3.

CASOS APLICADOS

3.1. Aplicación del sistema de feromonas de levadura para la

comunicación celular controlada y la amplificación de señales1

El objetivo de este trabajo fue explotar el sistema de feromonas de

levadura para la comunicación controlada célula-célula y como circuito
de amplificación en aplicaciones técnicas, por ejemplo; biosensores.
Como prueba de este principio, se desarrollaron células de
Saccharomyces cerevisiae recombinantes que expresan proteína
fluorescente verde mejorada (EGFP) en respuesta a diferentes
concentraciones de la feromona de apareamiento del factor alfa (α).
Tras la adición de factor α sintético, la fluorescencia aumenta
fuertemente después de 4 h. Además, las células del factor α pudieron
inducir la expresión de EGFP en un co-cultivo con células sensoras,
solo si ambos tipos de células se les suprimieron el gen BAR1, que
codifica la proteasa del factor α. Para aplicaciones técnicas, la
inmovilización de células funcionalizadas puede resultar beneficiosa.
Mostramos que la expresión de EGFP inducida por feromonas es eficaz
en células inmovilizadas con alginato.
Basándonos en el factor α de S. cerevisiae, desarrollamos un sistema
de comunicación celular controlado y un circuito de amplificación para la
expresión impulsada por feromonas de una proteína diana. El sistema
es eficaz tanto en suspensión como después de la inmovilización
celular.
La importancia e impacto del estudio del conjunto desarrollado de cepas
de levadura recombinantes es la base para aplicar el sistema de
feromonas de levadura para la producción y amplificación de señales en
biosensores.

3.2. Plataforma PAT para fermentaciones seguras de gas de síntesis en

modo batch, feed-batch y quimiostato con Rhodospirillum rubrum2

Recientemente, el gas de síntesis ha ganado un interés significativo

como materia prima renovable y sostenible, en particular para la
producción biotecnológica de poli [ R] ‐3 ‐ hidroxibutirato (PHB). El PHB
es un poliéster biodegradable y biocompatible producido por algunas
bacterias que crecen en el componente principal del gas de síntesis; el
CO. Sin embargo, trabajar con gas de síntesis es un desafío debido a la
toxicidad del CO y al peligro de explosión del H2, otro componente
principal del gas de síntesis. Además, el control de bioprocesos
necesita herramientas de seguimiento y métodos analíticos específicos
que difieran de las fermentaciones estándar. A continuación,
presentamos una plataforma de fermentación de gas de síntesis con un
enfoque en instalaciones de seguridad y tecnología analítica de
procesos (PAT) que sirve como base para evaluar la fisiología de la
bacteria Rhodospirillum rubrum productora de PHB. La plataforma
 incluye (i) análisis de gases de escape con un espectrómetro de masas
cuadrupolo en línea para medir el consumo de CO y las tasas de
producción de H2 y CO2, (ii) un citómetro de flujo en línea para
determinar el recuento total de células y el contenido de PHB
intracelular y (iii) diferentes sensores en línea, en particular un sensor
redox que es importante para confirmar que las condiciones de cultivo
son adecuadas para la metabolización del CO de R. rubrum. Además,
presentamos como primeras aplicaciones de la plataforma un proceso
fed-batch y un quimiostato con R. rubrum para la producción de PHB a
partir de gas de síntesis.

3.3. Propagación de la precisión de la medición a la calidad del control

y la estimación del sensor suave de biomasa3

En el desarrollo y fabricación de procesos biofarmacéuticos, la medición

en línea de la biomasa y las tasas de rotación específicas derivadas es
una tarea central para monitorear y controlar fisiológicamente el
bioproceso. Sin embargo, los sensores de tipo duro como la
espectroscopia dieléctrica, la fluorescencia del caldo o la medición de la
permitividad tienen varias desventajas. Por lo tanto, los sensores
blandos, que utilizan mediciones de la corriente de gas de escape y la
alimentación del sustrato para conciliar las tasas de rotación y
proporcionar una estimación en línea de la formación de biomasa, son
alternativas inteligentes. Para el procedimiento de conciliación, los
balances de masa y energía se utilizan junto con estimaciones de
precisión de las tasas de conversión medidas, que hasta ahora fueron
elegidas arbitrariamente y estáticas durante todo el proceso. En esta
contribución, Presentamos una estrategia novedosa dentro del marco
del sensor blando (denominado sensor blando adaptativo) para
propagar las incertidumbres de las mediciones a las tasas de
conversión y demostrar los beneficios: Para condiciones industrialmente
relevantes, por la presente, el error de la tasa de formación de biomasa
estimada resultante y el consumo específico de sustrato. La tasa podría
reducirse en un 43 y un 64%, respectivamente, en comparación con los
enfoques tradicionales de sensores suaves. Además, presentamos un
flujo de trabajo genérico para determinar la precisión de la señal sin
procesar requerida para obtener precisiones predefinidas de
estimaciones de sensores suaves. De este modo, se pueden
seleccionar los dispositivos de medición y los intervalos de
mantenimiento adecuados. Además, utilizando este flujo de trabajo,
demostramos que la precisión de la estimación del sensor suave se
puede aumentar adicional y sustancialmente.
1. Gross A, Rödel G, Ostermann K. Application of the yeast pheromone
system for controlled cell-cell communication and signal amplification.
Lett Appl Microbiol. 2011;52(5):521-526.
2. Karmann S, Follonier S, Egger D, Hebel D, Panke S, Zinn M. Tailor-
made PAT platform for safe syngas fermentations in batch, fed-batch
and chemostat mode with Rhodospirillum rubrum. Microb Biotechnol.
2017;10(6):1365-1375.
3. Steinwandter V, Zahel T, Sagmeister P, Herwig C. Propagation of
measurement accuracy to biomass soft-sensor estimation and control
quality. Anal Bioanal Chem. 2017;409(3):693-706.