Cromatogra Miércoles/13/Oct/2021

Martes/29/mar/2022

fía CROMATOGRAFÍA
Método de separación físico que puede ser:
1.- preparativa
2.-análisis (analítica)

FUNDAMENTO GENERAL
La separación de los componentes de una mezcla (también llamados analitos o solutos) se basa en la afinidad
diferencial que dichos solutos presentan por una fase que permanece estática durante la elución (fase estacionaria) y
una que migra a través de esta (fase móvil).

CROMATOGRAFÍA PREPARATIVA
Cuando una cromatografía tiene como propósito separar los componentes de una muestra, se conoce como
cromatografía preparativa.
EJEMPLOS:
 PURIFICACIÓN DE LISOZIMA
 SEPARAR COLORANTES (FLUORESCEÍNA Y AZUL DE METILENO)

CROMATOGRAFÍA ANALÍTICA
Cuando una cromatografía tiene como propósito separar los componentes de una muestra, pero además caracterizar
(identificar y cuantificar sustancias presentes) se conoce como cromatografía analítica.
EJEMPLO: HPLC
**Principio de partición o de distribución o reparto ** De los 5 principios fisicoquímicos es el más utilizado.
**NO CONFUNDIR PRINCIPIO FISICOQUÍMICO CON SISTEMA CROMATOGRAFICO**

CROMATOGRAFÍA
Se basa en una migración o elución diferencial de los componentes de una mezcla con base en su afinidad por una fase
que permanece estática (fase estacionaria) y una fase que eluye (fase móvil).

CLASIFICACIÓN POR PRINCIPIOS FÍSICO- QUÍMICOS DE SEPARACIÓN

1. Adsorción
2. Intercambio iónico
3. Exclusión molecular
4. Partición
5. Afinidad
 COMPONENTES DEL SISTEMA CROMATOGRÁFICO
 1.-SOPORTE: puede ser una columna o una placa
 2.-FASE ESTACIONARIA: Puede ser un sólido o un líquido (resinas cargadas, geles o polímeros).
 3.-FASE MÓVIL: por fuerza debe ser fluido (puede ser un líquido, un gas o un fluido super crítico
“SFC” y en el caso específico en la cromatografía en columna se le conoce como:
*Eluyente: cuando se inicia la cromatografía (va disuelta la muestra).
*Eluato: cuando se termina la cromatografía (se recupera el analito o soluto).

 4.-MUESTRA O MEZCLA: solutos o analitos

DENTRO DE LOS SISTEMAS CROMATOGRAFICOS EXISTEN 3 SISTEMAS

AUTOMATIZADOS:
 Líquidos de alta resolución o altas presiones (HPLC).
 Cromatógrafo de gases (GC).
 Fluidos super críticos (SFC). (A presiones y temperaturas especificas)
**NO SON PRINCIPIOS FISICOQÚIMICOS ** Y SU SOPORTE ES UNA COLUMNA

PRINCIPIOS FÍSICO- QUÍMICOS DE SEPARACIÓN

1.-CROMATOGRAFÍA POR ADSORCIÓN.
Está basada en el fenómeno de adsorción y para que ocurra debe haber forzosamente un sólido o también
llamado adsorbente que es la fase estacionaria (debe ser poroso y tener una alta área superficial para ser
un buen adsorbente).
Las moléculas quedaran retenidas o asociadas en la fase estacionaria por interacciones de carga (electrostáticas)
en términos de polaridad y estableciendo interacciones débiles (puentes de Van der Waals, puentes de
hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, etc.) que está correlacionado con la solubilidad y también está
condicionada la retención de los analitos por las características de la fase móvil (poder de elución o fuerza
del eluyente).
**Cargas parciales**

2.-CROMATOGRAFIA POR PARTICIÓN (DISTRIBUCIÓN O REPARTO).

Comparte las mismas características de la cromatografía por adsorción, la única diferencia es que la fase
estacionaria siempre va a ser un líquido Inmobilizado.
Es HPLC se utiliza sílica como fase estacionaria octadecilo para
Se basa en la polaridad y solubilidad de las sustancias
Es el principio fisicoquímico más utilizado (se utilizó para la determinación de cafeína en HPLC)
**Cargas parciales**
 3.- CROMATOGRAFIA POR INTERCAMBIO IONICO.
Fase estacionaria: va a ser una resina con carga definida (intercambiador iónico), la separación se da por cargas, los solutos o
analitos se comportan como iones y va a retener a las sustancias de carga opuesta (contra carga). Las partículas que tienen la
misma carga o no tienen carga eluyen.

A la matriz polimérica se une covalentemente un grupo funcional llamado ion fijo, a ese ion fijo se le une un ion móvil con carga
opuesta (contraión)

**Los analitos deben tener la carga del ion móvil. **

**Cargas formales**

Se utilizó para la purificación de lisozima (enzima, se va a jugar con su carga a partir del pH)

4.- CROMATOGRAFIA POR EXCLUSIÓN MOLECULAR

Se basa en la diferencia en el tamaño de las moléculas, deja la forma como un factor secundario (forma, si va a interferir, pero no
tanto).

Fase estacionaria: Se utiliza un gel con poros de tamaño definido (análogo a la filtración) que es insoluble y es capaz de
mantener retenido al analito.

5.- CROMATOGRAFIA POR AFINIDAD

Se aplica en la separación o purificación de sustancias (es muy caro, por lo que principalmente se utiliza en la farmacéutica).

**ALTAMENTE ESPECÍFICA**

Fase estacionaria: Matriz polimérica (agarosa a la que se le adicionan grupos funcionales o también llamados ligando de
afinidad) que está unida químicamente a una sustancia de alta afinidad por el analito (por eso es altamente específica) (enzima-
sustrato o AG-AC).

A diferencia de las otras 4 cromatografías, esta puede utilizarse para separar muestras quirales. (selector quiral)

-Cromatografía de bio-afinidad.

Aplicación: purificación de Ac, biología molecular, purificación de células (en función de los marcadores)

CROMATOGRAMA O PERFIL DE ELUCIÓN

 Representa en el eje de la variable dependiente (Y) la señal instrumental (abs, diferencia de

potencialfluorescencia,conductividad,masa(lisozima)).
 Representa en el eje de la variable independiente (X) el Volumen o tiempo de elución (dependiendo del sistema).

** Los sistemas automatizados manejan tiempos de elución y a nivel de laboratorio es más fácil medir el volumen de
elución. **
 Miércoles/20/Oct/2021

¿PARA QUÉ SIRVE?

# de picos en un cromatograma hará alusión al # de compuestos presentes en las muestras.
Nos dará idea de la afinidad de las fases; los analitos afines a la fase móvil tendrán volúmenes o tiempos de
elución cortos.

TIEMPO/ VOLUMEN DE ELUCIÓN O RETENCIÓN (tR)

TIEMPO que transcurre desde que se aplica la muestra hasta que el analito eluye o es recuperado (TIEMPO
EN EL QUE SE ALCANZA LA SEÑAL INSTRUMENTAL MAXIMA PARA ESE ANALITO)
“TIEMPO TOTAL”
**Se conoce también como tiempo de retención porque es el tiempo en el que el analito está retenido en la
columna. **

VOLUMEN Cantidad o volumen necesario de fase móvil para lograr la elución del analito (QUE TANTA
FASE MÓVIL CONSUMO PARA LOGRAR SACAR AL ANALITO).
De aquí derivan:

TIEMPO MUERTO (tM)

Tiempo que tarda en eluir una sustancia de baja afinidad por la fase estacionaria (cuanto tiempo tardo en
eluir algo que no quiere a la fase estacionaria, ósea cuanto tiempo pasa en la fase móvil). Solo hay 1 por corrida
cromatográfica *
**CUANTO TIEMPO GASTA EL ANALITO INTERACCIONANDO CON LA FASE MÓVIL**

TIEMPO DE RETENCIÓN AJUSTADA (t’R)

Tiempo que el analito pasa en la fase estacionaria y se obtiene con una diferencia entre el TIEMPO DE
RETENCIÓN - TIEMPO MUERTO

ANCHURA DEL PICO CROMATOGRAFICO

w= Anchura en la base del pico

Si se tiene un pico ancho la población es mucho más heterogénea y entonces muchas se atrasan o se adelantan y
el porcentaje de moléculas que debería eluir a un tiempo promedio es poco.
Si se tienen picos estrechos se tiene una población más homogénea, eluyen al mismo tiempo y son pocas las
que se adelantaron o se atrasaron.
Para hablar de una buena separación buena resolución) conviene que los picos sean estrechos y me garanticen un
mejor grado de separación

W ½ = a la mitad de la altura del pico

RESOLUCIÓN
Es una forma de medir la capacidad que tiene el sistema cromatográfico para separar 2 sustancias de alta
afinidad.
En términos generales se considera una buena separación cuando la resolución es igual o mayor a 1.5
LA RESOLUCIÓN DEPENDE DE:
1.- Tiempos de elución: cuanto mayor es la diferencia de los tiempos de elución infiero mayor resolución.
2.- Anchura del pico: picos separados y estrechos.

EFICIENCIA DE LA COLUMNA
Se correlaciona con el # de platos teóricos, a mayor # de platos teóricos mayor eficiencia.

PLATOS TEÓRICOS
Hace alusión al equilibrio entre la fase liquida y la fase vapor, también hace alusión al equilibrio del analito
tanto con la fase estacionaria, como con la fase móvil. (Siempre se deben reportar con números enteros,
redondear al número entero inmediato superior)
¿POR QUÉ AUMENTAR EL NUMERO DE PLATOS TEÓRICOS AUMENTA LA EFICIENCIA DE
LA SEPARACIÓN?
Porque cuanto mayor es el numero de equilibrios o puntos de contacto que e el analito
tiene tanto con la fase móvil, como con la fase estacionaria,
hay mayor probabilidad de que el sistema diferencie una sustancia de otra.
(Pregunta varias veces su afinidad) (no los puedo controlar porque no son físicos)
 EC. DE VAN DEEMTER
Nos permite analizar como impactan ciertas variables en la altura de cada plato teórico (H) y por lo tanto en el
número de ellos.

T = temperatura  = viscosidad

H= Altura del plato teórico (cuanto más pequeño es el valor, mas eficiente es la coluna, porque tengo un
mayor número de platos teóricos).
Depende de 4 parametros:

A= Coeficiente de difusión aparente o coeficiente de difusión de EDDY

Cuanto mayor es el número de trayectorias recorridas por las moléculas, mayor es el valor de A.
**Me conviene que sea baja**
Si A se hace grande, el valor de H es mayor, por lo que tengo que reducir ese número de trayectorias múltiples y se
hace con 2 factores:
**PARAMETROS SOBRE LOS QUE SI TENGO CONTROL**
1.- Bajas velocidades de elución: si se trabaja con bajas velocidades de elución las trayectorias tienen mayor
probabilidad de parecerse a una trayectoria promedio. (no siempre puedo trabajar a bajas velocidades porque se
ensancha el pico)
2.- Partículas de empaquetamiento: que tengas un diámetro pequeño, que sean uniformes y homogéneas,
esfericas(menor trayectoria).
 B= Coeficiente longitudinal (está asociado a la tasa de difusión del analito en fase móvil-> lo
modula la temperatura ya que hay mayor energía cinética y cambios en la composición de la fase móvil)
**Me conviene que sea alta**
En cromatografía de gases ayuda

U=Velocidad de flujo lineal (equivalente o se correlaciona con la velocidad de elución)

Cs= Coeficiente de transferencia de masa en fase estacionaria

1.- Coeficiente de difusión del analito en fase estacionaria
** si se tiene un analito que difunde muy rápido va a haber poca transferencia de masa porque está perdiendo el contacto con
la fase estacionaria**
**Me conviene que sea baja** o bien una alta tasa de difusión
¿Cómo mejorar?
-Cambiar de fase estacionaria
-Disminuye la columna para que sea más rápido
2.-Diámetro de partícula de empaquetamiento (correlacionado con la cantidad de fase estacionaria) hay mayor número de
puntos de contacto si esta más espesa y gruesa.
Por eso se tienen posibles fases estacionarias y fases móviles en función de la muestra.
EJEMPLO: EN GC DIFUNDEN MÁS FACIL EN GAS (sustitución de fases móviles) O SE MODULA LA
TEMPERATURA.

B = coeficiente de difusión longitudinal

H = altura del plato teórico
DM = coeficiente de difusión del analito
en la fase móvil. Los coeficientes de difusión
en gas suelen ser superiores a los coeficientes
de difusión en líquidos
De acuerdo con la ecuación de van Deemter: B es directamente proporcional a H. El coeficiente B es a su vez
directamente proporcional al valor DM; si se sabe que el
coeficiente DM es mayor en gases, en las separaciones cromatográficas que
empleen gas = fase móvil, cambiar la temperatura mayor impacto VS c. líquida.
¿Cómo impacta el aumento de T en la separación por C. de gases?
Al aumentar T aumenta D M = el valor de B crece y por tanto H es elevada = baja eficiencia en la separación,
porque el número de platos teóricos disminuye
Lo anterior se explica porque al aumentar el valor de D M, la facilidad con la que el analito llega a f. estacionaria
es alta, lo cual retarda su flujo a través de la columna
¿Por qué modificar la temperatura mejora la eficiencia de la separación en un sistema de cromatografía
de gases? Porque es poco probable que dos analitos diferentes tengan el mismo valor de D M a dos temperaturas
distintas. Así, al cambiar la temperatura a lo largo de la elución, se va adecuando el sistema para que cada
analito encuentre la temperatura “ideal” para difundir en el gas.

¿Por qué modificar la composición de la fase móvil mejora la eficiencia de la separación en un sistema
HPLC? Porque es poco probable que dos analitos diferentes tengan la misma solubilidad con dos fases móviles
distintas. Así, al cambiar la composición de la fase móvil a lo largo de la elución, se “adecua” el sistema a la
solubilidad de cada analito.

Elución isocrática: composición constante de la

fase móvil
Elución en gradiente: composición
variable de la fase móvil

Si se tienen diferentes muestras no es bueno

ocupar una sola fase móvil
 Viernes/20/Oct/2021

Cromatografía de
adsorción



COMPONENTES DEL SISTEMA CROMATOGRÁFICO
1.-SOPORTE: puede ser una columna o una placa
(en el laboratorio se utilizó en placa para separar fluoresceína de azul de metileno)
2.-FASE ESTACIONARIA: Puede ser un sólido o un líquido (resinas cargadas, geles o polímeros).
 3.-FASE MÓVIL: por fuerza debe ser fluido (puede ser un líquido, un gas o un fluido super crítico
“SFC” y en el caso específico en la cromatografía en columna se le conoce como:
*Eluyente: cuando se inicia la cromatografía (va disuelta la muestra).
*Eluato: cuando se termina la cromatografía (se recupera el analito o soluto).

 4.-MUESTRA O MEZCLA: solutos o analitos