar 0.075
Sensibilidad 0.08
Constante de tiempo [s] 0.0067
Sesgo 0

Fig. 15. Datasheet del sensor de biomasa proBE 3000

 18

A NEXO K
C OMPARACI ÓN B OMBAS PERIST ÁLTICAS

TABLA VIII
C OMPARACI ÓN DE BOMBAS PERIST ÁLTICAS PARA FLUJO DE ALIMENTACI ÓN DE GLUCOSA

Parámetro DG series LP-L100-1S-2 BT100M BZ1203

Flujo Glucosa Glucosa Glucosa Refrigerante
Velocidad máxima [RPM] 100 100 100 330
Caudal máximo [mL/min] 36 500 380 19400
Potencia AC220V AC100V 240V/25W AC110V 2̃20V/<22W DC24V,<20A
Exactitud 0,5 % 0,5 % 0,5 % -
Peso [kg] 3,8 2,38 3,98 5,7
Presión[psi] 7 - - 20,30
Displacement [L/rev] 0,0002 0,005 0,0038 0.05
Precio [CLP] $ 123.685 $ 596.292 $ 193.961 -

Fig. 16. Comparación bomba flujo de glucosa

Fig. 17. Comparación bomba flujo de glucosa

 19

Fig. 18. Datasheet de las bombas de glucosa BT100M y DG Series (BT100MDG1 12)

Fig. 19. Datasheet de la bomba de glucosa LP-L100-1S-2

Link al datasheet: https://drifton.es/tienda-online/9-bomba-peristaacuteltica-de-flujo-variable/2299-bomba-de-flujo-peristaacuteltica-lp-l100-1s-2/

Fig. 20. Datasheet de las bombas de refrigerante BZ1203.Link al datasheet: https://www.jihpump.net/products/detail/1557304887418.html

 20

(a) DG series (b) PP-L-1S-2

Fig. 21. Gráficos del caudal en función de las RPM para las bombas estudiadas.
 21

A NEXO L
S ENSORES DE TEMPERATURA

TABLA IX
C OMPARACI ÓN DE SENSORES DE TEMPERATURA

Parámetro Anderson Mini Burkert 8418 IKA PT 100,53 GTL 142

Ubicación Biorreactor Biorreactor Biorreactor Chaqueta
Tiempo respuesta [s] 5,2 12 10 0,3
Exactitud 0,15 0,15 0,2 0,2
Rango entrada [ºC] -50...+250 -50...+150 -20...+260 -40...+200
Rango salida [mA] 4-20 4-20 4-20 4-20
Constante tiempo [s] 1,733 4 3,333 0,1
Tiempo muestreo [s] 0,1733 0,4 0,333 0.01
Sensibilidad 0,053 0,08 0,057 0.067
Retardo 0 0 0 0
Sesgo 0,003 0 0 0
Costo [CLP] $160.000 $152.700 $353.200 $150.000

(a) Anderson Mini (b) Burkert 8414

(c) IKA PT 100.53 (d) Todos

Respuesta de los sensores de temperatura frente a una perturbación tipo escalón.

 22

Fig. 22. Datasheet Burkert 8418

Link al datasheet: https://www.burkert.com/en/Media/plm/DTS/DS/DS8418-IO-Link-EU-EN.pdf?id=DTS0000000000000001000416970ENA

Fig. 23. Datasheet IKA PT 100,53

Link al datasheet: https://www.ika.com/es/Productos-Lab-Eq/Agitadores-Magneticos-csp-188/PT-10053-Sensor-de-temperatura,
-recubierto-Descargas-cpdl-4499700/

Fig. 24. Datasheet Anderson Mini

Link al datasheet: https://www.anderson-negele.com/wp-content/themes/andersonnegele/assets/tsmp/pdf/TSMP 50119 en eu.pdf

.
 23

Fig. 25. Datasheet GTL 142

Link al datasheet: https://pdf.directindustry.com/pdf/ghm-messtechnik-gmbh/ghm-food-beverage-pharmaceutical-industries-product-catalog-2019/
13944-860579.html#open1763842