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Sugar Tech (julio-agosto de 2018) 20 (4): 464–473
https://doi.org/10.1007/s12355-017-0568-9
ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN
Aislamiento, transformación y sobreexpresión de la caña de azúcar
SoP5CS Gen para la mejora de la tolerancia a la sequía
Jian Li1 • Thi-Thu Phan1 • Yang-Rui Li2 • Yong-Xiu Xing1
Recibido: 24 de agosto de 2017 / Aprobado: 9 de noviembre de 2017 / Publicado en línea: 15 de noviembre de 2017
- Sociedad para la Investigación y Promoción del Azúcar 2017
Abstracto La sequía es uno de los factores limitantes del
crecimiento más importantes para la producción de caña de azúcar
en China. D1- La pirrolina-5-carboxilato sintasa (P5CS) es la enzima
que limita la velocidad en la síntesis de prolina y desempeña un
papel importante en la respuesta de las plantas al estrés por
sequía. En este estudio, la caña de azúcarP5CS (SoP5CS) El gen fue
clonado y enviado a GenBank con el número de acceso KJ546350. El
genSoP5CS tenía 2151 pb de longitud, codificando 716 aminoácidos
con un peso molecular predicho de 77,73 kDa y un punto
isoeléctrico de 6,14. El análisis qRT-PCR mostró que la expresión de
SoP5CS fue mayor en la hoja que en la raíz y el tallo, y fuertemente
inducida bajo los tratamientos ABA, PEG, NaCl y 4 -C. La planta
vector de expresión excesiva deSoP5CS fue construida y
transformada en callos de caña de azúcar por Agrobacterium-
método de transformación mediada, y se obtuvieron plantas de
caña de azúcar transgénicas. Bajo estrés por sequía, algunas líneas
transgénicas con sobreexpresadoSoP5CS mostró significativamente
más alto en SoP5CS nivel de expresión, acumulación de prolina,
contenido de ácido abscísico, actividad superóxido dismutasa y
contenido relativo de agua, pero menor contenido de MDA y
clorofila (valor SPAD)
Y Yang-Rui Li
liyr@gxaas.net
Y Li-Tao Yang
liyr@gxu.edu.cn
1
Universidad de Agricultura, Laboratorio Estatal Clave de
Conservación y Utilización de Agrobiorrecursos Subtropicales,
Universidad de Guangxi, Nanning 530005, China
2
Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Key
Laboratory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement
(Guangxi), Ministerio de Agricultura, Centro de Investigación de la
Caña de Azúcar, Academia China de Ciencias Agrícolas, Academia de
Ciencias Agrícolas de Guangxi, Nanning 530007, China
123
• Li-Tao Yang1
disminuir en comparación con las plantas WT. Además, todas las
plantas transgénicas aumentaron la tolerancia al estrés por sequía.
Nuestros hallazgos indicaron queSoP5CS juega un papel
importante en respuesta al estrés abiótico y la sobreexpresión de
SoP5CS puede mejorar la tolerancia a la sequía en plantas de caña
de azúcar transgénicas.
Palabras clave Caña de azúcar - P5CS gen - Tolerancia a la sequía -
Sobreexpresión - Transformación
Introducción
Caña de azúcar (Saccharum especie híbrida) es un cultivo comercial
importante que se cultiva en todo el mundo como fuente de azúcar y
etanol. La caña de azúcar se cultiva principalmente en el sur de China y
tiene una mayor tolerancia a la sequía que otros cultivos como el arroz y
el maíz en las mismas áreas. Debido a la disminución en la cantidad de
tierra cultivable, más del 80% de la caña de azúcar se cultiva en las
tierras altas donde no se dispone de riego. La sequía es la limitación más
importante para la caña de azúcar y la productividad del azúcar en China
(Li y Yang2015). Por lo tanto, es necesario mejorar la tolerancia a la
sequía de la caña de azúcar y la ingeniería genética podría ser una
estrategia eficiente para desarrollar nuevas variedades de caña de
azúcar.
D1-pirrolina-5-carboxilato sintasa (P5CS) es la enzima
limitante en la síntesis de prolina que abarca las actividades
de C-glutamil quinasaC-GK) y glutámico-C-semialdehído
deshidrogenasa (GSA-DH) y cataliza los dos primeros pasos
de la vía del glutamato (Delauney y Verma1993; Kishor y col.
1995). Hu y col. (1992) clonado P5CSgen de la planta
superior, la polillaVigna aconitifolia) por primera vez, y
descubrió que la expresión del frijol polillaP5CS genVaP5CS)
fue alto en hojas de polilla e inducible en raíces sometidas a
estrés salino. Desde entonces, algunos
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planta P5CS se han aislado genes en otras plantas,
incluyendo Arabidopsis thaliana (Savouré et al. 1995),
Oryza sativa L. (Igarashi y col.1997), Apocynum venetum
Tierra Populus euphratica Oliv (Guo 2007), frijol común
(Chen et al. 2010), soja silvestre (Zhang et al. 2008), soja
(Chu et al. 2010), melón (Huang et al. 2010),Lolium
perenne (Cao y col. 2015), sorgo (Su et al.2011), cebada
(Romman et al. 2011), Puccinellia chinampoensis (Xu y
col. 2011), Jatropha curcas L. (Zhuang y col.2011),
Nicotiana tabacum (Jiao y col.2012), Calotropis procera (
Ramadán y Hassanein 2014), Nitraria tangutorum Bobr.
(Zheng y col.2014), Lilium regaleWei y col. 2016) y
morera (Morus alba) (Zhou y col. 2016).
Se ha informado que las plantas transgénicas que
sobreexpresan P5CS los genes aumentan la tolerancia a
diversos estreses abióticos. Kishor y col. (1995) insertado Vigna
aconififolia P5CS gen en tabaco a través de Agrobacterium
tumefaciens-mediada por la transformación genética y
descubrió que las plantas transgénicas acumulaban más
prolina y presentaban una mayor producción de biomasa y
desarrollo de flores en condiciones de estrés salino. La
tolerancia a la sal también se mejoró enP5CS plantas de papa
transgénicas (Hmida-Sayari et al. 2005), arroz índica
(Karthikeyan et al. 2011), Arabidopsis (Chen y col. 2013), caña
de azúcar (Guerzoni et al.2014) y Brassica napusKubala y col.
2015). Tabaco transgénico conArabidopsis thaliana P5CS El gen
mostró una mayor resistencia al estrés por sequía y salinidad
en comparación con las plantas no transgénicas (Yamchi et al.
2007). Guan y col. (2014) informó que una fuerte tolerancia a
Arabidopsis al estrés por sequía se obtuvo mediante la
transformación deLycium chinense P5CS gene. La función de
un mutagenizadoVigna aconitifolia gene P5CSF129A se
confirmó en garbanzos (Bhatnagar-Mathur et al. 2009) y
Eucalyptus saligna (Dibax y col. 2010).
En este estudio, aislamos caña de azúcar SoP5CS gen, lo
transformó en caña de azúcar y luego analizó su
sobreexpresión en diferentes órganos de las líneas
transgénicas de caña de azúcar, y en hojas de las plantas
bajo diversos tratamientos de estrés (PEG, ABA, 4 -C, NaCl)
en caña de azúcar. Analizamos el papel fisiológico y
bioquímico deSoP5CS en líneas de caña de azúcar
transgénicas bajo estrés por sequía, lo que mejorará
nuestra comprensión del mecanismo molecular de
tolerancia a la sequía en la caña de azúcar.
Materiales y métodos
Materiales de caña de azúcar y tratamientos de estrés de
PEG, ABA, NaCl y 4 -C
En este estudio se eligió la variedad de caña de azúcar Guitang 21 (GT
21), y se sembraron los plantones de caña con una sola yema en
465
arena. Después de que las plántulas crecieron a 3-4 hojas, se
transfirieron a macetas de plástico que contenían arena y tierra en una
proporción de 1: 2 para el cultivo. Cuando las plántulas crecieron a 7-8
hojas, las plantas fueron seleccionadas para tratamientos. El manejo de
las plantas de caña de azúcar y los tratamientos de 15% PEG 6000
(simulan las condiciones de estrés por sequía) y 0.1 mM de ABA se
utilizaron de manera similar a lo informado en el informe anterior (Phan
et al.2017). Los tratamientos de 4 -C y NaCl 200 mM se realizaron
utilizando el método de Wang et al. (2015). Se utilizaron plantas
cultivadas en condiciones normales como control. Se tomaron muestras
de hojas, tallos y raíces para analizar la expresión específica de tejido de
SoP5CS gene. Las muestras de hojas se recolectaron de la hoja? 1 (hoja
de papada visible superior) a las 0, 12, 24, 48 y 72 h, respectivamente,
después del tratamiento. Hubo tres repeticiones para cada tratamiento y
todas las muestras se envolvieron con papel de aluminio, se colocaron
en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC hasta su uso.
Clonación y análisis de secuencia de SoP5CS Gene
Se extrajo ARN de hojas de la variedad de caña de azúcar GT 21
(crecimiento normal) mediante el reactivo Trizol (ComWin
Biotech Co.Ltd., Beijing, China), y se sintetizó la plantilla de
ADNc para la amplificación por RT-PCR utilizando el kit de
síntesis de ADNc de primera cadena RevertAid (Thermo Fisher
Scientific, Shanghai, China). Basado en la secuencia deSoP5CS
en GenBank (número de acceso Eu005373), los cebadores
aguas arriba y aguas abajo se diseñaron como 50-ATGGC-
CACCGTG-GACCG-30y 50-TTGCAAAG-GAAGGTTCTTATGG-30,
respectivamente. Después de la amplificación por PCR, los
productos se purificaron y clonaron en el vector PMD18-T
(TaKaRa, Dalian, China) y se secuenciaron en ambas cadenas en
el Instituto de Genómica de Beijing (Shenzhen, China). Las
propiedades físicas y químicas básicas, el peso molecular y pI
de la proteína especulada codificada porSoP5CS gen fueron
analizados por ExPASy (http://expasy.org/tools/). Programa de
explosión de proteínas (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi),
Se utilizaron los programas SMART y Motif Scan para analizar
los dominios funcionales de la proteína SoP5CS. El árbol
filogenético deSoP5CSsecuencia de nucleótidos del gen y otros
P5CS Las secuencias se construyeron mediante el software
MEGA 6.0.
Análisis de SoP5CS Expresión por PCR
cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)
La expresión de SoP5CS en diferentes órganos (hoja, tallo y
raíz) de plantas de caña de azúcar y en hojas de las plantas
con diferentes tratamientos se analizó mediante qRT-PCR.
De acuerdo con laSoP5CS secuencia de ADNc de longitud
completa, los cebadores para qRT-PCR se diseñaron como
SoP5CSF (50- CAGTTGT-CACGAGGCATGA-30) y SoP5CSR (50-
AACAGCACCTGAGGTCACAA-30). El fragmento objetivo
123
466
la longitud fue de 119 pb. GAPDH gen se utilizó como el gen de
control interno, y los cebadores de GAPDH y los métodos para
qRT-PCR fueron los mismos que en el estudio anterior (Wang et
al.2015). El nivel de expresión relativo deSoP5CS se calculó
utilizando el 2-DDConnecticut fórmula (Livak y Schmittgen2001).
Detección de resistencia de materiales transformados
Fosfinotricina (PPT) era usó comoa planta
marcador seleccionable en el experimento de transformación
genética. Para optimizar la dosis letal de PPT para la selección eficaz
de supuestas plantas transgénicas, los tejidos vegetales se
cultivaron en medio sólido MS con diferentes concentraciones de
PPT en las etapas de diferenciación de callos y enraizamiento. El
cultivo de tejidos de caña de azúcar se optimizó con base en el
método de Xu et al. (2008). Para el cribado de resistencia a PPT, los
callos se recolectaron y cortaron en trozos pequeños, luego se
inocularon en medio de diferenciación con 6 concentraciones
diferentes de PPT, que fueron T0 (0 mg / l), T1 (1.0 mg / l), T2 (2.0
mg / l) l), T3 (2,5 mg / l), T4 (3,0 mg / l) y T5 (3,5 mg / l),
respectivamente. Las botellas de cultivo (vidrio, 240 ml) se
compraron en Tongxiang Glass Products Co. Ltd. (Xuzhou, China).
Se cultivaron 6 callos en cada botella con cinco repeticiones. Los
callos en todos los tratamientos se subcultivaron en un intervalo de
20 días bajo un fotoperiodo de 16/8 h (claro / oscuro) a 25 ° C. La
concentración óptima de PPT se registró de acuerdo con el
crecimiento de callos. Seis concentraciones de PPT para el medio de
diferenciación de raíces fueron T0 (0 mg / l), T1 (1.0 mg / l), T2 (2.0
mg / l), T3 (3.0 mg / l), T4 (4.0 mg / l) y T5 (5,0 mg / l),
respectivamente, y había 6 brotes en cada botella y 5 botellas para
cada tratamiento. Las condiciones ambientales para el cultivo
diferencial de raíces fueron las mismas que para la diferenciación
de callos. Se seleccionó la concentración óptima de PPT para el
enraizamiento de los brotes.
Transformación de la caña de azúcar e identificación de
plantas transgénicas
Todo el marco de lectura abierto de SoP5CS El ADNc se
amplificó mediante PCR. Sitios de restricción deBamHola y
SacoMe agregaron a los cebadores aguas arriba y aguas
abajo, respectivamente. El fragmento diana se purificó y se
insertó en elBamLos sitios HI y SmalI de un vector
modificado de pCAMBIA3300 llamado pUBTB (Feng et al.
2011), que contenía bar gen y fue controlado por el
promotor de ubiquitina de maíz (proporcionado por el Prof.
Shuzhen Zhang, Instituto de Biociencia y Biotecnología
Tropical, Academia China de Ciencias Agrícolas Tropicales,
Haikou, Hainan, China).
Transformación de SoP5CS gen en caña de azúcar se realizó
utilizando Agrobacterium tumefaciens mediación en callos de
caña de azúcar utilizando la cepa EHA105. El procedimiento
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incluyó la preparación de recombinante A. tumefacienssuspensión,
infección y co-cultivo basado en el método de Wang et al. (2005).
Después del co-cultivo, los callos se secaron sobre papel de filtro
estéril y luego se incubaron en medio sólido de diferenciación (MS?
1 mg / l de 6-BA? 0,5 mg / l de KT) que contenía 30 g / l de
sacarosa, 300 mg / l de timentin y PPT (la concentración se basó en
los resultados del cribado resistente) y se cultivó a 25ºC bajo
iluminación a 2000 lx con 14 h / día. El medio selectivo se reemplazó
una vez cada 2-3 semanas. Los brotes regenerados se transfirieron
al mismo medio selectivo hasta que los brotes crecieron hasta
aproximadamente 5 cm de altura, y luego se transfirieron a un
medio selectivo de enraizamiento (MS ≥ 2 mg / l NAA) que contenía
30 g / l de sacarosa, 300 mg / l de timentin y PPT. (la concentración
se basó en los resultados del cribado) y luego se cultivó en las
mismas condiciones. Después de enraizar durante 3 semanas, las
plantas de supervivencia se lavaron, sumergido en una solución de
carbendazim al 2% durante 30 min y luego sembrado en macetas
pequeñas. Después de cultivar en macetas durante 2 semanas, se
extrajo el ADN genómico de la hoja de las supuestas plantas
transgénicas y de control de supervivencia utilizando el kit NuClean
PlantGen DNA (ComWin Biotech Co. Ltd., Beijing, China). El
promotor de ubiquitina del maíz y elbar gen se utilizaron para la
detección de PCR, y los cebadores se diseñaron como: Bar-F (50
-GGTCTGCACCATCGTCAACC-30) y Bar-R (50
-CTGCCAGAAACCCACGTCAT-30); Ubi-F (50-GACA
CCAACCAGCGAACCAGCAGC-30) y Ubi-R (50-TT ATTACGGCGG-
GCGAGGAAGGGA-30). Los productos de PCR amplificados tenían un
tamaño de 295 y 436 pb, respectivamente.
Ensayo de plantas de caña de azúcar transgénicas sometidas a
estrés por sequía
Para investigar si la sobreexpresión de SoP5CS en la caña de azúcar
transgénica mejora la tolerancia a la sequía, las líneas transgénicas
positivas a PCR se seleccionaron como caña de azúcar transgénica y
las plantas cultivadas de tejido no transgénico se utilizaron como
control de WT. Tanto las plantas transgénicas como las de control
sufrieron estrés por sequía sin regar en macetas durante 3 días. Se
tomaron muestras de las hojas para medir los parámetros
fisiológicos, incluidos los contenidos de prolina, MDA y ABA,
actividad SOD, contenido relativo de agua y valor SPAD. Además,
también se utilizó qRT-PCR para detectar la expresión deSoP5CS, y
los cebadores y el gen de referencia fueron los descritos en la
sección anterior.
Análisis estadístico
Los datos se analizaron utilizando el programa de software IBM
SPSS Statistics 18 y el software Excel Micro 2010. Las diferencias
estadísticas se compararon según la prueba de Duncan con la
configuración del valor crítico. PAG valores en 0.05 y 0.01,
respectivamente, y cada experimento tuvo tres repeticiones.
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Resultados
Caracterización molecular y análisis
bioinformático de SoP5CS
Un largo SoP5CS Se aisló ADNc de la hoja de caña de azúcar
(Fig. 1) y la secuencia se presentó en NCBI (Número de acceso
de GenBank: KJ546350). El ORF completo tenía una longitud de
2151 pb que codifica la proteína SoP5CS con 716 aminoácidos,
un peso molecular predicho de 77,73 kDa y un punto
isoeléctrico (pI) de 6,14. Se utilizó SOPMA para predecir la
estructura secundaria de la proteína SoP5CS, y los resultados
indicaron que la proteína contiene 312a-hélices, 149 hebras
extendidas, 68 B-giro inverso y 187 bobinas aleatorias que
representaron el 43,57, 20,81, 9,50 y 26,12%, respectivamente.
La proteína SoP5CS fue predicha por BLAST que contiene
regiones conservadas que incluyen el sitio de unión de ATP, el
dominio de glutamato-5-quinasa (G5 K), el sitio de unión de
NAD (P) H, el dominio de cremallera de leucina putativo y el
dominio de semialdehído deshidrogenasa de glutamato (GSA-
DH) . En algunas plantas se han identificado dos genes P5CS
homólogos con función unificada, comoA. thaliana (Savouré et
al. 1995), tomate (Fujita et al. 1998), sorgo (Su et al. 2011) y caña
de azúcar (Iskandar et al.2014). Otros quinceP5CS Para el
análisis filogenético se seleccionaron secuencias de nucleótidos
con alta homología con la caña de azúcar. Los resultados
revelaron que elSoP5CS La secuencia fue muy cerrada con
SoP5CS2 y Saccharum arundinaceum P5CS (SaP5CS) que era
99% idéntica en la secuencia de nucleótidos con SoP5CS2 (Higo.
2). También elSoP5CS La secuencia presentó alta identidad con
las plantas gramíneas tales como Sorgo bicolor, Zea mays,
Oryza sativa, etcétera.
pb METRO 1 2
2000
Figura 1 Productos amplificados de SoP5CS a partir de ADNc de hojas de caña de
azúcar mediante RT-PCR. Carril M: marcador de ADN; carriles 1-2: productos de RT-
PCR
467
Análisis de SoP5CS Niveles de expresión genética
Se utilizó la variedad de caña de azúcar GT21 para investigar
SoP5CSexpresión génica en diferentes órganos (p. ej., raíces,
tallos, hojas) (Fig. 3), y en hojas con 4 tratamientos diferentes
en diferentes momentos (Fig. 4). Como se muestra en la Fig.3,
la expresión de SoP5CS mostró diferencias significativas en
diferentes órganos ya que la expresión relativa de SoP5CS en el
tallo y la hoja fueron 2,35 veces y 5,49 veces, respectivamente,
en comparación con la raíz.
Los patrones de expresión de SoP5CS en hojas de caña de
azúcar por debajo de 0.1 mM ABA y 4 -C fueron iguales, las
cuales aumentaron gradualmente y alcanzaron su máximo a las
24 h, y luego disminuyeron gradualmente. En comparación con
0 h, el pico de expresión fue de 5,79 veces y 5,01 veces,
respectivamente (Fig.4a, b). Bajo un 15% de estrés PEG, el nivel
de expresión deSoP5CS aumentó rápidamente, alcanzó el pico
a las 24 h, que fue 4,32 veces mayor que a las 0 h, y también se
mantuvo en niveles altos ([doble) a las 48 y 72 h (fig. 4C). Para el
tratamiento con NaCl 200 mM, el nivel de expresión deSoP5CS
aumentó lentamente a las 12 h, pero aumentó bruscamente a
un nivel más alto a las 24 h, y mantuvo una expresión alta a las
48 y 72 h, que fue 4,90, 4,23 y 5,60 veces mayor que a las 0 h
(Fig. 4d), respectivamente. La expresión regulada al alza de
SoP5CS gen en hojas de caña de azúcar bajo cuatro tensiones
diferentes sugirió que SoP5CS El gen podría estar involucrado
en respuesta a diversos estreses ambientales y desempeñar un
papel importante en la regulación de estas respuestas al estrés.
Detección de resistencia de materiales vegetales
transformados
Los tejidos de la variedad de caña de azúcar GXB 9 se utilizaron para la
detección de resistencia a PPT. Los resultados mostraron que a 3.0 mg / l
de PPT o alta concentración, los callos se volvieron marrones y no
pudieron producir brotes primarios (Tabla1). Por lo tanto, se seleccionó
3,0 mg / l de PPT como concentración de detección de resistencia para la
selección transgénica en la etapa de diferenciación de callos (Tabla2).
Cuando los brotes primarios crecieron hasta aproximadamente 5 cm de
altura, los brotes de tamaño constante se cortaron y se transfirieron al
medio MS de enraizamiento que contenía el mismo gradiente de
concentración de PPT para la diferenciación de callos. Con 4.0 mg / l de
PPT o una concentración mayor, los brotes se volvieron amarillos, no
pudieron desarrollar raíces y finalmente murieron. Por tanto, se utilizó
4,0 mg / l de PPT como presión de selección en la diferenciación de
raíces para la selección de transgenes.
123
468
Figura 2 Filogenético
Relación de las secuencias de
nucleótidos entre la caña de azúcar.
SoP5CS y otras especies P5CS
secuencias
100
100
79 66
0,05
6 5.49
5 frescas 30 días después del trasplante. La planta de caña de azúcar
Expresión relativa
4 no transgénica se utilizó como control negativo y el plásmido PUBT-
3 2,35
2 transgénicas para la detección por PCR utilizando cebadores del
1,00
1 promotor de ubiquitina de maíz ybar cebador gen. Los resultados
0 mostraron que, entre un total de 10 supuestas plantas
Raíz Tallo Hoja
Órganos
Fig. 3 Expresiones de SoP5CS en raíz, tallo y hoja de caña de azúcar
Construcción de vectores de expresión y análisis
molecular de supuestas plantas transgénicas
El vector de expresión PUBT-SoP5CS se construyó
mediante ligación de SoP5CS gen con el vector,
transformación del vector con el gen diana en DH5a,
y la transformación del plásmido recombinante en
EHA105. El análisis de verificación de los dos
fragmentos deSoP5CS gen y el vector por doble
digestión conBamHola y Saco Fui conducido. Los
resultados mostraron laSoP5CS se había insertado el
gen en el plásmido del vector y se había construido
con éxito el vector de expresión PUBT-SoP5CS.
los Agrobacterium contenía un plásmido recombinante se
utilizó para infectar callos de caña de azúcar y el co-cultivo de
Agrobacterium y callos de caña de azúcar se realizaron en el
medio de diferenciación MS que contenía 3,0 mg / l de PPT
(según el cribado resistente a PPT) y se subcultivaron 2-3
semanas después. Cuando los brotes de resistencia crecieron a
5 cm de altura, se transfirieron al medio MS de enraizamiento
que contenía 4,0 mg / l de PPT. Aproximadamente 30 días
después, se realizó el tratamiento de endurecimiento y luego se
123
Sugar Tech (julio-agosto de 2018) 20 (4): 464–473
63 Saccharum arundinaceum (EU113257)
100 Saccharum officinarum (KJ546350)
99 Saccharum officinarum P5CS2 (KF178300)
100 Sorgo bicolor P5CS2 (GQ377720)
100 Zea Mays (DQ864376)
Oryza sativa (AY574031)
Triticum aestivum (AY888045)
90
Puccinellia chinampoensis (HQ637435)
100 99 Lolium perenne (KC896627)
Saccharum officinarum P5CS1 (KF178299)
100 Sorgo bicolor P5CS1 (GQ377719)
Musa acuminata, Grupo AAA (JN387126)
A.thaliana (Y09355)
Nicotiana tabacum (HM854026)
Glycine max (FM999730)Manihot
esculenta (JQ807809)
trasplantado a macetas. El ADN genómico se extrajo de las hojas
SoP5CS como control positivo. Se seleccionaron al azar diez plantas
transgénicas, se detectó que 9 plantas contenían un cebador de
ubiquitina mientras que 8 plantas conteníanbar imprimación (Fig. 5
). Los resultados indicaron queSoP5CS Se habían obtenido con éxito
plantas transgénicas de caña de azúcar.
Respuesta de las plantas transgénicas al estrés por sequía
Se seleccionaron cuatro líneas transgénicas (S1, S3, S4 y S5) de las
plantas positivas a PCR para el experimento de estrés por sequía en
el que las plantas en macetas no se regaron durante 3 días. Se
recolectaron muestras de hojas para analizar el nivel de expresión
deSoP5CS usando qRT-PCR, actividad de SOD, contenido de MDA,
prolina, ABA, RWC y SPAD.
Los resultados de qRT-PCR mostraron que los niveles de
expresión relativa de SoP5CS variado en diferentes plantas
transgénicas (Fig. 6a). Los niveles de expresión deSoP5CS se
elevaron significativamente en las líneas S3, S4 y S5, pero
disminuyeron en la línea S1 en comparación con el WT. La
expresión reducida en la línea S1 podría deberse a la cosupresión
del silenciamiento del transgén y genes endógenos homólogos
(Smyth1997). La acumulación de prolina fue consistente con la
expresión deSoP5CS niveles en las líneas transgénicas S3, S4 y S5
cuyos contenidos de prolina fueron 29,73, 50,24 y 37,54%,
respectivamente, superiores a los del WT (Fig. 6B). El patrón de
contenido de prolina en la línea S1 mostró la misma tendencia que
elSoP5CS expresión que fue menor que la de las plantas WT. De
manera similar, el patrón de SOD
Sugar Tech (julio-agosto de 2018) 20 (4): 464–473 469

Figura 4 Expresión de SoP5CSen

hojas de caña de azúcar bajo
a B
tensiones de 0,1 mM ABA (a),4 -C (
8 ABA
B), 15% de PEG (C) y NaCl 200 mM 7 4 oC

Expresión relativa
6 6

Expresión relativa
(D). Las barras de error
representan las desviaciones 5
estándar de tres réplicas 4 4
biológicas
3
2 2
1
0 0
0 12 24 48 72 0 12 24 48 72
Tiempo de estrés (h) Tiempo de estrés (h)

C D
6 CLAVIJA
7 NaCl
6

Expresión relativa
Expresión relativa

5
5
4
4
3
3
2 2
1 1
0 0
0 12 24 48 72 0 12 24 48 72
Tiempo de estrés (h) Tiempo de estrés (h)

tabla 1 Efecto de la concentración de PPT en la diferenciación de callos contenido de MDA (Fig. 6e) en el WT y la línea S1 fue
significativamente mayor que en las líneas S3, S4 y S5. Sin
PPT Número de callos que Diferenciación de callos
concentración muestran diferenciación índice (%) embargo, el patrón de contenido de ABA fue diferente al resto
(mg / l) de parámetros, el cual fue mayor en las líneas S3 y S5 que en el
WT y las líneas S1 y S4 (Fig.6C). El RWC fue de
0 30 100
aproximadamente el 60% en el WT y la línea S1, mientras que
1.0 22 73,3
fue significativamente más alto en las otras líneas transgénicas
2.0 13 43,3
(Fig.6F). Para clorofila (SPAD) en hojas (Fig.6g), no hubo
2.5 5 16,7
diferencia significativa entre las líneas WT y transgénicas en
3,0 0 0
condiciones normales. Cuando las plantas fueron sometidas a
3,5 0 0
72 h de estrés por sequía, el contenido de clorofila disminuyó
considerablemente en el WT y todas las líneas transgénicas,
Tabla 2 Efecto de la concentración de PPT en la diferenciación de raíces pero fue significativamente mayor en las líneas S3 y S4 en
Concentración de PPT (mg / Número de enraizamiento Tasa de enraizamiento comparación con el WT.
l) dispara (%)

0 30 100
Discusión
1.0 23 76,7
2.0 dieciséis 53,3
P5CS es una enzima importante que controla la síntesis de
3,0 4 13,3
prolina de las plantas, y dos homólogas P5CS Se han
4.0 0 0
identificado genes en plantas en los estudios anteriores
5,0 0 0
(Strizhov et al.1997; Hien y col.2003; Armengaud y col.2004;
Chen y col.2013). En este estudio, la caña de azúcarSoP5CS El
La actividad fue la misma que el contenido de prolina en hojas gen tiene una similitud muy alta (99%) de secuencia de
de las líneas transgénicas S3, S4 y S5, que también mostraron nucleótidos con otra caña de azúcar. SoP5CS2 gen (Iskandar et
niveles marcadamente más altos de actividad de SOD bajo al. 2014). El análisis de secuencia también mostró queSoP5CS
estrés por sequía, mientras que no hubo diferencia significativa contiene regiones altamente conservadas con otras plantas, y
entre la línea S1 y la WT (Fig. 6D). Por el contrario, el perteneció a P5CSfamilia.

123
470
bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
500
400
300
200
Figura 5 Plantas de caña de azúcar transgénicas putativas detectadas por PCR
utilizando los cebadores del promotor de ubiquitina de maíz y bar gene. Carriles M,
marcador DL 500; carril 1, control positivo del plásmido PUBT-SoP5CS para detectar
el promotor de ubiquitina de maíz; carril 2, no transgénico de caña de azúcar;
carriles 3–12, supuestas plantas de caña de azúcar transgénicas detectadas
Algunos genes de plantas pueden ser inducidos por estreses
abióticos como la sequía, las bajas temperaturas y el alto
contenido de sal. Estudios anteriores informaron que la
expresión deP5CS gen fue regulado positivamente bajo la
sequía y el estrés salino en Lilium regaley Morus alba (Zhou y
col. 2016; Wei y col.2016), que fueron consistentes con los
resultados del presente estudio. Además, elP5CS Los genes que
controlan la acumulación de prolina durante el estrés salino
requieren ABA y están regulados por ABA1, ABI1 y AXR2 en
Arabidopsis thaliana (Strizhov y col. 1997). En este estudio, la
expresión deSoP5CS fue fuertemente inducida por ABA
exógena (Fig. 4a), que sugirió que SoP5CS puede ser controlado
por una vía de señalización de estrés dependiente de ABA. Es
más,SoP5CStambién fue inducida por el frío (4 -C), y se han
reportado resultados similares en otras plantas como el arroz,
Arabidopsis y raigrás (Hur et al. 2004; Zheng y col.2014; Cao y
col.2015).
Bower y Birch (1992) informó por primera vez del éxito de la
caña de azúcar transgénica. Desde entonces se han realizado cada
vez más esfuerzos de modificación genética en la caña de azúcar y
se han obtenido algunos logros (Zhangsun et al.2007; Kumar y col.
2014; Guerzoni y col.2014). Sin embargo, no ha habido ningún
informe sobre la variedad de caña de azúcar transgénica que pueda
aplicarse ampliamente a escala comercial. Debido al alto nivel de
poliploidía en la caña de azúcar, el genoma complejo, la
heterocigosidad, la naturaleza aneuploide, las variedades de caña
de azúcar transgénicas con buenos caracteres integrales son muy
difíciles de crear (Gupta et al.2010). Por primera vez, Molinari et al. (
2007) caña de azúcar transformada con un heterólogo (Vigna
aconitifolia) P5CS gen a través de un sistema de bombardeo de
partículas y consideró que la sobreproducción de prolina en líneas
transgénicas de caña de azúcar puede jugar un papel importante
en la protección del aparato fotosintético de la caña de azúcar bajo
estrés por sequía. En este estudio, sobreexpresamos con éxito la
endógenaSoP5CS gen en la caña de azúcar por Agrobacterium-
transformación mediada, que tiene ventajas sobre el método
biolístico en metodología simple y más económica y con alta
eficiencia. Encontramos esa alta expresión deSoP5CSen 3 de las 4
líneas transgénicas bajo estrés por sequía. Está
123
Sugar Tech (julio-agosto de 2018) 20 (4): 464–473
utilizando los cebadores del promotor de ubiquitina de maíz; carril 13, control
positivo del plásmido PUBT-SoP5CS para detectar elbar gene; carril 14, caña de
azúcar no transgénica; carriles 15-24: supuestas plantas de caña de azúcar
transgénicas detectadas utilizandobar gene
interesante que los patrones de SoP5CS expresión, el contenido de
prolina y la actividad de SOD en estas tres líneas transgénicas
fueron similares y fueron significativamente más altas que las de
WT bajo estrés por sequía, mientras que el contenido de MDA
mostró el patrón opuesto en estas líneas transgénicas.
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) se acumularían en las
células vegetales bajo estrés, ya que las ROS pueden alterar
seriamente el metabolismo normal de las plantas a través del daño
oxidativo a los lípidos, ácidos nucleicos y proteínas, que afectan el
crecimiento y desarrollo de la planta (Ray et al. 2012; Sharma y col.
2012). La MDA también se acumularía debido a la peroxidación de
lípidos de la membrana en plantas sometidas a estrés (Neill et al.
2002); por lo tanto, MDA fue un indicador que refleja el nivel de
lesión de la membrana bajo estrés osmótico (Moore y Roberts1998).
Se ha demostrado que la SOD protege las células vegetales durante
el estrés oxidativo cuando las ROS se presentan en pequeñas
cantidades (Kim et al.2005). La prolina libre es un osmolito
multifuncional en las plantas y juega un papel importante en la
mejora de la tolerancia al estrés osmótico (Krasensky y Jonak2012).
También se presentó que la acumulación endógena de ABA era
importante para la regulación deP5CS expresión y nivel de
acumulación de prolina en Lycium chinense (Guan y col. 2014). Se
obtuvo una mayor acumulación de prolina enP5CS-plantas
transgénicas, que confiere tolerancia al estrés abiótico (Kumar et al.
2010). Existía una estrecha relación entreSoP5CS nivel de
transcripción, acumulación de prolina y contenido de ABA bajo
estrés por sequía (Guan et al. 2014). No existe evidencia directa que
explique el mecanismo regulador entre ellos, pero de acuerdo con
investigaciones previas y los resultados del presente estudio,
consideramos que elSoP5CS El nivel de transcripción en la caña de
azúcar posiblemente esté controlado por una vía endógena
dependiente de ABA, que regula aún más la biosíntesis de prolina.
La actividad de SOD y el contenido de prolina aumentaron
significativamente y el contenido de MDA disminuyó en algunas
líneas de caña de azúcar transgénicas bajo estrés por sequía en el
presente estudio, lo que sugirió que estas plantas de caña de
azúcar transgénicas tenían menos daño en la membrana o
mejoraron la tolerancia al estrés por sequía. Mayor RWC y menor
disminución del contenido de clorofila en algunas líneas
transgénicas
Sugar Tech (julio-agosto de 2018) 20 (4): 464–473 471

Figura 6 Expresiones de SoP5CS

(a), contenido de prolinaB),ABA (C) y
a B
MDA (mi), actividad de SOD (D), RWC
6 4,78 4.82

Contenido de prolina (ng /gFW)

(F), y valor SPAD (gramo) en WT y dieciséis

5 **

Erpresión relativa
cuatro líneas de caña de azúcar
** **
transgénicas de S1, S3, S4, S5 bajo 4 12
estrés por sequía. Todos los datos
3 2.23 8 **
son malos± SD calculada a partir de
2
tres repeticiones. Los símbolos * y 1,00
** indican una diferencia 1 0,64 4
significativa en
0 0
PAG\0.05 y PAG\0.01,
PESO S1 S3 S4 S5 PESO S1 S3 S4 S5
respectivamente, entre las
líneas WT y transgénica
C D
150 ****
3
*

Actividad de SOD (U / mL)

120 *
Contenido de ABA (μg / gFW)

2 **
** 90
** **
60
1
30

0 0
PESO S1 S3 S4 S5 PESO S1 S3 S4 S5

mi
F
12
Contenido de MDA (μmol / gFW)

80% ****
* **
** ****
60%
8 RWC
40%
4
20%

0 0%
PESO S1 S3 S4 S5 PESO S1 S3 S4 S5

gramo
0h 72h
50

40 ** **
Valor SPAD

30

20

10

0
PESO S1 S3 S4 S5

También indicó que algunas plantas transgénicas eran más tolerancia en algunas líneas de caña de azúcar transgénicas que podrían
tolerantes al estrés por sequía que las WT. Entre ellos, las ser útiles para una aplicación adicional en la mejora de la tolerancia a la
líneas transgénicas S3 y S4 mostraron un mejor desempeño sequía de la caña de azúcar.
y más tolerantes al estrés por sequía.
En conclusión, un P5CS gen en la caña de azúcar, Fondos El presente estudio fue apoyado por las subvenciones del Programa
Nacional de Investigación y Desarrollo de Alta Tecnología (Programa '' 863 '')
SoP5CS, fue clonado y caracterizado en este estudio. los
de China (2013AA102604), Programa de Cooperación Científica Internacional
SoP5CS fue fuertemente regulada por ABA y estrés abiótico, de China (2013DFA31600), Fondos Especiales de Guangxi para Académicos
y la sobreexpresión de SoP5CS gen podría mejorar la sequía Bagui y Expertos Distinguidos (2013-03), Fondo

123
472
del Laboratorio Clave de Guangxi para la Mejora Genética de la Caña de
Azúcar (12-K-05-01), Fondo para Equipos de Innovación de Tecnología Agrícola
Moderna de Guangxi (gjnytxgxcxtd-03-01) y Fondo de la Academia de Ciencias
Agrícolas de Guangxi (2015YT02).
Contribución de los autores JL, YRL y LTY diseñaron el experimento,
JL, TTP, YXX y LTY realizaron el experimento, JL, YRL y LTY
escribieron el manuscrito, YRL revisó y finalizó el manuscrito.
Cumplimiento de estándares éticos
Conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningún conflicto de
intereses.
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