Separaciones

Cromatográficas
¿QUÉ SON Y POR QUÉ SE DAN?
Experimentos simples
https://www.youtube.com/watch?v=MM2F1gI
zpVg
Originalmente fue Mijail Tsvet quien utilizó la
técnica usando como solvente éter y como
adherente carbonato de calcio.
Observación experimental
La cromatografía es en realidad
una técnica de separación de
compuestos.
Cuando una mezcla se coloca en
una columna de cromatografía
existe una diferencia en la
velocidad de migración de las
especies químicas (migración
diferencial).
Los mecanismos que ocasionan
esta separación son diversos
(pero no abundantes).
Se puede utilizar un sistema de
detección al final de la
cromatografía, que se pueden
usar para identificar y cuantificar
Mecanismo de
separación
ESTE ES EL POR QUÉ
Adsorción
1. La especie química se une a la fase estacionaria
por interacción química intermolecular (puentes
de Van de Walls, puentes de hidrógeno,
etcétera).
2. La fase móvil tiene una polaridad contraria a la
fase estacionaria
1. Fase normal: Estacionaria polar(ejemplo: sílica),
móvil apolar.
2. Fase reversa: Estacionaria apolar(ejemplo:
octadecilsilano – C18), móvil polar.

3. En caso de usar gradiente se inicia con la fase

móvil menos similar a la fase estacionaria.
Ejemplo
Hoja de Trabajo de asistencia del día se desarrollará a partir de una aplicación.
Intercambio iónico
1. Se utiliza para moléculas cargadas
sensibles al cambio de condiciones
(ejemplo, proteínas).
2. La fase estacionaria puede estar cargada
positivamente o negativamente.
3. La carga de la fase estacionaria puedes
tener alta o baja densidad.
4. Suelen utilizarse fases móviles con pH
establecido (amortiguadores).
5. El mecanismo de separación es equilibrio
químico de producto de solubilidad.
 Ejemplo: Purificación de lipasa B de
Candida antarctica
pI aprox 6.0

Trodler, P. et al. (2008) ‘Rational design of a new one-step purification strategy for candida antarctica lipase B by ion-exchange chromatography’, Journal of Chromatography A, 1179(2),
pp. 161–167. doi:10.1016/j.chroma.2007.11.108.
Exclusión molecular
1. Se utiliza una fase estacionaria con tamaño
de partícula definida.
2. Los analitos tienen una distribución de
tamaño considerablemente distinta entre
ellos.
3. El mecanismo de separación es
simplemente por tiempo de recorrido en la
columna.
4. Suele utilizarse para cambiar los
amortiguadores de biomacromoléculas o
para separar polímeros de diferentes pesos
moleculares.
 Ejemplo: caracterización de tamaño de una
proteína por medio de tiempo de retención

Sec (gel filtration) HPLC protein standard (7 components, lyophilized) (no date) CellMosaic. Available at: https://www.cellmosaic.com/sec-gel-filtration-hplc-protein-standard-7-
components-lyophilized/ (Accessed: 06 December 2023).
Afinidad
1. En la fase estacionaria se une
químicamente una especie que reconoce a
la muestra de interés (P. Ej.: un
anticuerpo).
2. El analito se une fuertemente a la muestra,
mientras que el resto de las especies
químicas no es retenida (P. Ej.: interacción
antígeno – anticuerpo).
3. La elución se hace mediante un cambio en
las condiciones de la fase móvil (P. Ej.:
cambio de pH).
Ejemplo: Separación de proteínas por
medio de cola de histidina