UNIVERSIDAD DE NACIONAL DE SAN

AGUSTÍN DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERÍA DE
PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE
INGENIERAS DE INDUSTRIAS

BIOTECNOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS

INFORME N°3:
CINETICA DE LA PRODUCCION DE
METABOLITOS
ALIMENTARIAS

DOCENTE:
 MG. SONIA JACKELINE ZANABRIA GÁLVEZ
PRESENTADO POR
 CHOQUEPUMA APAZA NANCY.
TURNO:
 LUNES 2:00 – 3:40 pm

AREQUIPA-PERÚ

2018
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DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA

PRACTICA N°3
CINETICA DE LA PRODUCCION DE METABOLITOS

I. GENERALIDADES.

Los estudios cinéticos son necesarios para entender el comportamiento de cualquier

fermentación y, en general, consisten en la medición o estimación de las velocidades de

síntesis celulares, de formación de productos y de los efectos del medio ambiente sobre

estas velocidades.

En muchos casos de los procesos fermentativos resulta de vital interés el determinar la

clase y cantidad de metabolitos que se han formado, usualmente estos procesos siguen una

cinética de producción.

Para el desarrollo de procesos microbianos para la formación de productos es necesario

optimizar 3 elementos: el rendimiento del producto por gramo de sustrato, la concentración

del producto y la velocidad de formación del mismo (cantidad de sustrato

consumido/tiempo).

Los procesos de fermentación en batch han sido clasificados de muchas formas, una de

ellas es la que relaciona la formación del producto con la utilización del sustrato:

a. Tipo I: Formación del producto directamente relacionado con la utilización del

sustrato.

b. Tipo II: Formación del producto indirectamente relacionado con la utilización del

sustrato.

c. Tipo III: Formación del producto aparentemente no relacionado con la producción

del sustrato.

La finalidad del trazado de las curvas es entender el comportamiento de los divesos

microorganismos ante las condiciones medioambientales a la que es expuesto a través de

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su consumo de sustrato, de la formación de metabolitos y su característica de crecimiento,

pudiendo de esa forma hallar valores característicos para estudiar su cinética.

II. OBJETIVOS.

 Hallar las curvas de la cinética de la producción de invertasa (exo y endo), producción de

biomasa y la de consumo de sustrato (glucosa) a partir de Saccharomyces Cerevisiae.

 Hallar los valores de la velocidad de formación de invertasa Rp, la velocidad de consumo

de sustrato Rs, velocidad especifica de producción de metabolito Rx

III. FUNDAMENTO.

IV. MATERIALES Y EQUIPOS.

4.1. Materiales.

 Suspensión de Levadura (Saccharomyces Cerevisiae)

 Medio de cultivo para levaduras

 Buffer acetato de sodio 0.1M, pH = 5

 Buffer acetato de sodio 0.1M, pH = 5, conteniendo sacarosa al 1%

 Reactivo DNS

 Sal de Rochelle

 Agua destilada

4.2. Equipos e instrumentos.

 Matraz de 250mL y 10 unidades de 100mL

 Vasos de 250mL

 Tubos de ensayo de 15mL

 Gradilla

 Pipetas de 1mL y 10mL

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 Placas Petri

 Probeta de 100mL

 Termómetro

 Autoclave

 Centrífuga

 Estufa (graduable 30°C) o Baño María Shaker

 Balanza

 Cocina

 Potenciómetro

 Espectrofotómetro, Cocinilla.

 Gasa, Algodón, Pabilo, Alcohol.

V. MÉTODOS.

Los métodos a seguir son:

a) Determinación de Azucares Reductores:

Se hará uso del método de Miller (1959), los resultados se expresarán en umoles

de azucares reductores expresados en glucosa.

b) Determinación de la Actividad Enzimática de la Invertasa:

Se seguirá el siguiente método:

“En un tubo se llenará 5mL de la solución Buffer acetato 0.1M, pH 5, conteniendo

sacarosa al 4% y se mezclarán con 1mL de la solución enzimática. Luego, se

llevará a incubación por 10min. A 50°C, pasado este tiempo se procederá a

inactivar a 100°C por espacio de 2min., luego a este sistema se le medirá la

cantidad de azúcares reductores por el método del DNS. Una unidad de actividad

enzimática será definida como la cantidad de azucares reductores formado

(umoles) por mL de enzima por minuto a las condiciones de 50°C y un pH de 5.0.

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VI. PROCEDIMIENTO.

Se procederá de la siguiente forma:

6.1. Preparación del Pre-Cultivo:

Preparar un pre-cultivo de la levadura (Saccharomyces Cerevisiae) con un medio

adecuado y dejar este a 30°C por espacio de 24hrs.

6.2. Preparación de la Curva de Producción de Biomasa, Consumo de sustrato

(glucosa) y Producción de invertasa vs tiempo:

Se procederá a llenar 12 erlenmeyers (100mL) con 20mL de medio de cultivo, luego

de esterilizados serán inoculados cada uno con un 5% del pre-cultivo. Se llevarán a los

erlenmeyers a un shaker a la Temperatura de 30°C con agitación constante.

Cada cierto tiempo será sacado un erlenmeyer el cual será centrifugado y se obtendrán

dos fracciones el sobrenadante y las células. La fracción celular será diluida a una

concentración adecuada con una solución buffer y se leerá su D.O. a la longitud de

onda de 600nm, luego a esta misma solución se le someterá a la prueba de la actividad

enzimática de tal forma que se hallará la actividad enzimática de las invertasas endo

celulares.

Para hallar los valores de biomasa se procederá de la misma forma como se trabajó en

la práctica de curva de crecimiento microbiano.

Al sobrenadante se le determinará en primera instancia la concentración de azucares

reductores expresados en glucosa y luego se le determinará la actividad enzimática que

presentan las invertasas exocelulares.

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VII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Realizar los cálculos para cada muestra y método. Discutir.

Los primeros resultados se reportarán en el siguiente cuadro, que se describe en breve.

Realizada la práctica de laboratorio, se obtuvo los siguientes resultados, los cuales fueron

recopilados en los cuadros que son expuestos a continuación:

VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

IX. BIBLIOGRAFÍA

 BUITRAGO J, TENJO D. (1997). Obtención de un sustrato fermentable de origen

vegetal y su evaluación con células libres de Saccharomyces cerevisiae.

 DE MARTIN, A (2005). Control del metabolismo de Saccharomyces cerevisiae en la

síntesis del glutatión en: Aspectos generales del metabolismo de Saccharomyces

cerevisiae. Universidad de granada. Granada, España.

 EFECTO DEL SUSTRATO EN LA LIBERACIÓN DE CO2 POR:

SACCHAROMYCES CEREVISIAE.

 FAJARDO E, SARMIENTO S. (2007). Evaluación de melaza de caña como sustrato

para la producción de Saccharomyces cerevisiae en: Marco teórico, Saccharomyces

cerevisiae, requerimientos, composición. Pontificia Universidad Jaraviana. Bogotá,

Colombia.

 SUAREZ M, GARRIDO N, GUEVARA C. (2016). Levadura Saccharomyces

cerevisiae y la producción de alcohol. Revisión bibliográfica en: proceso tecnológico

para la producción de alcohol y levadura Saccharomyces cerevisiae. La Habana, Cuba.

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 VAN DIJKEN J.P. AND SCHEFFERS W.A. (1986). Redox se equilibra en el

metabolismo de los azúcares por las levaduras. FEMS Microbiol. Rev. 32: 199-224

 VERDUYN C., POSTMA E., SCHEFFERS W.A. AND VAN DIJKEN J.P. (1992).

Efecto del ácido benzoico sobre los flujos metabólicos en la levadura: un estudio de

cultivo continuo sobre la regulación de la respiración y la fermentación alcohólica.

Levadura 8: 501-517.

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X. ANEXOS

CÁLCULOS
10.1. Determinación de la Biomasa.

Cuadro 4. Datos de la Curva patrón para la determinación de la Biomasa.

Muestra Dilución g/10ml Biomasa (g/L) D.O 600 nm

M1 0.1 0.0018 0.01066

M2 0.2 0.0037 0.01933

M3 0.3 0.0055 0.02066

M4 0.4 0.0074 0.03333

M5 0.5 0.0092 0.04033

Fuente: Elaboración propia, 2018.

 Los datos que se muestran en el presente cuadro son del mejor ajuste de la práctica

de Crecimiento microbiano, de donde se obtuvo una curva patrón de calibración

estándar de Biomasa versus Densidad óptica a 600nm.

Curva Patrón para biomasa

0.045

0.04

0.035
D.O (600 nm )

0.03

0.025

0.02 y = 3.9683x + 0.003

R² = 0.9609
0.015

0.01

0.005

0
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01
Biomasa (g/L)

Gráfica N°3. Curva Patrón de Biomasa versus Densidad óptica.

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 Como se observa se trabajó con 5 diluciones de concentraciones conocidas, la cual

nos sirve para conocer la concentración aproximada de la levadura Saccharomyces

cerevisiae.

 El R² de la curva de calibración es muy cercano a 1.

10.1.1. Determinación de la Densidad óptica.

A partir de la Curva de calibración de la práctica anterior, se procedió a

determinar la densidad óptica:

𝒀 = 𝒃𝑿 + 𝒂
𝑫. 𝑶 = 𝒃𝑿 + 𝒂
𝑫. 𝑶 = 𝟑. 𝟗𝟔𝟖𝟑𝑿 + 𝟎. 𝟎𝟎𝟑

𝑫. 𝑶 − 𝒂
𝑿=
𝒃
Dónde:
a = 0.0032
b = 3.8878
y = D.O

Cuadro 5. Determinación de la biomasa a partir de la curva de Calibración.

TIEMPO D.O (600 nm) Biomasa (g/L)

0 0.312 0.0779
1 0.402 0.1005
2 0.421 0.1053
3 0.563 0.1411
4 0.481 0.1205
5 0.629 0.1578
6 0.685 0.1719
7 0.746 0.1872
8 0.787 0.1976
10 0.864 0.2170
24 0.903 0.2268
48 0.987 0.2480
Fuente: Elaboración propia, 2018.

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 El Cuadro 5 nos muestra los valores de Biomasa expresados en g/L, dichos valores

se obtuvieron a partir de la ecuación de la gráfica de la Curva de Calibración luego

de conocer los valores de a y b.

10.2. Determinación del Sustrato (Glucosa).

a. Ecuación de la recta patrón para la determinación de la Glucosa.

𝒀 = 𝟎. 𝟎𝟔𝟐𝟑𝑿 + 𝟎. 𝟎𝟕𝟐𝟕

 A continuación, se hace la correlación de la ecuación de la recta para la

determinación de glucosa:

𝒀 = 𝒃𝑿 + 𝒂
𝑫. 𝑶 = 𝒃𝑿 + 𝒂
𝑫. 𝑶 = 𝟎. 𝟎𝟔𝟐𝟑𝑺 + 𝟎. 𝟎𝟕𝟐𝟕
𝑫. 𝑶 − 𝒂
𝑺=
𝒃
𝑫. 𝑶 − 𝟎. 𝟎𝟕𝟐𝟕
𝑺=
𝟎. 𝟎𝟔𝟐𝟑

 Como se muestra en la ecuación de la recta según Olazabal y Castañeda (2005)

los valores de a y b son los siguientes:

a = 0.0727

b = 0.0623

 Luego de conocer dichos valores, se procedió a reemplazar las diferentes lecturas

de densidad óptica que se midieron en los diferentes tiempos del proceso a partir

del tiempo 0 horas hasta el tiempo de 48 horas.

 El resultado de Glucosa estará expresado en mmol/L A.R Glucosa, debido a que

las unidades de la ecuación de Olazabal y Castañeda (2005) está expresado en

las mismas unidades.

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Cuadro 6. Determinación de la Glucosa a partir de la curva de Calibración de

Olazabal y Castañeda (2005).

TIEMPO D.O Azucares reductores 550nm S (mmol/L) A.R Glucosa

0 0.879 12.9422
1 0.834 12.2199
2 0.823 12.0433
3 0.687 9.8604
4 0.376 4.8684
5 0.274 3.2311
6 0.101 0.4543
7 0.099 0.4222
8 0.097 0.3900
10 0.096 0.3740
24 0.095 0.3579
48 0.093 0.3258
Fuente: Elaboración propia, 2018.

 El Cuadro 6 nos muestra los valores de Glucosa expresados en mmol/L A.R

Glucosa, dichos valores se obtuvieron a partir de la ecuación de la gráfica de la

Curva de Calibración de Olazabal y Castañeda (2005) luego de conocer los

valores de a y b.

b. Conversión de mmol/L a g/L.

Para realizar futuros cálculos como velocidad de consumo de sustrato(rs),

constante de mantenimiento(ms) y coeficiente de rendimiento de conversión de

sustrato en biomasa (g de biomasa / g de sustrato), se necesita que la glucosa esté

expresada en unidades de g/L por lo que se procederá a convertir mmol/L a g/L.

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Cuadro 7. Valores de conversión de mmol/L a g/L.

S (mmol/L) A.R Glucosa S (g/L)

12.9422 2.3296
12.2199 2.1996
12.0433 2.1678
9.8604 1.7749
4.8684 0.8763
3.2311 0.5816
0.4543 0.0818
0.4222 0.0760
0.3900 0.0702
0.3740 0.0673
0.3579 0.0644
0.3258 0.0587
Fuente: Elaboración propia, 2018.

10.3. Determinación del Sustrato para el “Endo” y “Exo” de la prueba de la

Invertasa.

a. Ecuación de la recta patrón para la determinación de la Glucosa.

𝒀 = 𝟎. 𝟎𝟔𝟐𝟑𝑿 + 𝟎. 𝟎𝟕𝟐𝟕

 A continuación, se hace la correlación de la ecuación de la recta para la

determinación de glucosa:

𝒀 = 𝒃𝑿 + 𝒂
𝑫. 𝑶 = 𝒃𝑿 + 𝒂
𝑫. 𝑶 = 𝟎. 𝟎𝟔𝟐𝟑𝑺 + 𝟎. 𝟎𝟕𝟐𝟕
𝑫. 𝑶 − 𝒂
𝑺=
𝒃

𝑫. 𝑶 − 𝟎. 𝟎𝟕𝟐𝟕
𝑺=
𝟎. 𝟎𝟔𝟐𝟑

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 De la misma forma que se determinó el Sustrato de los azúcares reductores

mediante la prueba de DNS, se trabajará con las densidades ópticas de la Prueba

de la Invertasa para la actividad enzimática.

Cuadro 8. Determinación del Sustrato endocelular y exocelular a partir de la curva

de Calibración de Olazabal y Castañeda (2005).

D.O(550nm) S (mmol/L) A.R Glucosa

TIEMPO
Endo Exo Endo Exo
0 0.1130 0.3500 0.6469 4.4510
1 0.1190 0.3650 0.7432 4.6918
2 0.1350 0.3970 1.0000 5.2055
3 0.2870 0.4050 3.4398 5.3339
4 0.4690 0.4260 6.3612 5.6709
5 0.4880 0.4310 6.6661 5.7512
6 0.5140 0.4580 7.0835 6.1846
7 0.5980 0.4900 8.4318 6.6982
8 0.6340 0.5070 9.0096 6.9711
10 0.6930 0.6310 9.9567 8.9615
24 0.7180 0.7520 10.3579 10.9037
48 0.7690 0.7610 11.1766 11.0482
Fuente: Elaboración propia, 2018.

 El Cuadro 7 nos muestra los valores de Glucosa que se obtuvieron a partir de la ecuación

de la gráfica de la Curva de Calibración de Olazabal y Castañeda (2005) luego de

conocer los valores de a y b.

b. Conversiones de mmol/L a umol/L

Para realizar el cálculo de Unidad de Actividad Enzimática (UAE) se necesitará

trabajar en unidades de umol/L, ya que los valores de azúcares reductores están

expresados en dichas unidades.

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Cuadro 8. Valores de conversión de mmol/L a umol/L

S (mmol/L) A.R Glucosa S (umol/L) A.R Glucosa

Endo Exo Endo Exo

0.6469 4.4510 646.8700 4451.0433
0.7432 4.6918 743.1782 4691.8138
1.0000 5.2055 1000.0000 5205.4575
3.4398 5.3339 3439.8074 5333.8684
6.3612 5.6709 6361.1557 5670.9470
6.6661 5.7512 6666.1316 5751.2039
7.0835 6.1846 7083.4671 6184.5907
8.4318 6.6982 8431.7817 6698.2343
9.0096 6.9711 9009.6308 6971.1075
9.9567 8.9615 9956.6613 8961.4767
10.3579 10.9037 10357.9454 10903.6918
11.1766 11.0482 11176.5650 11048.1541
Fuente: Elaboración propia, 2018.

10.4. Determinación de Unidad de Actividad Enzimática (UAE).

𝒖𝐦𝐨𝐥 𝐀𝐑
𝑼𝑨𝑬𝑰𝑵𝑽 =
⦋𝑬⦌Ɵ

𝒖𝐦𝐨𝐥 𝐀𝐑
𝑼𝑨𝑬𝑰𝑵𝑽 =
⦋𝒎𝑳⦌𝒎𝒊𝒏

Donde:

⦋𝑬⦌ = 1𝑚𝐿 (𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒)

Ɵ = 10 𝑚𝑖𝑛 (𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒)

𝑨𝑹 = 𝑒𝑛𝑑𝑜 + 𝑒𝑥𝑜(𝑝𝑎𝑟𝑎 𝑐𝑎𝑑𝑎 𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜)

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Cuadro 9. Determinación de la Unidad de Actividad Enzimática (UAE)

S (umol/L) A.R Glucosa

TIEMPO UEA (umol/mL*min)
endo+exo
0 5097.9133 509.7913
1 5434.9920 543.4992
2 6205.4575 620.5457
3 8773.6758 877.3676
4 12032.1027 1203.2103
5 12417.3355 1241.7335
6 13268.0578 1326.8058
7 15130.0161 1513.0016
8 15980.7384 1598.0738
10 18918.1380 1891.8138
24 21261.6372 2126.1637
48 22224.7191 2222.4719
Fuente: Elaboración propia, 2018.

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 VELOCIDAD DE CONSUMO DE SUSTRATO (Rs)

Para ello se utilizará la siguiente formula:

Rs = -ΔS/Δθ

Donde:

Rs = Velocidad de consumo de sustrato (g de sustrato/L.h.)

S = g de glucosa por L

Ɵ = Tiempo en horas

 VELOCIDAD DE PRODUCCION DE METABOLITO

Para ello se utilizará la siguiente formula:

Rp = ΔP/Δθ

Donde:

Rp = Velocidad de producción del metabolito (U/L.h.)

P = Producto expresado en UAE por L

Ɵ = Tiempo en horas

 VELOCIDAD ESPECÍFICA DE PRODUCCION DEL METABOLITO (X)

Se hallará con la siguiente formula:

X = Rp/x

Donde:

X = Velocidad especifica de producción del metabolito (U/g biomasa.h)

Rp = Velocidad de Producción de metabolito (U/L.h)

x = g biomasa/L

 VELOCIDAD DE PRODUCCION DE BIOMASA (Rx)

Para ello se utilizará la siguiente formula:

Rx = Δx/Δθ

Donde:

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Rx = Velocidad de producción de biomasa (g biomasa/L.h)

X = g biomasa/L

Ɵ = Tiempo en horas

 CALCULO DE Y(x/s) Y ms

Para ello se procederá a hallar la ecuación de una recta que se expresa de la siguiente

forma:

Rs/X = (1/Y(x/s)) *u + ms

 MÁXIMA VELOCIDAD ESPECIFICA DE CRECIMIENTO:

Para ello se procederá a hallar la ecuación de una recta que se expresa de la

siguiente forma:

𝒀 = 𝒃𝑿 + 𝒂

𝒚 = 𝟔. 𝟗𝟔𝟗𝟖𝒙 − 𝟐. 𝟑𝟒𝟐𝟗

𝟏 𝒌𝒔 𝟏 𝟏
= ( )+
𝒖 𝒖𝒎𝒂𝒙 𝒔 𝒖𝒎𝒂𝒙

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