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Cultivo de órganos de tejidos de células vegetales (2010) 101:

65–78 DOI 10.1007 / s11240-009-9665-0

PAPEL ORIGINAL

Mejor tolerancia a la sal del trigo transgénico al introducir betagen

para la síntesis de glicina betaína

Chunmei He • Aifang Yang • Weiwei Zhang •

Qiang Gao • Juren Zhang

Recibido: 24 de agosto de 2009 / Aprobado: 20 de diciembre de 2009 / Publicado en línea: 12 de enero de 2010
- Springer Science + Business Media BV 2010

Abstracto A beta gen que codifica la colina deshidrogenasa de ApGSMT Glicina sarcosina metiltransferasa
Escherichia coli (E. coli) se transformó en trigo(Triticum aestivum L.) ApDMT Dimetilglicina metiltransferasa
vía Agrobacterium-transformación mediada. La amplificación por GB Glicina betaína
PCR y la transferencia Southern confirmaron la existencia de MDA Malondialdehído
transgén en plantas transformadas y su progenie. Niveles de RWC Contenido de agua relativo
expresión delbeta gen varió entre las diferentes líneas transgénicas PESO Tipo salvaje
basadas en análisis de RT-PCR. En condiciones de estrés salino, las
líneas transgénicas L2 y L3 tenían niveles más altos de glicina
betaína y clorofila, menos Na?/ K? proporciones y potencial de
soluto, y menos daño a la membrana celular. Estas líneas también
retuvieron tasas de fotosíntesis moderadamente más altas y un Introducción
crecimiento más vigoroso que la línea de tipo salvaje a 200 mM de
NaCl. En una prueba de campo en un campo de alta salinidad, las Las tensiones ambientales abióticas, como la sequía y la salinidad, son

líneas transgénicas L2 y L3 tuvieron mayores tasas de germinación, barreras importantes para el crecimiento de las plantas y la productividad de

más macollos y mayor rendimiento de grano en comparación con los cultivos (Boyer mil novecientos ochenta y dos). Trigo (Triticum aestivum L.)

las plantas de tipo silvestre. Esto sugirió que las plantas es uno de los principales cultivos de cereales del mundo y un cultivo básico

transgénicas eran más tolerantes al estrés salino y tenían potencial para aproximadamente el 35% de la población humana (datos de FAOSTAT

para cultivar trigo tolerante a la sal. 2005). Es imperativo mejorar la tolerancia del trigo al estrés salino para
aumentar la producción de trigo en el futuro.

Palabras clave Trigo (Triticum aestivum L.) - Transgén - La glicina betaína (GB), un compuesto de amonio
Estrés salino - Glicina betaína cuaternario, es un soluto compatible común en respuesta a
varios tipos de estrés ambiental (Rathinasabapathi et al. 1997;
Chen y Murata2002) se ha encontrado en varias especies
Abreviaturas
(Rhodes y Hanson 1993). En sistemas biológicos conocidos, el
BADH Betaína aldehído deshidrogenasa
GB se sintetiza a través de dos vías distintas a partir de dos
CDH Colina deshidrogenasa
sustratos distintos: colina y glicina, respectivamente. La
CMO Colina monooxigenasa
biosíntesis de GB es inducible por estrés y la concentración de
BACALAO Colina oxidasa
GB in vivo varía entre las especies de plantas (Sakamoto y
Murata2002). Numerosos estudios indican que el GB puede
desempeñar un papel importante en la mejora de la tolerancia
de las plantas a algunos estreses abióticos como el alto
contenido de sal (Yang et al.2008; Hattori y col.2009), sequía
C. Él - A. Yang - W. Zhang - Q. Gao - J. Zhang (Y) Escuela de (Quan et al.2004b) y alta temperatura (Yang et al. 2005). Existe
Ciencias de la Vida, Universidad de Shandong, 27 Shanda
una correlación positiva entre el nivel de glicina betaína
South Road, 250100 Jinan, República Popular de China e-
mail: jrzhang@sdu.edu.cn endógena y el grado de tolerancia a la sal en el maíz.

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(Saneoka et al. 1995; Yang y Lu.2005). Hattori y col. (2009)
también encontraron que GB se acumulaba principalmente en
los tejidos vasculares de las hojas y el periciclo de raíces en
plantas de cebada cultivadas bajo estrés salino, lo que
proporcionaba información novedosa sobre el mecanismo de
biosíntesis y acumulación de GB en plantas a nivel tisular en
condiciones de estrés abiótico. .
Los genes asociados con la síntesis de GB se han transferido
a muchas plantas. Se produjeron plantas transgénicas de varias
especies que expresaban genes comoCDH, CMO, BADH, COD,
ApGSMT y ApDMT (Lilius y col.1996; Huang y col.2000;
Sakamoto y col.2000; Sulpice y col.2003; Waditee y col.2005;
Yang y col.2008), y estas plantas acumularon diferentes niveles
de GB en condiciones de estrés. Sin embargo, la mayoría de
estos estudios se concentraron en plantas modelo. En los
últimos años, labeta El gen se ha transferido a variedades de
maíz y algodón en nuestro laboratorio. Las plantas
transgénicas acumularon más GB y tuvieron menos daño en la
membrana celular, mayor actividad enzimática y mayor
resistencia a diversos estreses en comparación con las plantas
de tipo salvaje (Quan et al.2004a, B; Lv y col.2007). Hasta ahora,
no ha habido informes con evidencia molecular convincente
que muestre la síntesis de GB en plantas de trigo transgénicas.
Es de destacar que la aplicación exógena de GB a plántulas de
trigo mejora la tolerancia al estrés por frío (Allard et al.1998), y
la fotoinhibición del trigo en condiciones de estrés por sequía
se alivia mediante la aplicación foliar de GB (Ma et al. 2006). Las
hojas jóvenes del trigo duro acumulan más GB en condiciones
de alta salinidad que en condiciones normales y la fotosíntesis
se ve menos afectada por la salinidad en hojas con altos niveles
combinados de prolina y GB (Carillo et al.2008). Li y col. (2005)
informaron que la concentración de GB en las hojas de
diferentes cultivares de trigo de invierno aumentó con estrés
por sequía moderada en la etapa de llenado de semillas.
Las diferentes especies de plantas acumulan diferentes
niveles de GB y muestran una notable variabilidad en la
tolerancia a la sal. Cuando se transfieren genes extraños a
plantas donantes, los efectos del transgén pueden ser diversos.
Por lo tanto, es importante obtener plantas de trigo
transgénicas que expresen los genes asociados con la síntesis
de GB y luego examinar su tolerancia al estrés abiótico. Esto
mejoraría la tolerancia a la sal de las variedades de trigo y
nuestra comprensión de los mecanismos de tolerancia al estrés
abiótico en el trigo. El objetivo de este estudio fue investigar la
posibilidad de mejorar la tolerancia a la sal del trigo utilizando
métodos de ingeniería genética que han tenido éxito en el trigo
para expresar elbeta gen de E. coli. los betaEl gen codifica la
colina deshidrogenasa que cataliza la colina para producir
aldehído de betaína y también cataliza el aldehído de betaína a
GB casi a la misma velocidad (Landfald y Strom 1986).
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Materiales y métodos
Materiales vegetales, plásmidos y transformación.
Las semillas del cultivar de trigo de invierno Jinan 17 (un
cultivar de élite de la llanura de Huang-Huai-hai, China) se
esterilizaron en la superficie con etanol al 70% durante 1 a 3
min, seguido de HgCl al 0,1%.2 durante 8-10 min. Las semillas
se enjuagaron cinco veces con agua destilada esterilizada antes
de transferirlas a medio MS modificado solidificado esterilizado
en autoclave (Li et al.2000), y se cultivaron en una incubadora a
24 ± 2-C en la oscuridad. Cuando el coleóptilo de las plántulas
etioladas medía 2,0–5,0 cm de largo, se cortó con un bisturí. Las
plántulas se prepararon cuidadosamente de la siguiente
manera: las hojas jóvenes se pelaron cuidadosamente para
exponer la punta del brote, y luego el meristemo de la punta
del brote se hirió con un corte transversal; las plántulas heridas
con la parte superior hacia abajo se colocaron en una placa de
Petri y se infectaron conAgrobacterium bajo una presión de
0,05 MPa mediante el uso de una bomba de vacío durante 6 a 8
min. Después de la infección, las plántulas se cultivaron en
medio MS modificado solidificado como anteriormente en la
oscuridad a 24ºC durante 3 días. Luego se trasplantaron a
macetas de vermiculita y se cultivaron en un invernadero [22–
25-C / 15–20-C (día / noche), fotoperiodo de 12 h], y se regaron
con solución inorgánica media 1/2 MS (Li et al. .1990) cualquier
otro día. Aproximadamente 7 días después, los nuevos brotes
de las plántulas se rociaron con solución FINALE (0,55 g / l de
glufosinato de amonio) para la selección primaria de plantas
transgénicas. Tres semanas más tarde, las plantas
supervivientes se trasplantaron a macetas. Durante el verano
siguiente, las semillas de la descendencia se recolectaron por
autopolinización. Para asegurar la autopolinización de las
plantas transgénicas (líneas), una planta T0 en un invernadero
se movió a 10 m de las otras plantas antes de la antesis. Para
las líneas transgénicas T1-T3 en el campo, las líneas de cada
evento transgénico independiente se plantaron en una parcela
separada, con una línea en tres filas. Entre las parcelas había un
espacio de 2 m en el que se cultivaron plantas de algodón. Para
este estudio se seleccionaron cuatro líneas transgénicas (L1, L2,
L3 y L4) derivadas de plantas T0 independientes confirmadas
por análisis de transferencia Southern.
Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens) cepa LBA4404
(Ooms et al. 1981) que contiene el plásmido pCAM-BIA1300-
Ubi-beta-P35S-bar se utilizó para la transformación (Fig. 1a), y la
secuencia de codificación del beta gen clonado de E. coli estaba
bajo el control del promotor de ubiquitina de maíz. losbar El
gen con el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor
(CaMV) teóricamente permite que la planta resista el herbicida
FINALE. La secuencia de codificación delbeta gen con el
promotor Ubi y el terminador Tnos
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Figura 1 Caracterización molecular de la expresión heteróloga del beta gen en
plántulas transgénicas. a Región de ADN-T del plásmido pCAMBIA1300-Ubi-
beta-P35S-bar: Ubi, promotor de ubiquitina de maíz; P35S, promotor 35S del
virus del mosaico de la coliflor (CaMV);beta, gen para CDH de E. coli; bar,gen
de la fosfinotricina acetiltransferasa; TL, borde izquierdo de T-DNA; TR, borde
derecho del ADN-T; Tnos, el terminador NOS, CaMV35S polyA, el terminador
CaMV35S polyA. El dibujo no está a escala.B Análisis de reacción en cadena de
la polimerasa (PCR) de plántulas transgénicas T2: carriles 1 a 4, L1, L2, L3, L4
(líneas transgénicas independientes derivadas de J17); carril 5, línea de control
no transformada (Jinan 17, WT); carril 6, plásmido pCAMBIA1300-Ubi-beta-
P35S-bar; carril M,Marcador de ADN DL2000 (Takara); P1 y P2 indicó la
ubicación del cebador. C Análisis por reacción en cadena de la polimerasa con
transcriptasa inversa (RT-PCR) de la expresión heteróloga de beta en líneas
transgénicas. Se detectaron productos de PCR específicos de
aproximadamente 300 pb en elbeta líneas transgénicas L1, L2, L3 y L4 (carriles
3–
se insertó en pCAMBIA1300 (http://www.cambia.org/ daisy /
cambia / 585.html) después de la digestión con EcoRI yHindIII
utilizando protocolos estándar. A continuación, se introdujo el
plásmido final enA. tumefaciens cepa LBA4404 con el método de
congelación-descongelación.
Agrobacterium tumefaciens que contiene pCAMBIA1300- Ubi-
beta-P35S-bar o pCAMBIA1300-P35S-bar se cultivaron hasta la fase
logarítmica media (OD600 = 0,8) y se recogió por centrifugación a
1000gramo a 4 ° C durante 10 min. Las bacterias se suspendieron
en medio líquido MS modificado suplementado con 100lM
acetosiringona (AS) para la infección de los meristemas de las
puntas de los brotes de trigo.
Como las tres líneas transgénicas producidas por transformación con
pCAMBIA1300-P35S-bar en las tres generaciones no mostró diferencias
obvias en los rasgos morfológicos y fisiológicos en comparación con el
tipo salvaje (no transformado
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6), P3 y P4 indicó la ubicación del cebador. A 346 pbactina El fragmento se
amplificó mediante RT-PCR como control interno. Carril 1, H2O; carril 2,WT. D
Análisis de transferencia de Southern que indica la presencia del transgén
beta en los genomas de plántulas transgénicas. En todos los casos, el ADN
genómico (30lg) de la generación T2 se digirió con EcoRI, que tiene solo un
sitio de corte en la región del ADN-T y ningún sitio de corte en labeta región, y
se separó en un gel de agarosa al 0,8% mediante electroforesis. Después de la
transferencia, la membrana se hibridó con
32900 bp de longitud de 900 pb marcado con P-dCTP beta. METRO, kADN /Eco
Marcador de peso molecular T14; carriles 1 a 5: WT, L1, L2, L3 y L4, respectivamente.
mi La expresión cambia del beta gen se muestran como pliegue de actinanivel de
expresión (el nivel del 1% se considera como 1 amplitud de referencia). Los valores
son la media de cinco repeticiones± Desviación Estándar.Asteriscos indican una
diferencia significativa del WT bajo las mismas condiciones de tratamiento de estrés
en * PAG\ 0,05, ** PAG\ 0.01 por t-prueba
plantas), elegimos tres líneas transgénicas y tipo salvaje (el control)
para realizar los experimentos de comparación de tolerancia al
estrés salino.
Identificación de plantas transgénicas
Ensayo de PCR
El ADN se extrajo de las hojas de las plantas transformadas
antes de la etapa de unión del trigo en primavera mediante el
método de bromuro de cetiltrimetil amonio modificado (CTAB)
(Murray y Thopson). 1980). La existencia delbetagen en las
plantas transgénicas se midió con cebadores específicos para
beta gen: P1, 50-CGCTACAGGGTAAACGC TACAAC-30 y P2, 50
-CCTCACGGC TGCGAATAAAT CC-30. El procedimiento utilizado
para las amplificaciones por PCR fue:
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95ºC durante 5 min; 95ºC durante 1 min, 58,5ºC durante 1 min, 72ºC
durante 1 min, 35 ciclos; y extensión final a 72ºC durante 7 min.
Transferencia del sur
El ADN genómico de las hojas jóvenes se aisló mediante el
protocolo CTAB. El ADN fue digerido conEcoRI antes de
separarse en gel de agarosa. 30lg de ADN genómico se
transfirió a un Hybond-N? membrana de nailon (Roche,
Mannheim, Alemania). A amplificado por PCRbeta El fragmento
de gen se marcó con 32P-dCTP con un kit de etiquetado de ADN
de cebador aleatorio (TaKaRa, Japón) y se utiliza como sonda
para transferencia Southern. Las membranas se prehibridaron
e hibridaron a 65 ° C (concentración de sal para las
hibridaciones: NaH2correos4 0,5 M, EDTA 1 mM) Después de un
lavado riguroso, las membranas radiactivas se expusieron a
una película de rayos X (Kodak, EE. UU.) Durante 48 ha -70ºC.
RT-PCR y RT-PCR en tiempo real
Para la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa
inversa (RT-PCR), se extrajeron los ARN totales de las hojas
jóvenes de plantas de trigo WT y transgénicas con el reactivo
Trizol (Sangon, Shanghai, China) y la síntesis de ADNc se realizó
con el kit de reactivos RT (Takara , Dalian, China) según el
protocolo del fabricante. Los cebadores para RT-PCR fueron: P3
(50-CGACAGCACCATCCCAAC-30) y P4 (50
-GGCTGCGAATAAATCCACC-30) Para el betagene; actina 150
-GCCACACTG TTCCAATCTATGA-30) y actina 2 (50
-TGATGGAATTGTATGTCGCTTC-30) para el trigo actina gen
(número de acceso de GenBank AB181991). Se realizó RT-PCR
cuantitativa en tiempo real en ChromoTM 4 (MJ Research,
Waltham, Massachusetts, EE. UU.) Con SYBR- Kit de RT-PCR
(Takara, Dalian, China) en 10 ll volumen de reacción, que
contenía 5 ll de mezcla de PCR SYBR Green, 0,2 lM de cada
cebador directo y inverso, 1 ll de la plantilla de ADNc diluido y
cantidades adecuadas de agua estéril bidestilada. Los
cebadores fueron los mismos que los de la RT-PCR y las
condiciones de amplificación fueron: 2 min a 95 ° C; 40 ciclos de
15 sa 95-C, 30 sa 61-C y 30 sa 72-C. Los niveles de expresión
relativa delbeta gen en trigo se calcularon con los 2-DDConnecticut
método (Livak y Schmittgen 2001) utilizando el actina gen
como control interno. Todo el experimento se repitió cinco
veces.
Tratamiento con NaCl para semillas y plantas de trigo
Las semillas de las líneas transgénicas T2 (L1, L2 y L3) y la línea
silvestre (WT) se sembraron en pequeños cubos de arena
(diámetro, 10 cm; altura, 15 cm) con agujeros en el fondo para
determinar la frecuencia de germinación. de las semillas. Allí
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fueron 25 semillas por balde y 16 macetas replicadas para cada
línea. Los cubos de arena de una línea se dividieron al azar en
cuatro grupos y se regaron una vez cada 2 días con la solución de
Hoagland (Hoagland y Arnon1950) complementado con NaCl 0, 100,
200 o 300 mM. Se consideró que las semillas habían germinado
cuando aparecían sus coleóptiles dentro de los 20 días posteriores
a la siembra.
Para determinar la tolerancia de las plántulas al
estrés por NaCl, las plántulas en la etapa de 3 hojas
en macetas (diámetro, 10 cm; altura, 15 cm) se
aclararon y se dejaron 20 plantas sanas en una
maceta y se regaron todos los días. Se realizaron
cuatro réplicas (tres macetas para una réplica) para
cada línea. Cuando las plántulas alcanzaron la etapa
de 5 hojas, los tratamientos de estrés salino
comenzaron con la solución nutritiva Hoagland
suplementada con NaCl. La concentración de NaCl se
incrementó en 50 mM cada día hasta una
concentración final de 200 mM. Se tomaron muestras
de seis plantas de cada réplica a los 0, 2, 7 y 12 días
después del tratamiento con NaCl para medir la
biomasa (peso seco, DW) y la cantidad de GB. Los
pesos secos de las muestras se midieron después de
72 ha 70ºC en un horno. Parámetros fisiológicos que
incluyen el contenido relativo de agua (RWC) de las
hojas, la cantidad de clorofila,
Determinación de las cantidades de betaína y cationes.
Se tomaron muestras aleatoriamente de plántulas WT y
transgénicas de macetas. Después de lavar la arena con
agua, las plántulas se enjuagaron brevemente con agua
destilada y se dividieron en hojas y raíces para medir las
cantidades de betaína y cationes. Las concentraciones de
GB en las semillas y hojas jóvenes de las plantas se
determinaron utilizando1La espectroscopía de H NMR
descrita por Quan et al. (2004a).
Las concentraciones de los cationes se midieron según lo
descrito por Storey (1995). Las hojas y raíces se secaron a 70 ° C
durante 72 h, y luego se digirieron con HCl 1 M a 60 ° C durante
1 h. Se añadió agua destilada hasta un volumen final de 25 ml.
Las concentraciones de los cationes se midieron mediante
espectrometría de absorción atómica (PXSJ-216, Shanghai,
China).
Determinación de clorofila
Se homogeneizaron hojas de trigo (0,1 g) con acetona al
80% (v / v) y se determinó espectrofotométricamente la
cantidad total de clorofila según Arnon (1949).
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Medición de la actividad del fotosistema II y la tasa de
fotosíntesis.
Las características de fluorescencia de la clorofila de las hojas
de trigo se midieron en plántulas de 4 semanas de edad, que
estaban apenas en la etapa de 5 hojas. Fotosíntesis neta,
conductancia estomática y CO intercelular2 La concentración se
midió en la cuarta y quinta hojas completamente expandidas
de las plántulas con un aparato portátil (LI-6400, Li-COR, EE.
UU.). Las mediciones se realizaron entre las 8:00 am y las 12:00
am en un fitotrón y duraron aproximadamente 10 min para
una medición. El PFD fotosintético (densidad de flujo de
fotones) se mantuvo a 400lmol m-2 s-1
con una fuente interna 6400-02BLED, y el caudal se designó como
500 lmol s-1. La humedad relativa del aire era aproximadamente del
70% y el CO ambiental2 la concentración era de alrededor de 500 l
mol CO2 mol-1. La eficiencia máxima de la fotoquímica de PSII (Fv /
Fm), que es una medida directa del daño a PSII, se determinó en la
cuarta y quinta hojas de las plántulas después de la adaptación a la
oscuridad durante 30 min con un fluorómetro de clorofila de
modulación de pulso (FMS-2, Hansatech , Reino Unido) a
temperatura ambiente.
Examen de RWC y potencial de soluto (Ws)
Las hojas de las plántulas se cortaron en pedazos y se
puntuaron inmediatamente los pesos frescos. Después de
inmersión en agua destilada a temperatura ambiente durante
la noche, se determinó el peso rehidratado de las piezas.
Luego, las piezas se secaron en un horno a 70ºC durante 3 días
y se pesaron. El RWC se calculó como: RWC (%) = (peso fresco -
peso seco) / (peso rehidratado - peso seco)9 100.
El potencial de soluto se midió utilizando el protocolo descrito
por Gaxiola et al. (2001). Los trozos de hojas de las plántulas se
dejaron flotar en agua desionizada durante la noche a 4 ° C, luego
se congelaron, descongelaron y se rompieron mecánicamente. La
savia extruida se analizó con un osmómetro crioscópico (Fiske,
Modelo 210, EE. UU.). Las lecturas (mmol / kg) se utilizaron para
calcular el potencial de soluto (Ws, MPa) usando la fórmula
Ws ¼ -moles de soluto - RK;
dónde R ¼ 0: 008314 y K ¼ 298 C
Medición de azúcares solubles totales y prolina.
Los azúcares solubles totales en las hojas de trigo (aproximadamente 0,1
g) se extrajeron en agua hirviendo durante 30 minutos y se midieron con
reactivo de antrona utilizando glucosa como estándar (Yemm y Willis
1954).
Las muestras de hojas de trigo (aproximadamente 0,1 g) para la
medición de prolina se trataron con ácido sulfosalicílico al 3%
seguido de ebullición durante 1 h. La cantidad de prolina fue
69
medido con ninhidrina, que se detectó a 520 nm y se utilizó
como referencia un líquido estándar de prolina (Bates et al.
1973).
Medición del daño de la membrana celular de la hoja y MDA
La permeabilidad de las membranas de las hojas se midió mediante
la fuga de electrolitos. Las muestras de hojas desprendidas se
lavaron tres veces con agua desionizada, se colocaron en 25 ml de
agua desionizada y se trataron en una bomba de vacío con una
presión mantenida a 0.05 MPa durante 20 min. Después de la
incubación a 25 ° C con agitación suave durante 2 h, se midió la
conductividad eléctrica de la solución con un conductímetro. Luego,
la muestra se hirvió durante 20 min y se enfrió a 25 ° C para
determinar la fuerza iónica total. La fuga de electrolitos de las
células foliares se calculó como se describió anteriormente
(Dionisio-Sese y Tobita1998) y expresado como porcentaje (%).
Los niveles de MDA se analizaron de acuerdo con Lv et al.
(2007). Se utilizaron aproximadamente 0,1 g de hojas de
trigo y se determinaron los valores de absorbancia a 450,
532 y 600 nm con un espectrómetro (Perkin-ElmerLambda
25, Boston, MA, EE. UU.). El contenido de MDA se calculó
utilizando la siguiente fórmula C (lmol / l) = 6,45 (OD532 - OD
600) - 0.56OD450.
Evaluación de campo de trigo transgénico en suelo salino
Se realizó una prueba de campo en suelo salado (0,42 a 0,47% de
contenido de sal, aproximadamente 72 a 80 mM de NaCl) en
Dongying (118-300E, 37-270N), Shandong, en el delta del río Amarillo
cerca de la orilla del mar. El campo se dividió al azar en cuatro
repeticiones y las semillas de WT y cada línea transgénica
homocigótica T3 se sembraron en una parcela de tres hileras a
fines de septiembre de 2007. Cada parcela tenía 3.6 m de largo y
0.3 m de ancho. Después de la siembra, las parcelas se regaron una
vez y se examinaron los datos que incluían el porcentaje de
germinación, el porcentaje de plántulas, el número de macollos, el
área de la hoja bandera, el peso de grano por planta y el
rendimiento de grano de cada parcela. La tasa de germinación se
contó 1 mes después de la siembra. La tasa de supervivencia de las
plántulas se midió en febrero y el número de macollos se contó en
marzo. El área de la hoja de la bandera se midió en el siguiente mes
de abril. El peso de grano por planta y el rendimiento final de cada
línea se determinaron después de la cosecha.
análisis estadístico
Al medir los parámetros fisiológicos, se realizaron tres o cuatro
repeticiones. Todos los datos se presentan como la media±
Desviación Estándar. Las comparaciones entre transgénicos y
WT se realizaron utilizando el método de Studentt-prueba.
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70
Valores de 0.01 \PAG \ 0,05, PAG \ 0.01 o PAG \ 0,001 se
consideraron estadísticamente significativos. Todo el análisis
estadístico se realizó con Sigmaplot 9.0.
Resultados
Caracterización molecular de las plantas de trigo
transgénicas
Aproximadamente el 80% de las plántulas sobrevivieron después de
la transformación y más del 80% de las sobrevivientes murieron en
la selección de herbicidas. Las plantas restantes crecieron durante
el invierno y produjeron semillas normalmente. La generación T1
de plantas de trigo se seleccionó nuevamente con la solución
FINALE. Sólo alrededor del 20% de las líneas de plantas T0 existían
plantas transgénicas. Se produjeron veintiséis líneas transgénicas
cada una de diferentes eventos transgénicos independientes. Para
confirmar que el gen exógeno podría integrarse en el genoma del
trigo y transmitirse a la descendencia, se analizaron mediante PCR
las plántulas de trigo transgénicas supervivientes T0 y T1. La
integración y transmisión estable de labeta El gen en el genoma de
las plantas de trigo T2 fue confirmado por PCR (Fig. 1b) y análisis de
transferencia Southern (Fig. 1D). Como se muestra en la Fig.1d, las
plantas T2 de las líneas transgénicas L2 y L3 parecían contener una
inserción de copia única, mientras que las líneas L1 y L4 tenían dos
copias y la planta WT no tenía señal de hibridación. La expresión de
labeta El gen en plantas T2 fue monitoreado por RT-PCR, y los
resultados se muestran en la Fig. 1C. Los resultados de la RT-PCR
revelaron mayores niveles de expresión debeta en plantas de L1, L2
y L3 que de L4 y sin expresión en plantas WT. Las líneas L1, L2, L3 y
WT se eligieron para estudios posteriores. Los niveles de expresión
relativa en diferentesbeta Las líneas transgénicas en condiciones
normales y de estrés salino se examinaron mediante RT-PCR en
tiempo real (Fig. 1mi). Los resultados mostraron que la expresión
delbeta gen en plántulas transgénicas aumentó en respuesta al
estrés salino.
Las plantas transgénicas acumularon niveles más altos de GB
Como se muestra en la Fig. 2a, en condiciones normales, la
cantidad de GB en hojas de L2 y L3 en la etapa de 5 hojas fue de 140
lmol g-1 pesos secos (DW), mientras que el WT tenía alrededor de
110 lmol g-1 DW. Curiosamente, la cantidad de GB en L1 fue lo
suficientemente más alta que el WT para ser significativa, lo que
indica la complejidad de expresión de la inserciónbetagene.
Después de 12 días de riego con una solución nutritiva Hoagland
que contenía 200 mM de NaCl, la cantidad de GB en las hojas de
todas las líneas aumentó entre 1,4 y 2,8 veces, y las cantidades en
las líneas transgénicas L2, L3 fueron mucho más altas que las de WT
y esto fue estadísticamente significativo. Mientras que las
cantidades de GB en las semillas de L1, L2 y L3 (26,5, 27,9, 28,5lmol
g-1 DW, respectivamente) fueron
123
Cultivo de órganos de tejidos de células vegetales (2010) 101: 65–78
más altos que los de WT (25,6 lmol g-1 DW), las diferencias
no fueron significativas.
Germinación de la semilla
Cuando las semillas se sembraron en cubos de arena (30 semillas por
cubeta, 4 repeticiones) y se regaron una vez cada dos días con solución
Hoagland, la capacidad de germinación de las semillas transgénicas fue
similar a la del WT (Fig. 2B). Cuando la concentración de NaCl aumentó
por encima de 100 mM, la capacidad de germinación de todas las líneas
disminuyó significativamente. Los porcentajes de germinación de las
líneas transgénicas fueron mucho más altos que los de WT. A 300 mM de
NaCl, los porcentajes de germinación de L2 y L3 fueron 3-4 veces más
altos que los de WT, mientras que L1 fue solo un poco más alto que los
de WT, lo que en cierto modo se correspondió con los niveles de GB en
las semillas de estas líneas. Estos resultados indicaron que las líneas
transgénicas tenían una mayor tolerancia a la sal en la etapa de
germinación.
Las plántulas transgénicas acumularon más K? y
menos Na? que el salvaje
Es bien sabido que las concentraciones de Na?, K? y la K?/N / A? La
proporción juega un papel importante en la tolerancia a la sal de las
plantas sometidas a estrés por NaCl. Analizamos las
concentraciones de iones en las raíces y hojas de plántulas
transgénicas y WT en condiciones normales y estresadas por NaCl
(Fig.2CD). N / A? los niveles fueron similares en las líneas WT y
transgénicas en ausencia de NaCl. Como se esperaba, el
tratamiento con NaCl resultó en un aumento de Na celular?
concentraciones en plántulas transgénicas y WT. A 200 mM de NaCl
durante 12 días, las hojas y raíces de las líneas transgénicas
contenían menos Na? que el WT, entre ellos Na? la concentración de
L1 fue levemente menor que la de WT, mientras que L2 y L3
tuvieron aproximadamente 8.2 y 7.7 veces de aumento en las hojas
y 2.5 y 2.6 veces en las raíces, respectivamente; Entonces un? la
concentración en las hojas y raíces de WT aumentó
aproximadamente 12,6 y 3,7 veces correspondientemente. Estos
resultados sugirieron que la mayor acumulación de GB en las
células de trigo podría haber protegido la integridad de la
membrana y mejorado la capacidad de restringir el transporte de
Na? desde las raíces hasta las hojas bajo estrés por NaCl.
Las concentraciones de K? en las hojas de las líneas transgénicas
L1, L2 y L3 fueron similares a las WT en condiciones normales (Fig. 2
D). Cuando las plántulas sufrieron estrés por sal, el K celular? la
concentración en raíces y hojas en todas las líneas aumentó
primero en los primeros 2 días y luego disminuyó gradualmente.
Sin embargo, el K? la concentración en L2 y L3 fue significativamente
mayor que el WT; lo que sugirió que las plántulas con mayor
acumulación de GB adquirieron mejor K? nutrición. Se concluyó que
las plantas L2 y L3 tenían K mucho más alto?/N / A? proporciones
comparadas con el WT, y tenían una mayor tolerancia al estrés
salino.
Cultivo de órganos de tejidos de células vegetales (2010) 101: 65–78
Figura 2 Efectos del estrés de NaCl sobre las cantidades de GB (a), porcentaje
de germinaciónB), N / A? concentraciónC), K? concentraciónD), disparo (mi)y
masa seca de raíz (F) en las hojasL) y raícesR). a Niveles de GB en las hojas de
WT y líneas transgénicas en la etapa de 5 hojas antes y después de 12 días de
estrés por NaCl 200 mM detectado por 1Espectroscopía de H NMR. Los valores
son medios± desviación estándar de tres repeticiones. BPorcentajes de
germinación de semillas sembradas en arena bajo riego con diferentes
concentraciones de NaCl (0, 100, 200 y 300 mM) en
Efectos del estrés por NaCl en la biomasa de plántulas
de trigo
Las biomasas de brotes y raíces de todas las líneas a los 0, 2, 7, 12
días de tratamiento con sal se muestran en la Fig. 2ey f. los
71
Solución Hoagland. Los porcentajes de germinación se calcularon 20 días
después.CD Durante los 12 días de tratamiento con sal, se recolectaron los
brotes y raíces de las plantas de trigo para las determinaciones de biomasa
luego de 72 h de secado en estufa a 70 ° C. mi las concentraciones de Na? y FK?
en diferentes momentos (0, 2, 7, 12 días) de estrés salino (NaCl 200 mM) en
hojas (L) y raícesR). Asteriscosindican una diferencia significativa del WT bajo
las mismas condiciones de tratamiento de estrés en * PAG\ 0,05,
* *PAG\ 0.01 o *** PAG\ 0.001 por t-prueba
La biomasa de brotes y raíces de las líneas L2, L3 mostró mayores
incrementos en comparación con WT bajo tratamiento con sal. Por
ejemplo, después de 12 días de estrés por NaCl, la biomasa de los
brotes y raíces de L2 fue aproximadamente un 23 y un 18% más alta
que la del WT. Para L3, fueron un 33% más altos
123
72 Cultivo de órganos de tejidos de células vegetales (2010) 101: 65–78

Fig. 3 Expresión heteróloga de beta en

el trigo resultó en un fenotipo más
robusto bajo estrés por sal. a Líneas
transgénicas y WT después de 12 días
de estrés con NaCl 200 mM en
invernadero. La pequeña imagen en el
esquina superior derecha muestra
todas las líneas antes del tratamiento
con sal. B Comparación de plántulas
transgénicas y WT en invernadero
después de 12 días de NaClstress (
izquierda) y sin estrésDerecha)para
cada línea, las plántulas intactas se
sacaron con cuidado de las macetas y
se escurrieron para dejarlas libres de
arena. C Líneas transgénicas y WT de la
generación T3 en una parcela salina
con aproximadamente 72-80 mM de
NaCl

para los brotes y un 34% más alto para las raíces que el WT. En
condiciones de alta salinidad, las plantas WT y L1 crecieron
inferiormente, y aproximadamente la mitad de las hojas parecían
arruinadas, mientras que las de L2 y L3 eran más vigorosas (Fig.3a,
b). Esto demostró que las plantas L2 y L3 crecían más normalmente
bajo estrés salino.
Menos daño de la membrana celular a las plántulas transgénicas
en condiciones de estrés salino
El estrés salino suele provocar daños en las membranas celulares
de las plantas. El daño a las membranas de las hojas de trigo se
midió mediante la fuga de electrolitos de la membrana celular (%) y
el contenido de malondialdehído (MDA) en condiciones de estrés
salino. Los resultados (Fig.4a, b) indicaron que no había diferencias
obvias en la fuga de electrolitos y el contenido de MDA entre las
líneas WT y transgénicas en ausencia de NaCl. Pero cuando se
exponen al estrés de NaCl, las células de las hojas filtradas, los
electrolitos aumentaron gradualmente en todas las líneas y el
contenido de MDA también aumentó en WT y L1. Sin embargo, los
valores de L2 y L3 fueron significativamente más bajos que el WT, lo
que demostró que L2 y L3 tienen una estabilidad de membrana
potencial de soluto foliarWs) y RWC de WT y plantas
transgénicas antes y durante el tratamiento con NaCl. Como se
muestra en la Fig.5a, no hubo diferencias significativas en la Ws
valores para diferentes líneas antes de la tensión. Cuando las
plántulas se regaron con solución Hoagland suplementada con
NaCl 200 mM, la hojaWs disminuyó tanto en las plantas
transgénicas como en las WT. Después de un estrés de NaCl
durante 7 días o más, elWs de las líneas transgénicas L2 y L3
fueron mucho más negativas que las plantas WT, y las
diferencias fueron significativas. Antes del estrés, las RWC de
diferentes líneas no tenían diferencias obvias. Después del
estrés salino durante 7 días, el RWC de los transgénicos L2 y L3
fue mayor que el WT (Fig.5B). Estos resultados indicaron que las
líneas con concentraciones más altas de GB podrían mantener
un RWC más alto y más negativoWs en sus hojas bajo estrés
por sal.
Las plántulas transgénicas acumularon más azúcar soluble
y prolina.
Para investigar los factores que afectan la tolerancia a la sal además de

mucho mayor que el WT.
Las plantas transgénicas mantuvieron un potencial de soluto más
bajo junto con un RWC más alto en comparación con las plantas de
tipo salvaje bajo estrés salino
Para investigar el mecanismo de mejora de la tolerancia a la
sal en las plantas de trigo transgénico, medimos la
los iones inorgánicos que conducen a un potencial de soluto más bajo
en las plántulas transgénicas, medimos la cantidad total de azúcares
solubles y prolina en las hojas. Como se muestra en la Fig.5c, las líneas
transgénicas L2 y L3 acumularon aproximadamente 62 y 90% más de
azúcares solubles que el WT después de 12 días de tratamiento de estrés
salino. Las líneas L2 y L3 acumularon aproximadamente un 62 y un 76%
más de prolina en comparación con el WT (Fig.5D).

123
Cultivo de órganos de tejidos de células vegetales (2010) 101: 65–78
Figura 4 Daño de la membrana a plántulas transgénicas bajo condiciones de
estrés salino. a Fuga de electrolitos de las células foliares y B Niveles de MDA
en hojas de las líneas WT y transgénicas en diferentes momentos (0, 2, 7,
Figura 5 Ajustes osmóticos de plántulas transgénicas y WT en diferentes
momentos (0, 2, 7, 12 días) de estrés salino de NaCl 200 mM: potencial de
solutos (a), las variaciones en el contenido relativo de agua (B), contenido total
de azúcar soluble (C) y contenido de prolina (D) en transgénicos y WT
Efectos del estrés por NaCl en las concentraciones
de clorofila foliar
Con un estrés de NaCl 200 mM, más del 30% de las hojas de las
plántulas WT se volvieron amarillas después de 7 días y el 50% de
73
12 días) con estrés de NaCl 200 mM. Los valores son la media de tres
réplicas± Desviación Estándar. Asteriscos indican diferencias
significativas del WT en * PAG\ 0.05 o ** PAG\ 0.01 por t-prueba
plántulas en diferentes momentos (0, 2, 7, 12 días) de estrés salino (NaCl
200 mM). Los valores son la media de tres réplicas± Desviación Estándar.
Asteriscos indicó diferencias significativas del WT en las mismas
condiciones en * PAG \ 0.05 o ** PAG\ 0.01 por t-prueba
las hojas se marchitaron completamente después de 12 días, mientras
que las hojas de L2 y L3 fueron más vigorosas. Los porcentajes de hojas
verdes fueron mucho más altos que el WT (Fig.3a). Para determinar los
efectos del estrés salino en las concentraciones de clorofila en las hojas,
medimos las cantidades de
123
74
Figura 6 Parámetros fotosintéticos de plántulas transgénicas y WT en
diferentes momentos (0, 2, 7, 12 días) de estrés salino de NaCl 200 mM. a
Contenido de clorofila, B fotosíntesis neta, C conductancia estomática, DCO
intercelular2 concentración, mi Relaciones Fv / Fm de WT y transgénico
clorofila en plántulas en la etapa de 5 hojas antes y después del
estrés por NaCl. Como se muestra en la Fig.6a, no hubo
diferencias estadísticas entre las concentraciones de clorofila
en las líneas WT y transgénicas antes del estrés salino. Las
concentraciones de clorofila en WT y L1 tuvieron un pequeño
aumento en el segundo día y disminuyeron a partir de
entonces, y no hubo diferencias significativas entre estos dos.
123
Cultivo de órganos de tejidos de células vegetales (2010) 101: 65–78
plántulas en diferentes momentos (0, 2, 7, 12 días) de estrés salino (NaCl
200 mM). Los valores son medios± desviación estándar de seis plántulas
por línea. Asteriscos indicó una diferencia significativa del WT en
* PAG\ 0.05 o ** PAG\ 0.01 por t-prueba
líneas. Las líneas L2 y L3, sin embargo, aumentaron significativamente el
segundo día y luego disminuyeron gradualmente hasta el duodécimo
día. Durante el tratamiento con sal, las concentraciones de clorofila
fueron significativamente mayores en L2 y L3 en comparación con WT.
Esto significó que las plántulas con mayor acumulación de GB
mantuvieron concentraciones relativamente estables de clorofila bajo
estrés salino.
Cultivo de órganos de tejidos de células vegetales (2010) 101: 65–78 75

Efectos del estrés por NaCl sobre la fotosíntesis y la

PESO: J17; T1-1-1, T1-2-1: diferentes líneas en la generación T3 de L1; T2-1-1, T2-2-3 y T2-3-1: diferentes líneas en la generación T3 de L2; T3-1-1, T3-2-2 y T3-3-3: diferentes líneas en la generación T3 de L3. Los valores
100
164
151
168
173

177
166

190
179
fluorescencia de la clorofila en plantas

Rendimiento por metro cuadrado

461,67 ± 32,13 *
476,00 ± 35,57 *

487,33 ± 26,28 *
456,00 ± 34,59 *

521,33 ± 35,75 *
491,67 ± 44,90 *
Explicar la mayor producción de biomasa observada por líneas

275,00 ± 52.18
449,67 ± 56,97
414,67 ± 39,33
transgénicas con mayor expresión de beta, Se investigó el

g PESO%
comportamiento fotosintético de plántulas transgénicas en
condiciones normales y de estrés salino. En condiciones normales
de crecimiento, las plántulas de líneas transgénicas mostraron
tasas de fotosíntesis y conductancia estomática ligeramente más
altas que las WT (Fig.6antes de Cristo). Con tratamientos con NaCl

100
181
190
200
198

205
186

198
201
Peso de grano por planta
200 mM, las tasas netas de fotosíntesis y la conductancia
estomática de las plántulas WT y transgénicas se inhibieron

44,88 ± 2,10 **
46,94 ± 1,96 **
49,40 ± 2,43 **
48,94 ± 1,71 **
45,97 ± 1,30 **

49.02 ± 2,04 **
49,64 ± 2,05 **
50,73 ± 2,52 **
sustancialmente con disminuciones incrementales durante el

24,75 ± 1,10
g PESO%
estrés. Sin embargo, las plántulas transgénicas no fueron tan
inhibidas por la salinidad como el WT. Después del tratamiento con
sal durante 12 días, las tasas fotosintéticas netas en L2 y L3 fueron
1,33 y 1,46 veces más altas que las de WT, respectivamente. Sin

% En peso
embargo, L1 fue solo un 56% más alto que el WT. En cuanto al CO

100
115
110
116
115
115

113
118
115
intercelular2 concentraciones, en condiciones normales, las líneas
transgénicas no mostraron diferencias con el WT, excepto que L3

de las líneas transgénicas fueron significativamente diferentes de los de las plantas WT en *PAG\ 0.05 y ** PAG\ 0.01 usando el t-prueba
14,97 ± 0,39 **
14,69 ± 0,41 *
14.54 ± 0,42 *
14.60 ± 0,51 *

14.55 ± 1,00 *
fue obviamente más alto que el WT. Cuando se expone a NaCl 200

14.31 ± 0,681
12,65 ± 0,63
13,95 ± 0,56
13,92 ± 0,53
mM, el CO intercelular2 las concentraciones en todas las líneas Área de bandera

disminuyeron hasta ser muy bajas al séptimo día, mientras que en

cm2
L2 y L3 hubo concentraciones más altas que en el WT (Fig. 6d), que
se correspondió con mayores tasas fotosintéticas netas para L2 y L3
durante los tratamientos de estrés salino.
100
128
176
180
176
168

152
196
176
Número de cultivadores por planta

Para investigar a fondo los factores limitantes para la

fotosíntesis bajo estrés salino, se midió la eficiencia máxima de la
4.50 ± 0,45 **
4,40 ± 0,34 **
4,40 ± 0,31 **
3,80 ± 0,33 **

4,40 ± 0,40 **
4.20 ± 0,36 **
4,90 ± 0,32 **
3,20 ± 0,25 *
No.% PESO

2,50 ± 0,27

fotoquímica de PSII (Fv / Fm) en hojas aclimatadas a la oscuridad.

La relación Fv / Fm es el parámetro que se utiliza con más
frecuencia para indicar la lesión de los complejos PSII debido a
factores de estrés, incluida la salinidad. Las relaciones Fv / Fm en
WT se redujeron significativamente durante el estrés salino,
tabla 1 Características y rendimiento de grano de diferentes líneas de trigo en tierras salinas.

100
161
182
167
187
201

194
190
193

mientras que disminuyeron lentamente en las líneas transgénicas

Tasa de supervivencia de plántulas

(Fig.6mi). Además, las relaciones Fv / Fm en L3 se mantuvieron

66,40 ± 6,35 **
68,80 ± 4,82 **
75,00 ± 7,18 **
77,00 ± 8,31 **
79,80 ± 1,79 **

79,60 ± 7,96 **
82,80 ± 6,14 **
78,20 ± 5.40 **

moderadamente altas en el día 12 de tratamiento con sal, lo que

41,20 ± 8.70

indica que los complejos de PSII no habían sufrido lesiones graves

% PESO%

durante el tratamiento de estrés.

Crecimiento y rendimiento de líneas transgénicas en el campo salino.

% En peso

100
128
126
131
132
130

134
141
134

Debido al buen desempeño de las líneas en experimentos de

laboratorio, probamos los rasgos de campo de líneas transgénicas
en tierra salina. Líneas transgénicas L1 (T1-1-1), L2 (T2-1-1), L3
76,00 ± 6,32 **

79,80 ± 4,15 **
80,00 ± 3,39 **
75,2 ± 9.01 **
77,8 ± 4,97 **
78,8 ± 5.40 **
77,4 ± 1,69 **
84,2 ± 5,49 **
Tasa de emergencia

59,60 ± 9,81

(T3-1-1) y sus líneas hermanas (Tabla1), así como los WT fueron

seleccionados para plantar en el campo salino. Como se esperaba,
L2 y L3 exhibieron más tolerancia al estrés salino y mostraron un
%

crecimiento más vigoroso que el WT (Fig.3C). Mesa1 muestra los

valores de las tasas de emergencia de las plántulas, las tasas de
T1-1-1 (L1)

T2-1-1 (L2)

T3-1-1 (L3)

supervivencia de las plántulas, el número de tallos por planta y el

PESO (J17)

T1-2-1

T2-2-3
T2-3-1

T3-3-3
T3-2-2

rendimiento por metro cuadrado, etc. de diferentes líneas.

Líneas

123
76
Todos los parámetros, excepto el área de la hoja bandera y el
rendimiento por metro cuadrado de las líneas transgénicas, fueron
significativamente mayores en las líneas transgénicas L2 y L3 (PAG \
0,01, n = 4) que en el WT. Las tasas de emergencia y las tasas de
supervivencia de las plántulas de las líneas transgénicas fueron
26-41 y 61-101% más altas que las de WT, respectivamente. El
número de macollos (128–196% del WT) y el peso de grano por
planta (181–205% del WT) fueron mucho más altos que el WT. El
área de la hoja bandera (110-118% del WT) y el rendimiento por
metro cuadrado (151-190% del WT) de las líneas transgénicas
también fueron más altos que el WT. Estos resultados indicaron que
las líneas transgénicas tuvieron un buen crecimiento y rendimiento
en comparación con el WT en el campo salino.
Discusión
Trigo (Triticum aestivum) es un cultivo moderadamente tolerante a
la sal, pero el rendimiento se reducirá considerablemente cuando la
salinidad en el campo se eleve a 100 mM NaCl (Munns et al. 2006).
Aunque los genes tolerantes a la sequía y a la sal que están
presentes en el germoplasma de trigo y otros cultivos se han
utilizado con éxito para obtener variedades tolerantes al estrés, el
mejoramiento para la tolerancia al estrés requiere tiempo y trabajo
y es complicado por la naturaleza multigénica de la tolerancia al
estrés. La transformación genética ha arrojado algo de luz sobre
nuevos enfoques para desarrollar trigo que sea resistente al estrés
ambiental. Además, esta ha sido una forma eficaz de ampliar su
diversidad genética. En este estudio, presentamos elbeta gen en
trigo y obtuvieron líneas transgénicas que acumularon niveles más
altos de GB que los controles no transgénicos bajo los mismos
tratamientos de sal y, como resultado, las líneas transgénicas
tenían una mayor tolerancia a la sal. El rendimiento de campo de
las líneas transgénicas L2 y L3 en áreas terrestres salinas fue mucho
mejor que el WT (Tabla1), y mostró un potencial prometedor en el
mejoramiento de trigo tolerante a la sal.
McDonnell y Wyn Jones (1988) informaron que el contenido de GB en
hojas de trigo de plantas no estresadas aumentó a medida que cada
hoja se desarrollaba y disminuyó rápidamente a partir de entonces, y en
hojas estresadas por sal se observó un aumento inicial en el contenido
de GB que también coincidió con la expansión de la hoja. En nuestro
estudio las muestras para la determinación de GB y los niveles de
expresión debeta se tomaron de las hojas jóvenes de expansión de
plantas de trigo a la misma edad, los datos fueron comparables. Entre
las diferentes líneas, los niveles de ARNm del transgén fueron
diferentes, lo que puede deberse a los efectos de los diversos sitios de
inserción. Como se muestra en la Fig.1cye, L1 tiene un nivel de expresión
más bajo, lo que podría explicar por qué L1 acumuló menos cantidad de
GB (Fig. 2a) y presentaron menor tolerancia al estrés salino.
El trigo es un clásico 'excluidor de sal', y la mayoría de las investigaciones
para mejorar la tolerancia a la sal en el trigo se han centrado en aumentar el
sodio? exclusión (Ashraf y Khanum 1997; Garthwaite
123
Cultivo de órganos de tejidos de células vegetales (2010) 101: 65–78
et al. 2005). Sin embargo, la relación entre la exclusión de
sal y el rendimiento de grano no siempre parece ser sencilla
(Ashraf y McNeilly1988; El-Hendawy y col.2005). Aunque la
tolerancia a la salinidad es un rasgo multigénico complejo
(Flowers2004), el mantenimiento de un K citosólico alto?/N /
A? La proporción es una característica clave de la tolerancia
a la sal vegetal (Maathuis y Amtmann 1999; Tester y
Davenport2003; Cuin y col.2008; Zheng y col.2008). En este
estudio, medimos las concentraciones de Na?, K? y calculó
las proporciones de Na? a K? en diferentes lineas. Los
resultados se muestran en la fig.2c, dy reveló que el Na?
nivel aumentado mientras que el K? el nivel disminuyó durante el
tratamiento de estrés por sal. Sin embargo, en las líneas transgénicas L2
y L3, que acumularon niveles más altos de GB, la K?/N / A?
Las proporciones fueron significativamente más altas que las de WT, lo
que sugiere que la mayor acumulación de GB protegió eficazmente la
integridad de la membrana y las macromoléculas, lo que fue beneficioso
para mantener el metabolismo normal y la capacidad de retener K? en
células sometidas a estrés por NaCl. Esta opinión fue apoyada por los
electrolitos filtrados más bajos y el contenido de MDA en las células de
las hojas de las líneas transgénicas L2 y L3 durante el tratamiento de
estrés salino (Fig.4a, b).
La sal puede afectar indirectamente la productividad al inhibir la
actividad fotosintética de las plantas (Holmström et al. 2000). La
disminución de la fotosíntesis inducida por el estrés salino puede
asociarse con el cierre parcial de los estomas y la reducción de las
concentraciones de clorofila. A partir de nuestros resultados,
especulamos que tal vez niveles más altos de GB en líneas transgénicas
causaron una disminución menor en las concentraciones de clorofila y el
valor neto de la fotosíntesis en estas plantas bajo estrés salino (Fig.6a,
b). El aumento de la biomasa y la cantidad de GB fueron los más altos en
la línea transgénica L3. El aumento de GB en la línea transgénica L1 no
fue tan mayor que el de L2 y L3, la biomasa de L1 también es la más baja
en las tres líneas transgénicas. Esto demostró que el grado de
protección contra el estrés salino se correlacionaba bien con la cantidad
de GB (Sakamoto y Murata2002) y los rendimientos de grano de L3 en el
ensayo de campo se sumaron a esta evidencia. En nuestro estudio, las
disminuciones en la conductancia estomática y el CO intercelular2
Se observaron concentraciones al mismo tiempo (Fig. 6c, d), que
indicó que la reducción del CO2 el suministro se debió
principalmente a la disminución de la conductancia estomática. La
conductancia estomática fue el factor limitante dominante para la
fotosíntesis durante el tratamiento de estrés salino, lo que condujo
a una reducción mucho mayor de la biomasa en las plantas WT en
comparación con L2 y L3.
En condiciones de estrés, las plantas a menudo utilizan muchas
estrategias de adaptación para reducir los efectos nocivos sobre el
crecimiento y la productividad de las plantas (Yancey et al. mil
novecientos ochenta y dos). Muchas plantas acumulan azúcares solubles
y prolina libre en respuesta a tensiones ambientales como sequía, alta
salinidad y baja temperatura (Nanjo et al.1999) para mantener la
turgencia celular. Nuestros resultados presentados en la Fig.5C
Cultivo de órganos de tejidos de células vegetales (2010) 101: 65–78
yd demostraron que el estrés salino resultó en un aumento
de azúcares solubles y prolina libre en todas las líneas de
trigo, mientras que las líneas transgénicas L2 y L3
acumularon azúcares y prolina considerablemente más
solubles que WT y L1 después de 12 días de tratamiento
con sal. Esto puede atribuirse a la protección de GB en
algunas enzimas clave que catalizan la síntesis de azúcares
solubles y prolina libre (Liang et al.2009). De acuerdo con
los niveles más altos de acumulación de GB, más azúcares
solubles y prolina en L2 y L3 podrían mantener el equilibrio
osmótico de las células, lo que podría mantener un
potencial de soluto más negativo y un mayor RWC en las
hojas de L2 y L3 (Fig.5a, b).
Los estudios han demostrado que la acumulación de GB puede
estabilizar la actividad macromolecular al proteger proteínas
altamente complejas, como el complejo PSII (Mamedov et al. 1993;
Allakhverdiev y col.1996), mitigando el daño inducido por ROS
(Liang et al. 2009) y mejorando la integridad de la membrana en
lugar de mediante osmorregulación (Sakamoto y Murata 2001,
2002). En nuestro estudio, las relaciones Fv / Fm de las plantas WT
se redujeron de manera muy significativa en comparación con las
líneas transgénicas que tenían concentraciones más altas de GB en
condiciones de estrés salino (Fig.6mi). Esto confirmó el efecto
protector de GB sobre la actividad del fotosistema II (Allard et al.
1998; Yang y col.2005, 2008) e integridad de la membrana celular.
En conclusión, la expresión del beta gen en plantas de trigo
transgénicas dio como resultado niveles más altos de acumulación de
GB en líneas transgénicas y una protección sustancial del vigor de las
plantas en condiciones de estrés salino. Algunas líneas transgénicas
exhibieron más tolerancia y mayores rendimientos de grano en la tierra
salina en comparación con la línea WT. Este estudio proporcionó
información de que la tolerancia del trigo a las condiciones de alto
contenido de sal podría mejorarse mediante la introducción delbeta se
había producido un gen y un genotipo nuevo para el mejoramiento de la
tolerancia a la sal del trigo.
Expresiones de gratitud Agradecemos al Dr. Yongbin Yan (Universidad de
Tsinghua) por su ayuda con la RMN, al Dr. Xiaoming Li (Universidad de
Shandong) por medir la fotosíntesis y a la Dra. Roberta Greenwood por su
ayuda en la edición de este manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el
Programa de Investigación y Desarrollo de Alta Tecnología (863) de China
(2007AA10Z175, 2007AA091701).
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