Agrobacterium Tumefaciens MEDIATED IN PL

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REVISTA INTERNACIONAL DE BIOCIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA • vol. 7 No. 1 • Septiembre 2019 eISSN: 26559994
pISSN: 23033371
https://doi.org/10.24843/IJBB.2019.v07.i01.p04
Agrobacterium tumefaciens MEDIADO EN EL MÉTODO DE TRANSFORMACIÓN DE PLANTAS
PARA EL GEN SoSPS1 EN PLANTAS DE CÍTRICOS (Citrus nobilis L.)
Ni Putu Ayu Erninda Oktaviani Suputri1*, Rindang Dwiyani1 , Ida Ayu Putri
Darmawanti1 , y Bambang Sugiharto 2
1Facultad de Agricultura, Universidad de Udayana, Jalan PB Sudirman Denpasar,
Indonesia 2Centro de Desarrollo de Ciencia y Tecnología Avanzadas (CDAST), Universidad de
Jember,
Indonesia *Autor para correspondencia: ernindasuputri13@gmail.com
ABSTRACTO
El gen SoSPS1 de las plantas de caña de azúcar previamente sometidas a la clonación mediada por
Agrobacterium tumefacien iba a transferirse a plantas de cítricos para aumentar el metabolismo de la sacarosa en
la planta. El ADNT albergaba el gen SoSPS1 bajo el control del promotor CaMV 35S del virus del mosaico de la
coliflor y contenía el gen NPTII (gen de resistencia a la kanamicina) como marcador seleccionable para la selección
de transformantes. Generalmente, la transformación de genes en plantas se lleva a cabo mediante cultivo de
tejidos. Sin embargo, el cultivo de tejidos tiene varias desventajas, como que consume mucho tiempo, a veces da
como resultado mutaciones somáticas y variaciones somaclonales, y el requisito de condiciones estériles en el
procedimiento de transferencia de genes. La transformación in planta es un sistema útil para aquellas plantas que
carecen de un sistema de cultivo y regeneración de tejidos. La función principal de la transformación in planta es
recuperar las ventajas del cultivo de tejidos como un método eficiente y rápido, incluida su capacidad para producir
una gran cantidad de plantas transgénicas y acumular una alta concentración de proteína soluble total en poco
tiempo. Hay dos procedimientos de transformación in planta para las semillas de las plantas de cítricos, a saber,
"pinchazo y capa" y "corte e imbibición de las puntas de las semillas". En el método de pinchar y recubrir, las
semillas se pinchan en toda su superficie y se untan con una suspensión de Agrobacterium tumefaciens. En el
método de imbibición y corte de la punta de la semilla, por otro lado, las semillas se cortan en la punta y se
sumergen en una suspensión de Agrobacterium tumefaciens. Las hojas derivadas del tratamiento de semillas se
tomaron como muestras para extracción de ADN y PCR utilizando cebadores del gen NPTII (Avance: 5'
GTCATCTCACCTTCCTCCTGCC3'; Reverso: 5'
GTCGCTGGTCGGTCATTTCG3'). Esta investigación encontró que solo las plantas de imbibición y corte de
la punta de la semilla amplificaron a lo largo de la banda de 550 pb, mientras que las del método de pinchar
y recubrir no lo hicieron. Además, el TDNA se integró con éxito en el genoma de las plantas tratadas con el
método de imbibición y corte de la punta de la semilla , pero no con el pinchazo y la capa.
Palabras clave: prick and coat, NPTII, corte, SoSPS1, TDNA
INTRODUCCIÓN consumo nacional de cítricos per cápita
La naranja es uno de los productos básicos. aumentó un 9,76%, mientras que el volumen exportado
clasificadas como frutas de alto valor importantes para disminuyó en un 10,5% debido a una disminución en el
tanto en el mercado nacional como en el mundial, calidad de los productos cítricos en Indonesia. Datos
tanto en forma fresca como procesada. Residencia en demostró que el naranja tiene un alto valor económico
Estadísticas Agrícolas (2017), en 2016, el valor, lo que requiere la mejora de la
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MÉTODO DE TRANSFORMACIÓN MEDIADO POR Agrobacterium tumefaciens In Planta PARA EL GEN SoSPS1 EN PLANTAS
DE CÍTRICOS (Citrus nobilis L.)
Ni Putu Ayu Erninda Oktaviani Suputri, Rindang Dwiyani, Ida Ayu
Putri Darmawanti y Bambang Sugiharto
calidad de los productos y la variedad en electroporación (D'Halluin et al., 1992) y
para lograr una alta variedad, alta indirectamente a través de la ayuda de Agrobacterium
producción, sabor dulce y resistencia a tumorigénico (Ishida et al., 1996; Zhao et al.,
estrés biótico y abiótico. 1998; Negrotto et al., 2000; Frame et al.,
Una de las cualidades deseables en 2002; Dwiyani et al., 2016;
naranja es sabor dulce. Mejora de tal Transformación indirecta utilizando A.
la calidad se puede realizar a través de la inserción de tumefacienss es mejor que directo
el gen SoSPS1, un gen que codifica el transformación porque este método es más
proteína sacarosa fosfato sintasa (SPS), eficaz y eficiente en la aplicación en que,
clonado de plantas de caña de azúcar como clave en transformación indirecta, el laboratorio
enzima en la biosíntesis de sacarosa en el la práctica es simple, y la inserción del
planta, lo que resulta en aumentos en el metabolismo gen más estable, que en directo
(fotosíntesis) y el nivel de sacarosa en transformación, resultando en una mayor estabilidad en
plants (Sugiharto et al., 1997). la expresión génica y menos genoma
La mejora de la variedad vegetal puede alteración de la planta transformante (Hansen
llevarse a cabo de manera convencional a través de y Chilton, 1996, Dai et al., 2001;
reproducción o en un modo moderno a través de et al., 2006; Rahmawati, 2006; Mahoma
genético ingeniería o genético y Matrimonio, 2011).
transformación. Inserción de gen por cruce La utilización de A. tumefaciens en
la cría tiene las siguientes debilidades: 1) este estudio se basó en la capacidad del microbio
el proceso de incorporación del gen es para infectar plantas dicotiledóneas y causar tumores en las
incontrolable, y la expresión génica es tronco (Larebake et al., 1974). A. hinchazón
inestable y 2) el cruzamiento se vuelve también es capaz de transferir tumor recombinante
imposible. Mejora de la variedad por genes en vectores de transformación (Dwiyani
La transformación genética puede superar la et al., 2016). Inserción mediada por A.
debilidades de las prácticas convencionales, y tumafaciens se ha llevado a cabo con éxito
la estabilidad de la transferencia de genes en los genomas en plantas monocotiledóneas como el arroz
de las plantas se probarán a través de molecular (Raineri et al., 1990; Park et al., 1996;
etapas La transformación genética es el proceso Komari et al., 1998), maize (Ishida et al.,
de introducir un gen de un organismo a 1996), y plátano (May et al., 1995).
otro directamente a través del bombardeo de partículas La transformación genética puede ser
(Hansen y Wright, 1999), el uso de realizado in vitro o in planta. in vitro
polietileno glicol (CLAVIJA), y La transformación generalmente implica la
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introducción de genes en el callo con embriogénesis en la que una sola célula
qué plantas se van a regenerar. el in vitro se convierte en un grupo de células meristemáticas.
método viene con algunas desventajas: 1) Los embriones nucelares crecerán uniformemente hasta el
este método requiere mucho tiempo; 2) hay un padre en raíces primarias relacionadas con la calidad de
mutación somática o variación somaclonal en la fruta que son capaces de explotar el extremo
células vegetales durante el cultivo de tejidos; y 3) condiciones del suelo y ser resistente a
el proceso de transferencia de genes requiere un estéril enfermedades específicas.
condición de los medios. La transferencia en planta Investigación sobre la implementación de
método puede superar tales desventajas de este método en semillas poliembriónicas naranjas
el método in vitro . Es esencialmente simple, se necesita El método se innova a partir de la
eficiente, estable y productiva de genes que combinación del método de pinchar y remojar
replicar a través de una sola inserción en el (pinchazo y abrigo) (Sanjaya, 2018) y el
genoma (Birch, 1997). método de imbibición (corte de la parte superior de la semilla y
El método in planta implica bebida). Los métodos de tratamiento de la
remojo por el cual los pólenes de la floración objetos de esta investigación son 1) pinchazo y abrigo
las plantas se insertan sin pasar por el (las semillas se pinchan en toda la superficie y
fase de cultivo de tejidos (Feldmann y Marks, untado con una suspensión de Agrobacterium
1987; Feldman, 1992). Varios tipos de tumefacien), un método inspirado en el pinchazo
plantas en las que en planta genetica y método de remojo, y 2) corte superior de semillas y
la transformación ha sido exitosa imbibición (las semillas se cortan en la punta y
realizadas son Medicago trunttula (Trieu et al . empapado en una suspensión de Agrobacterium
Alabama. 2000), Arabidopsis thaliana (Bent 2000), tumefacien), un método adaptado de la
manzana, pera, tomate, melocotón, fresa teoría de la imbibición.
(Spolaore et al., 2001) y naranja (Ahmad
y Mirza, 2005). MATERIALES Y MÉTODOS
Según Bhojwani (1979), Los materiales de investigación son la sacarosa.
semillas de naranja son capaces de poliembrionario Se proporciona el gen de la fosfato sintasa (SoSPS1)
desarrollo de semillas en el que una semilla puede por el profesor Bambang Sugiharto, director de
convertirse en más de un embrión. el Centro para el Desarrollo de Avanzados
La poliembrionía produce un embrión cigótico Ciencias y Tecnología (CDAST), Jember
de la fusión de gametos masculinos y femeninos Universidad. El TDNA albergaba el SoSPS1
en la nucela que está formada por un embrión gen bajo el control del CaMV 35S
saco. La embrión nucelar es somática. promotor y el gen NPTII, una kanamicina
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gen resistente como marcador seleccionable para a diciembre de 2019 en el Laboratorio de Planta
selección de transformantes. Este ADNT fue Cultivo de Tejidos, la Facultad de Agricultura,
construido en el plásmido pKYS y clonado Universidad de Udayana, y el Laboratorio de
a la cepa LBA4404 de A. tumefacienss . El CDAST, Universidad de Jember. El ADNT
experimento se llevó a cabo a partir de septiembre construcción se muestra en la Fig. 1.
600 pb
550 pb
Fig. 1. Cultivo de Agrobacterium tumefacien que porta vector con estructura de plásmido pKYS de
contraste de ADNT que contiene el gen SoSPS1 y el gen NPTII. Borde derecho, RB; Borde
izquierdo, LB; Promotor del gen de la nopalina sintasa, Pnos; Sitio de poliadenilación del gen de la
nopalina sintasa, Tnos; gen de Neomicina Fospotransferasa, NPTII; promotor 35S del virus del
mosaico de la coliflor, P35SCaMV; Gen de sacarosa fosfato
sintasa, S0SPS1 (Fuente: Sugiharto et al., 1997 en Dwiyani et al., 2019)
Colonias de bacteria A. tumefaciens la velocidad de 5.000 rpm durante 10 minutos.
fueron sometidos a PCR, cultivados en un sólido LB Resultados setrifugasa de disolvente con el
(LuriaBertani) medio de reproducción, las bacterias a caracterizar se precipitan
luego se movió en un medio LB líquido a 2 mL rosa (pellet) sobre la base del tubo
y añadido a 50 ppm de antibiótico reacción. Se descartó el sobrenadante y
kanamicina, 100 ppm de rifampicina y 12,5 el precipitado resuspendido en ½ MS
ppm de gentamicina antes de ser incubada en medio que ya contenía 100 ppm de
un agitador a 150 rpm a una temperatura de 28 acetosiringona y TWEEN20 al volumen
durante 24 horas hasta que la DO alcanzó 0,6. de 200 mL, se mezcla continuamente hasta
Después de eso, cada 1 mL de A. se alcanzó la homogeneidad. el cambio de
los medios de comunicación se llevó a cabo dentro de LAFC. El
tumefaciens cultivo se colocó en 20 mL de
La suspensión bacteriana estaba entonces lista para usar.
medio líquido LB e incubado a una
temperatura de 24 durante 24 horas, luego La transformación in planta en este
transferidos a tubos de ensayo. Los tubos de ensayo fueron El estudio se realizó a través de tres
cubierto con papel de aluminio estéril y tratamientos: 1) semillas de naranja fueron perforadas por un
Envoltura de plástico. Los tubos de ensayo que contienen aguja y untado con una suspensión de A.
Los cultivos de la bacteria se centrifugaron a tumafacien (pinchazo y capa); 2) semillas de naranja
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fueron cortados en la punta y empapados en una suspensión eliminar patógenos. Se llevó a cabo la crianza,
de A. tumafacien durante 30 minutos (Bastos et al. es decir, regar y desherbar todos los días y
al., 2003; Li et al., 2003) (corte de la punta de la semilla agregando fertilizante NPK una vez por semana. Plantas
e imbibición); y 3) semillas de naranja fueron fueron cosechados a la edad de 4 semanas, (un
no recibió ningún tratamiento con fines de comparación altura de 20 cm, 20 hojas de hojas).
(control) (Fig.2).
Las semillas fueron sembradas en crecimiento
medios (carbón vegetal, cáscara, suelo y fertilizante)
y esterilizado a una temperatura dada para
a b C
Fig. 2. Métodos de transformación de semillas de plantas de cítricos: 1. corte de la punta de la semilla y tratamiento de
imbibición (a) corte de la punta de la semilla y (b) remojo de la semilla en la suspensión de A. tumefaciens durante 30
minutos, 2. pinchazo y tratamiento de la capa (c) pinchar las semillas y untarlas con A. tumefaciens
Los resultados obtenidos de la planta la etapa de desnaturalización a 95 ºC durante 30
Los aislamientos de ADN fueron luego sometidos a una PCR segundos, la etapa de recocido a 59 ºC durante 30
(reacción en cadena de la polimerasa) proceso. Muestras segundos, la etapa de extensión a 72 ºC durante 1
de plantas se agregaron 7 mL de H2O, 10 minuto, y la extensión final a 72 ºC durante 5
mL de mezcla maestra, 1 mL de NPTII adelante minutos, 35 veces. De la PCR, las muestras
primer (5' luego se insertaron en pocillos de gel de agarosa
GTCATCTCACCTTGCTCCCTGCC3'), y y déjelo funcionar durante 25 minutos a 100 voltios. El
1 mL de cebador inverso NPTII (5' Los resultados obtenidos se visualizaron luego en un UV
GTGCCTGGTCGGTCATTTC3') en gabinete.
eppendorf. La PCR se realizó a través del
etapa de predesnaturalización a 95 ºC durante 3 minutos,
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN todavía albergado por todas las colonias individuales
probado Están indicados por bandas de 550 pb
Antes de hacer la transformación,
amplificado usando cebadores NPTII (Adelante: 5'
confirmó el gen de interés dentro del
GTCATCTCACCTTCCTCCTGCC3';
Agrobaterio. Diez (10) colonias individuales de
Contrarrestar: 5'
Agrobacterium fueron probados. Los resultados pueden
GTCGCTGGTCGGTCATTTCG3').
puede verse en la Fig. 3. En esta imagen, el gen es
3000 pb
1000 pb
550 pb
Fig. 3. Confirmación génica en A. tumefaciens utilizando cebadores NPTII. P = plásmido; 1–10 = colonias individuales
de A. tumefacienss; M = marcador de ADN de escalera de ADN de 1 kb.
Para describir el éxito de la en el corte e imbibición de las puntas de las semillas
método de transformación, cálculo de la tratamiento, 0% en el tratamiento prick and coat,
porcentaje de eficiencia de las plantas de cítricos y 0% en el control. los datos de la
Se realizaron tratamientos de transformación. De porcentaje de eficiencia de la transformación de la planta
las 30 semillas en cada tratamiento con A. se muestran en la Tabla 1.
tumefaciens y control, las semillas encontradas
Ser transformación positiva ascendió al 16,7%
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Mesa. 1. (%) Eficiencia de Transformación de la Planta
Semillas ∑ Semillas ∑Transformativo (%) Eficiencia
Tratamiento tratado germinado plantas putativas de Planta
Transformación
pinchazo y capa 30 1 0%
Punta de semilla 16,7%
Corte y 30 5 5
Bebida
Control 30 30 0%
El aislamiento de ADN utilizó el modificado transformantes candidatos en la punta de la semilla
método de minipreparación de Zang y Stewart tratamiento de corte e imbibición réplica 2
(2000). La lectura se realizó en los tres (PR2), transformantes candidatos en la semilla
muestras de tratamientos después de la electroforesis, y réplica del tratamiento de imbibición y corte de puntas
los resultados del análisis molecular son 3 (PR3), transformantes candidatos en la semilla
se muestra en la Fig. 4. El análisis de PCR fue réplica del tratamiento de imbibición y corte de puntas
realizado utilizando el cebador NPTII para la 4 (PR4), transformantes candidatos en la semilla
genes con una amplificación estimada en el réplica del tratamiento de imbibición y corte de puntas
Banda de 550 pb en el tratamiento de punta de semilla 5 (PR5), y transformantes de plantas candidatas en
corte e imbibición (PR). La Fig. 4 muestra el el tratamiento de pinchar y remojar réplica 2
resultados del análisis molecular de siete (TL2). El análisis se llevó a cabo en dos
muestras: el control (K), candidato etapas: 1) comparar entre tratamientos y
transformantes en el corte de puntas de semillas y 2) para confirmar los métodos de los tratamientos y
tratamiento de imbibición réplica 1 (PR1), replicaciones.
550 pb
600 pb
500 pb
Fig. 4. Visualización por PCR de plantas de cítricos candidatas transgénicas, M (Marcador), PR 1 (Corte de la punta de
la semilla y repetición de imbibición 1), TL (Prick and Coat), K (Control)
plásmido
PR2 PR3 PR4 PR5
K (+)
550 pb
600 pb
500 pb
Fig. 4. B Visualización por PCR de plantas de cítricos candidatas transgénicas entre replicaciones, M (marcador),
plásmido pKYSSoSPS1 como control positivo, PR2 (repetición 2 de corte de puntas de semillas e imbibición), PR3
(repetición 3 de corte de puntas de semillas e imbibición ), PR4 (repetición de imbibición y corte de puntas de semillas 4)
y PR5 (repetición de imbibición y corte de puntas de semillas 5)
El método de transformación utilizado fue fases meristemáticas, una de las cuales es la semilla
la transformación in planta . en planta (embriogénesis somática). Esto se debe a que el
La transformación es el proceso de gen directo. la replicación de genes en el genoma de la planta toma
transferencia a partes de plantas que sufren lugar en una gran cantidad, haciendo que el gen
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estable y reproducible. en planta germinación de semillas de plantas (Lester, 2019). El
la transformación es más eficiente que in vitro método de imbibición y corte de la punta de la semilla (PR)
método. Se considera simple y fácil de integra el gen NPTII en la planta
hacer porque se dirige a plantas ex vitro , o plantas genoma Basado en la visualización de la
que no se derivan del cultivo de tejidos. En Los resultados de la PCR, la amplificación se llevó a cabo junto con
transformación de planta ofrece una solución a la la banda de 550 pb (Fig. 4. A), y análisis
debilidades del método in vitro : la continuó entre cinco repeticiones (Fig. 4. B),
proceso requiere un largo período de tiempo y generando los mismos resultados.
mano de obra más calificada, y puede generar La suspensión de A. tumefaciens
variación somaclonal (Kalbande y Patil, consiste en medio MS nutritivo, colonias
2016). de A. tumefaciens, y
El método in planta realizado en acetosiringona. Según Salisbury y
semillas de naranja en la presente investigación fue Ross (1992), alta concentración A.
modificado del método de pinchar y remojar por la suspensión tumefaciens es capaz de entrar en
Sanjaya (2018) en el que se pincharon semillas células de semilla de baja concentración. imbibición de semillas
y recubierta con una suspensión de A. es la absorción espontánea de líquido por
tumefaciens (TL). Además, un método adaptado material seco y poroso. En la poliembrionía, el
de la teoría de la imbibición de semillas (Salisbury Se infiltraron semillas de naranja altamente porosas.
y Ross, 1992) llamado corte de punta de semilla y con la suspensión por el pasivo
También se usó la imbibición (PR). transporte de ósmosis, con la estructura del
Los resultados del uso del in planta poros que afectan la velocidad de la suspensión
método se muestran en la Tabla 1, y los resultados absorción. (Jean et al., 2018).
del análisis de PCR en la Fig. 4. Desde el El factor de la transformación.
incorporación de A. tumefaciens en 60 semillas El éxito de este estudio fue el uso de
en los tratamientos y control se encontró TWEEN20, explantes transformacionales y
que la transformación en el corte de puntas de semillas acetosiringona (AS). Clough y Bent
y el tratamiento de imbibición (PR) ascendió (1998) afirma que la administración de
16,7%, en el tratamiento prick and coat (TL) tensioactivo a baja concentración en el
0%, y el control 0%. El corte de la punta de la semilla medio de inmersión por el método floraldip
e imbibición (PR) generó un buen nivel puede aumentar el número de transformantes
de eficiencia pero es necesario mejorar obtenido en la planta Arabidopsis thaliana.
por varios factores: 1) remojo de semillas de naranja TWEEN20 es uno de los tipos de surfactantes que
en suspensión y 2) temperatura del cítrico Sirve para bajar la tensión de la superficie de
la célula, reduciendo la hidrofobicidad de la las semillas celulares. Según Jones y Dangl
células vegetales y bacterianas y facilitando la (2006), las reacciones de hipersensibilidad son generalmente
fijación de A. tumefaciens en la planta activo durante los ataques de patógenos en
células (Miller, 2013). células vegetales moleculares. Las etapas comienzan con
Los explantes también influyeron en la la planta reconoce los patógenos entrantes
éxito de la transformación. Fue y comenzando a activar el sistema de resistencia.
asociado con el proceso fisiológico Mientras tanto, los patógenos con éxito
se dedicaron los órganos de las plantas. Endógeno desplegar efector que son virulentos. Efectores
Los compuestos fenólicos en las semillas funcionan como que son reconocidos por el sistema inmunológico de la planta
agentes activos que estimulan la germinación en sistema envía señales a los nucleótidos. El
condiciones anaeróbicas. El fenol total varía Los nucleótidos resisten a los patógenos por medio de
según el tipo o variedad. Fenol células letales (reacción de hipersensibilidad).
los compuestos en las semillas serán naturalmente activos El segundo factor fue la semilla.
en el proceso de imbibición (Pramono, 2017). temperatura de germinación. En este estudio el
Tienen una gran influencia y papel en semillas fueron germinadas a humedad media,
activando virgen para liberar TDNA de dando a las semillas un estrés y dando lugar a una
plásmidos y entregan TDNA a las células vegetales para disminución del metabolismo. La disminución de la
integrarse con los genomas de las plantas. la calidad de la semilla fue indicada por un aumento en
Además, el aumentar en el el contenido de grasa. Los hongos atacan las semillas durante
concentración de acetosiringona sintética germinación a humedad normal, la materia es el
(AS) influirá en la eficiencia y el éxito porcentaje de resultado que crece a partir de plantas de cítricos
y acortar el tiempo de inmersión en es bajo y también afecta el porcentaje de
semillas de berenjena (Chumakov, 2007). eficiencia putativa de las plantas transformadas
Con base en los datos de la Tabla 1, la semilla (Worang et al., 2008). Mientras tanto, un alto
El método de corte de punta e imbibición (PR) tuvo un contenido de ácidos grasos indica que el
porcentaje de eficiencia transformadora de el proceso de respiración era alto, causando que el
16,7%, y esta tasa de éxito se puede aumentar semillas a perder energía para la germinación.
por factores internos de las semillas de naranja (el La germinación de semillas funcionaría bien a un
estado fisiológico de semillas recalcitrantes): el temperatura óptima de 14 ºC, almacenado bajo
tiempo del proceso de imbibición. Semillas de plantas de cítricos una condición seca y fría. Esto se debe a que el
que tienen una estructura porosa requieren sólo un la calidad de las semillas sería óptima bajo
corto periodo de tiempo. Remojo durante 30 minutos tales condiciones, aumentando así la velocidad
es menos eficiente, causando hipersensibilidad a de crecimiento (Pradhan y Badola, 2012).
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Los factores inhibidores de la disminuir, causando que las semillas pierdan energía para
transformación por el método prick and coat germinación (Yuniarti et al., 2008).
(TL) incluía la punción de las semillas y La punción de las semillas se
el uso de explantes. La semilla utilizada fue causar un estado de colapso de las celdas como se muestra
recalcitrantes, que tienen altos niveles de en la Fig. 5. El colapso de venta de semillas durante el
agua para mantener el vigor y la viabilidad de incorporación de la suspensión de A.
las semillas. El tratamiento con pinchazos reduciría tumefaciens inhibiría la producción de
la calidad de las semillas de naranja. El ATP en las células por envenenamiento del
indicadores bioquimicos (gordo, proteína, mitocondrias Así que los genes que a través de
carbohidrato) en las semillas que experimentaron la inserción no se replique y el gen no se
una disminución en la calidad mostró un cambio en amplificado en el genoma de las plantas. Potencial
la actividad de la enzima, un cambio en la daño a las membranas celulares debido a la punción
tasa de respiración, un cambio en la comida y la infección por A. tumefaciens indica
reservas, un cambio en la membrana, una que el suministro de ATP influye en el éxito
daño a los cromosomas y acumulación del proceso de replicación de genes. Entonces, basado
de materiales tóxicos (Tatipata, 2008). El en la rigidez de las células, es importante
el proceso de pinchado disminuiría el agua llevar a cabo la transformación genética y la salud
nivel y poder de germinación de las semillas, por lo que mantenimiento de las semillas de cítricos (Salisbury
el contenido de grasa en las semillas tendió a aumentar y Ross, 1992).
y los niveles de carbohidratos y proteínas
La figura 5. Microscopio 10 X
La anatomía de la semilla se compone de testa, endospermo y tejidos embrionarios; el tejido de la testa
consta de células esclereidas (SK), mientras que el endospermo y los tejidos del embrión consisten en células de
parénquima (P). Los círculos marcan los agujeros debidos a pinchazos. (documento privado)
CONCLUSIONES Chumakov. r (2007). Organización

Funcional del Núcleo Vegetal.
La transformación in planta por pinchazo Libro de Springer de monografía de células
vegetales: 166168
y método de recubrimiento y corte de punta de semilla y
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método de imbibición en semillas de cítricos podría
método simplificado para la transformación
integrar genes en el genoma de la planta y mediada por Agrobacterium de Arabdopsis
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las naranjas son semillas son rekasiltran no eran Dai, S., P. Zheng, P. Marmey, S. Zhang, W.
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genético ingeniería o genético y Matrimonio, 2011).

polietileno glicol (CLAVIJA), y La transformación generalmente implica la

temperatura de 24 durante 24 horas, luego La transformación in planta en este

primer (5' luego se insertaron en pocillos de gel de agarosa

Semillas ∑ Semillas ∑Transformativo (%) Eficiencia

Tratamiento tratado germinado plantas putativas de Planta

semillas de naranja en la presente investigación fue Ross (1992), alta concentración A.

Además, el aumentar en el el contenido de grasa. Los hongos atacan las semillas durante

indicadores bioquimicos (gordo, proteína, mitocondrias Así que los genes que a través de

CONCLUSIONES Chumakov. r (2007). Organización

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polietileno glicol (CLAVIJA), y La transformación generalmente implica la

temperatura de 24 durante 24 horas, luego La transformación in planta en este

primer (5'­ luego se insertaron en pocillos de gel de agarosa

Semillas ∑ Semillas ∑Transformativo (%) Eficiencia

Tratamiento tratado germinado plantas putativas de Planta

semillas de naranja en la presente investigación fue Ross (1992), alta concentración A.

Además, el aumentar en el el contenido de grasa. Los hongos atacan las semillas durante

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