Traducido del inglés al español - www.onlinedoctranslator.

com

Recubrimiento de la resistencia mediada por proteínas contra CMV 249

Revestimiento de resistencia mediada por proteínas contra un aislado indio de la

Virus del mosaico del pepino subgrupo IB en Nicotiana benthamiana

COMORIVASTAVA y SKRAJ *
Laboratorio de Virología Molecular, Instituto Nacional de Investigación Botánica, Lucknow 226001, India

* Autor para correspondencia (Fax, + 91-522-2205836; Correo electrónico, skraj2@rediffmail.com )

Resistencia mediada por la proteína de la cubierta (CP) contra un aislado indio de la Virus del mosaico del pepino (CMV) subgrupo IB se
demostró en líneas transgénicas de Nicotiana benthamiana mediante Agrobacterium tumefaciens-transformación mediada. De las catorce
líneas transformadas independientemente desarrolladas, se probaron dos líneas para determinar la resistencia contra CMV mediante
inoculaciones de desafío. Las líneas transgénicas que exhiben resistencia completa permanecieron asintomáticas durante toda la vida y
mostraron una acumulación de virus reducida o nula en sus hojas sistémicas después de la exposición al virus. Estas líneas también
mostraron resistencia al virus contra dos cepas de CMV estrechamente relacionadas. Este es el primer informe de resistencia transgénica
mediada por CP contra un miembro del subgrupo IB de CMV aislado de la India.

[Srivastava A y Raj SK 2008 Revestimiento de resistencia mediada por proteínas contra un aislado indio de Virus del mosaico del pepino subgrupo IB en Nicotiana
benthamiana; J. Biosci.33 249-257]

1. Introducción Palukaitis y García-Arenal 2003). También parecen ser

Virus del mosaico del pepino (CMV), la especie tipo del género
Cucumovirus de la familia Bromoviridae, es un importante
patógeno vegetal en todo el mundo, que infecta muchos cultivos y
provoca pérdidas de rendimiento. Las partículas son viriones
poliédricos que encapsidan tres ARN genómicos lineales, más
sentido y monocatenario. El genoma del CMV codifica cinco
proteínas que se distribuyen en tres ARN genómicos (ARN1, 2 y 3).
La proteína de la cubierta (CP) del CMV está codificada por el ARN 3
pero se expresa a partir del ARN subgenómico 4 (Palukaitis y García-
Arenal 2003). El CP es necesario para el rango de host,
encapsidación (Suzukiet al 1991), movimiento de virus sistémico
(Canto et al 1997) y transmisión de pulgones (Ng
et al 2000).
Cuozzo et al (1988) primera demostración de ingeniería
resistencia contra CMV utilizando el gen CP. Desde entonces, se han
descrito muchos ejemplos de resistencia mediada por CP en
diversos grados, con diferentes construcciones en diferentes
hospedadores (Beachyet al 1990; Fitchen y Beachyet al 1993;
responsables de la protección diferentes mecanismos, según el
grupo de virus o el transgén viral estudiado (Loesh-Frieset al
1987; Lomonossoff 1995). La resistencia podría estar mediada
por la proteína codificada por el transgén (mediada por
proteínas) o por la transcripción producida a partir del transgén
(mediada por ARN), también conocido como silenciamiento
génico postranscripcional (PTGS), o ambos (Varmaet al 2002).
En este informe, demostramos resistencia a virus en
transgénicos. N. benthamiana plantas modelo que expresan el
gen CP de CMV aislado de Amaranto (CMV-A) en India y
caracterizado como miembro del subgrupo IB (Srivastava et al
2004). Aunque hay varios informes de diferentes partes del
mundo que demuestran resistencia transgénica utilizando el
gen CP del subgrupo IA o II del CMV, todavía se espera un
informe de una cepa del subgrupo IB (Palukaitis y García-Arenal
2003). La prevalencia de la infección por CMV IB se ha
observado en varias especies de cultivos en la India, como el
banano (Srivastavaet al 1995), tomate (GenBank Acc. EF710773),
pimienta negra (Bhat et al 2004), Amaranthus

Palabras clave. Cepas estrechamente relacionadas; proteína de capa;Virus del mosaico del pepino; líneas transgénicas; resistencia a virus

Abreviaturas utilizadas: CMV, Virus del mosaico del pepino; CP, proteína de la cubierta; DAS-ELISA, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima-sándwich de doble
anticuerpo; dpi, días posteriores a la inoculación; SDS-PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida y dodecilsulfato de sodio

http://www.ias.ac.in/jbiosci J. Biosci. 33 (2), junio de 2008, 249–257, © Indio AJCaliforniaBDelawareiometroCarolina del SuryI.o3f3S (c2i) e, nJCtuminortese 2020489
250 A Srivastava y SK Raj
(Srivastava et al 2004), hanbane (Samad et al 2004) y vainilla
(Madhubala et al 2005). Por tanto, el desarrollo de plantas
transgénicas resistentes a CMV IB parece esencial. Este es el
primer informe de la India que demuestra resistencia
transgénica contra un miembro del subgrupo IB de CMV enN.
benthamiana plantas experimentales.
2. Materiales y métodos
2.1 Construir preparación y transformación
de N. benthamiana
El gen CP de 657 pb de CMV-A se introdujo entre el promotor
CaMV 35S y el terminador NOS del vector binario (pRoK2), que
también tiene la NPTII gen marcador de la resistencia a la
kanamicina. La construcción (pACPR2) se movilizó en
Agrobacterium tumefaciens LBA4404 mediante apareamiento
triparental utilizando un plásmido auxiliar pRK2013. Se eligió
un conjugante positivo (pACPR2.5) para la transformación deN.
benthamiana discos de hojas siguiendo un procedimiento
basado en Horsch et al (1985) y McCormick (1991).
Los discos de hojas transformados se regeneraron en medio
selectivo Murashige-Skoog (MS) que contenía vitaminas Gamborg B5,
antibióticos (500 mg / l de cefotaxima y 100 mg / l de kanamicina) y
hormonas (1 mg / l de zeatina y 0,1 mg / l de ácido indol acético. [IAA])
en una cámara de crecimiento. Los brotes que se regeneraron a partir
de los explantes se transfirieron posteriormente a medio MS que
contenía 0,1 mg / l de zeatina e IAA para el alargamiento de los brotes y,
finalmente, a un medio que contenía antibióticos, ácido indol butírico
[IBA] 0,05 mg / l pero sin citoquinina para la formación de raíces. Las
supuestas plantas transgénicas se plantaron finalmente en macetas y se
cultivaron más en un invernadero.
2.2 PCR, análisis de transferencia Southern y Northern para
transgén en plantas T0
El ADN genómico total se extrajo de 1 g de tejido foliar
de N. benthamiana como lo describe Dellaporta et al
(1983). Para verificar la presencia del gen en las plantas T0, se llevó
a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando el
ADN total aislado de cada planta y los cebadores específicos de CP
de CMV-A (Srivastavaet al 2004). Los productos de la PCR se
sometieron a electroforesis con ADN estándar en gel de agarosa al
1%. La integración y el número de copias de las construcciones en
las plantas T0 se confirmaron mediante transferencia Southern del
ADN genómico de la planta (15µg) digerido con HindIII. Las
bandas / ADN transferidas se hibridaron con una sonda preparada
a partir de secuencias de ~ 350 pb ubicadas en el extremo 3΄ del
gen CMV CP para poder determinar el número exacto de copias.
Para determinar la transcripción del gen CP introducido
en el N. benthamiana plantas, se extrajo el ARN total
J. Biosci. 33 (2), junio de 2008
a partir de 1 g de tejido foliar de plantas transgénicas seleccionadas
siguiendo el método de MacDonald et al (1987). Se analizó el ARN
para determinar la presencia del transcrito del transgén usando
una sonda de ADN para el gen CMV CP. El ADN o ARN a transferir se
sometió a electroforesis en geles de agarosa al 1% de acuerdo con
los procedimientos estándar descritos (Sambrook
et al 1989) y se transfirió a una membrana de nailon. Las sondas
utilizadas para la hibridación se prepararon de acuerdo con el método
de etiquetado de cebadores aleatorios (Fienberg y Vogelstein
1983). La prehibridación y la hibridación se llevaron a cabo a 42ºC
con formamida al 50% y las transferencias se lavaron según las
instrucciones de los fabricantes.
También se realizó la hibridación Northern de las hojas inoculadas y
sistémicas de plantas de progenie seleccionadas para determinar el nivel
de ARN acumulado en ellas después de la infección por virus. Para ello,
la sonda utilizada para hibridar con el ARN total se preparó a partir de
secuencias de ~ 250 pb conservadas en el extremo 3΄ de las cuatro
especies de ARN de CMV.
2.3 Inmunoensayo de transferencia Western y ELISA para
análisis de proteínas
Para determinar los niveles de proteína en plantas transgénicas, se
realizó SDSPAGE usando gel de poliacrilamida al 12% para resolver
las proteínas totales. Las transferencias de Western se realizaron
transfiriendo la proteína a una membrana de nitrocelulosa en un
aparato de minitransblot (Bio-Rad). La expresión del gen en plantas
a nivel de proteína se determinó usando antisuero para CMV (PVAS
242a, ATCC, EE. UU.). Aproximadamente, 20
µSe cargó cada vez g de proteína soluble total de cada
muestra y se determinó la acumulación de PC en hojas
no inoculadas, inoculadas y superiores.
Simultáneamente, se realizó un ELISA-sándwich de doble
anticuerpo (DASELISA) para determinar el nivel relativo de
acumulación de CP en líneas de progenie transgénica en sus
hojas inoculadas o superiores frente a la planta enferma de
control (no transformada). Se utilizó antisuero específico para
CMV (anticuerpo primario) a una dilución de 1: 500 y conjugado
de fosfatos alcalinos (anticuerpo secundario) a 1: 1000.
2.4 Desafiar las inoculaciones de plantas transgénicas
para resistencia a virus
Las plantas transgénicas en la etapa de 4-6 hojas se desafiaron con
inóculo 1:10 (extracto crudo) preparado a partir de hojas de tabaco
infectadas con CMV maceradas en tampón de fosfato de sodio 0,1 M, pH
7,0, que contenía sulfito de sodio al 1% (1 ml de tampón / 100 mg de
tejido ). Las plantas inoculadas se observaron diariamente durante 15 a
20 días para detectar el desarrollo de síntomas y se compararon con el
control (desafiado sin transformar). Las plantas que no desarrollaron
ningún síntoma se revisaron mediante pruebas de inoculación inversa
para detectar una infección latente, si la hubiera.
 Recubrimiento de la resistencia mediada por proteínas contra CMV 251

3. Resultados reveló la presencia de un gen CMVCP de ~ 650 pb (datos no

3.1 Construcción quimérica y regeneración de
plantas transgénicas
La construcción preparada (pACPR2) contenía el gen CMV-A CP
(GenBank Acc. AF198622) ubicado entre los bordes del ADN-T
del plásmido binario pROK2 (figura 1). Digestión de restricción
del constructo enE. coli (pACPR2) utilizado para el apareamiento
triparental y posteriormente Agrobacterium
conjugante (pACPR2.5) con enzimas de restricción apropiadas
mostrados).
Transformación de N. benthamiana resultó en la iniciación directa de
brotes de un gran número de explantes de hojas (alrededor del 60%)
después de 4 semanas. De los 68 brotes supuestamente transformados
obtenidos, 33 brotes independientes de 14 líneas designadas como
líneas A – N, que representaban al menos un evento de transformación
cada una, se establecieron finalmente en el invernadero. Las supuestas
plantas transformadas aclimatadas crecieron hasta la madurez y
produjeron flores normales. Sin embargo, en varias plantas, se observó
poca o ninguna formación de semillas, probablemente debido a la
interferencia del transgén.

3.2 Análisis de plantas transgénicas T0

El análisis de PCR de transformantes primarios (T0) utilizando

Figura 1. Representación esquemática de un constructo que
muestra el Virus del mosaico del pepino (CMV) -Un gen de la
proteína de la cubierta (CP) (GenBank Acc. AF198622) entre el
promotor CaMV 35S y el terminador NOS de pROK2 vector binario.
cebadores específicos de CMV CP reveló la presencia del gen CP en
~ 84% de las plantas (10/12), mientras que el no transformado
N. benthamiana se calificó como PCR negativa (figura 2).
Hibridación Southern del ADN genómico sometido a
electroforesis (~ 10µg) extraído de cinco plantas transformadas
seleccionadas al azar cuando se digiere con Posterior III y se
dejó hibridar con una sonda preparada a partir de un
fragmento de ~ 350 pb del extremo 3΄ del CMV-A clonado CP
mostró señales positivas, lo que indica la incorporación del gen
CMV CP en el genoma de las líneas seleccionadas (L1, A2, M1, J3
y K2) (figura 3).
El análisis de transferencia Northern utilizando una sonda CMV-ACP
detectó una única banda de ARNm de ~ 1.0 kb en las líneas
transformadas A2, J3 y M1 (figura 4) pero no en las no transformadas.
N. benthamiana tomado como control negativo. Los niveles de

Figura 2. Análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de líneas transgénicas de generación T0 utilizando Virus del mosaico del pepino (CMV): cebadores
específicos de proteína de cubierta (CP) que muestran un amplicón del tamaño esperado (~ 650 pb) en las líneas A2, B1, C2, E1, G3, H2, I2, J3, K2 y L1, pero no en
las líneas D1 y F2 . Los carriles Ut, Mr y Cl son: sanos sin transformar (control negativo),λ ADN EcoRHODE ISLAND-Hinmarcador de doble digestión dIII (Genei,
India) y clon pACP7 (control positivo), respectivamente.

J. Biosci. 33 (2), junio de 2008

252 A Srivastava y SK Raj
Figura 3. Prueba de hibridación Southern de las líneas T0 con una sonda
de fragmento de ~ 350 pb correspondiente al extremo 3 'del Virus del
mosaico del pepino (CMV) proteína de la cubierta (CP) que muestra la
integración del gen CMV CP. Carriles L1, A2, M1, J3 y K2: líneas
transgénicas seleccionadas y C: representación esquemática de la
posición del gen CMV CP sondado usado como control positivo.
Figura 4. Hibridación Northern blot del Virus del mosaico del pepino (CMV)
transcripciones del gen de la proteína de la cubierta (CP) en algunas de las
plantas transgénicas probadas con un [P32] -Gen CMVCP marcado con dCTP.
Carril 1: inoculado sin transformar con CMV-A (control positivo); Carril 2: sano
sin transformar (control negativo); J3, M1, A2 son líneas transgénicas que
muestran transcripciones del tamaño esperado.
El ARNm de CP no difirió significativamente entre las diversas
plantas transgénicas.
El inmunoensayo de transferencia Western con antisuero para CMV
(PVAS 242a, ATCC, EE. UU.) Detectó una proteína de 24 kDa en todas las
plantas transformadas analizadas (figura 5), lo que confirma la en vivo
traducción del ARNm de CP en las hojas de plantas T0.
J. Biosci. 33 (2), junio de 2008
Figura 5. Inmunoensayo de transferencia Western de líneas transgénicas
seleccionadas que expresan el Virus del mosaico del pepino (CMV) proteína de la
cubierta (CP). Los carriles L1, A2, M1, J2, K2 son líneas transgénicas que muestran la
presencia de una proteína de 24 kDa en comparación con el virus purificado V: CMV.
3.3 Evaluación de la resistencia a virus en líneas transgénicas T1
Para analizar el grado de resistencia contra la infección por CMV, se
seleccionaron para el cribado las líneas J3 y M1 (de dos eventos
independientes), que mostraron un número de copia de CP en su
genoma y puntuaron el establecimiento de semillas máximo en la
generación T0. La progenie de plántulas T0 de ambas líneas se
autofertilizó y ~ 50 semillas de cada línea se germinaron
asépticamente en medio MS que contenía kanamicina (100 mg / l)
para analizar el porcentaje de supervivencia de las plantas. Los
resultados indicaron que la progenie de ambas líneas se segregó
con una proporción de ~ 3: 1, lo que sugiere que cada una portaba
un gen de copia única.
En la generación T1, 32 y 29 plantas de las líneas J3 y M1,
respectivamente, que sobrevivieron con kanamicina, fueron desafiadas
por resistencia a la infección por CMV. La inoculación de desafío de
progenies de 7 a 8 semanas de edad a una concentración de 1:10
mostró clorosis en 2 a 4 días en las hojas inoculadas de casi todas las
plantas de control no transformadas y síntomas de mosaico. Las líneas
transgénicas de las líneas J3 y M1, que expresaron la CP, no mostraron
ningún síntoma en la hoja inoculada en la primera semana después de
la inoculación. En términos generales, el desarrollo de la respuesta en
ambas líneas podría clasificarse en tres: completamente susceptible,
completamente resistente e intermedio. Las plantas que mostraron
respuestas intermedias fueron aquellas que consistieron en plantas
sintomáticas y asintomáticas en proporciones variables (tabla 1). Como
es evidente, entre el 17% y el 22% de las plantas de ambas líneas
mostraron resistencia total, mientras que el 25-27% de las plantas
resultaron ser completamente susceptibles después de dos semanas de
inoculación. Se observaron respuestas intermedias en el 55-56% de las
plantas, que desarrollaron síntomas de mosaico muy leves en una etapa
posterior o acumularon niveles más altos de CMV en ELISA pero
permanecieron asintomáticos.
Una progenie de la línea J3 (J3-2) y tres de la línea M1 (M1-4,
M1-7 y M1-21), que mostraron resistencia total a la infección por
CMV sobre la base del examen a simple vista (sin síntomas en los
inoculados hoja), se evaluó la acumulación de virus a través de
inmunoensayos de transferencia Western utilizando la proteína de
la hoja superior, inoculada y sin inocular de cada línea de plantas,
recolectada en diferentes intervalos de tiempo. La hoja superior
solo de tres líneas de progenie: M1-13, M1-16 y M1-23
- que mostró síntomas cloróticos en su hoja inoculada
 Recubrimiento de la resistencia mediada por proteínas contra CMV 253

Tabla 1. Porcentaje de progenies J3 y M1 (generación T1) que muestran resistencia o susceptibilidad a Virus del mosaico del pepino (CMV) A
infección a los 25 días después de la inoculación

Respuesta de las plantas a la infección por CMV * Línea transgénica

Línea J3 Línea M1

% Resistencia / % Resistencia /
No. de plantas susceptibilidad No. de plantas susceptibilidad

Totalmente resistente 5/29 17.24 7/32 21.80

Totalmente susceptible 29/8 27,50 8/32 25.00
Respuesta intermedia # 16/29 55,17 18/32 56.25
* Los síntomas producidos en todas las plantas transgénicas se retrasaron entre 10 y 15 ppp, incluso en plantas que mostraban una susceptibilidad completa en
comparación con el control no transformado, donde apareció un mosaico transparente de 7 a 8 ppp cuando se inocularon a una dilución de 1:10, y dentro de 3 a 5 días a una
concentración aún mayor de 1: 5 o 1: 1.
#
Las plantas que mostraron una respuesta intermedia fueron aquellas que desarrollaron síntomas de mosaico de leves a moderados en etapas posteriores a lo largo de su
ciclo de vida o aquellas plantas que acumularon altos niveles de CMV pero permanecieron asintomáticas.

~ 2-3 veces menor en comparación con los enfermos (carril 1 en la

Figura 6. Inmunoensayo de transferencia Western de las líneas de
progenie T0: J3 (A) y M1 (B y C) de hojas no inoculadas, inoculadas y
sistémicas que muestran el nivel de acumulación de virus.
(A) Carril 1: sano inoculado (control positivo); Carril 2: sano sin
inocular (control negativo); Carril 3: hoja sin inocular de J3-2; Carril
4: hoja inoculada de J3-2 a 7 dpi; y Carril 5: hoja superior de J3-2 a 21
dpi. (B) Carril 1: inoculado sin transformar (control positivo); Carril 2:
sano sin inocular (control negativo); Carriles 3-5: hoja sin inocular
de M1-4, M1-7 y M1-21; y Carriles 6–8: hoja inoculada de las mismas
líneas a 7 dpi. (C) Acumulación de virus en la hoja superior a 21 dpi:
Carril 1: inoculado sin transformar (control positivo); Carriles 2–4:
igual que en (B) de M1-
4, M1-7 y M1-21; y carriles 5-7: M1-13, M1-16 y M1-23.
(pero sin síntomas sistémicos) también se evaluaron. Los resultados
revelaron que aunque hubo un aumento en los niveles de
acumulación de virus en las hojas inoculadas de las plantas (figura
6A, carril 4 y figura 6B, carriles 6-8), las hojas sistémicas mostraron
niveles significativamente más bajos de acumulación de virus
(figura 6A , carril 5 y figura 6C, carriles 2-4). Se encontró que el nivel
de acumulación de virus en las hojas superiores era
figura 6A, B y C). Las progenies de M1 cuyas hojas sistémicas
superiores solo fueron evaluadas, mostraron una mayor
acumulación de virus (en comparación con las líneas que mostraron
niveles significativamente más bajos) pero la acumulación de virus
en ellas fue aún menor que en el control susceptible (figura 6C,
carriles 5-7). De estos, M1-13 produjo un mosaico sistémico
después de un largo período de incubación, pero M1-16 y M1-23
permanecieron asintomáticos.
El DAS-ELISA de las hojas superiores a los 30 días después de la
inoculación (dpi) (figura 7) se correlacionó bien con los resultados
del análisis de transferencia de Western. Se encontró que la
acumulación de virus en las líneas era ~ 2,5 veces (J3-2 y J3-3) y ~ 3,0
veces (M1-4, M1-7 y M1-21) menor que en el control. M1-
16, que mostró una acumulación comparativamente mayor en el análisis
occidental, mostró aproximadamente la mitad de la cantidad de
acumulación de virus detectada en el control. Las pruebas de
retroinoculación de las líneas resistentes J3-2 y M1-7 no produjeron
síntomas incluso después de dos meses de inoculación.
La línea más resistente, J3-2, que también produjo más semillas
que la línea M1-7, fue seleccionada para una evaluación adicional
de la resistencia en sus generaciones T2 y T3. Se inocularon
mecánicamente diez plantas cultivadas asépticamente y resistentes
a la kanamicina de semillas autofertilizadas obtenidas de T1 de J3-2
a una dilución 1:10 p / v de tejido foliar infectado y se observó el
desarrollo de síntomas. De las 10 plantas inoculadas, una murió
durante el establecimiento y de las 9 plantas restantes, solo una
(J3-2-1) produjo síntomas visibles después de 14 dpi, mientras que
el resto permaneció asintomático durante todo su ciclo de vida,
creció hasta la madurez y formó semillas. El DAS-ELISA realizado en
la hoja superior en todas las plantas (figura 8) mostró una
reducción de la acumulación de virus en comparación con el
control, con la mayor reducción observada (~ 3 veces menor que el
control enfermo) en las líneas J3-2-2 y J3-2-6. El hecho de no
producir síntomas a través de las pruebas de retroinoculación
confirmó además que estas líneas transgénicas eran altamente
resistentes.

J. Biosci. 33 (2), junio de 2008

254 A Srivastava y SK Raj

Figura 7. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima-sándwich de doble

Figura 9. Hibridación Northern blot de la generación T2 N.
anticuerpo (DAS-ELISA) de hojas superiores de la generación T1 de
benthamiana Líneas J3-2 (J3-2-2 y J3-2-6) que muestran acumulación
N. benthamiana Líneas J3 (J3-2 y J3-3, barras abiertas) y M1 (M1-4, M1-7, M1-21
de Virus del mosaico del pepino (CMV) ARN en el (A) inoculado y
y M1-16, barras cerradas) que muestran niveles de acumulación de virus a 30
(B) hojas superiores. La mancha se hibridó con unα-PAG32 sonda marcada
dpi. Las plantas fueron desafiadas con inóculo diluido diez veces preparado a
preparada a partir de secuencias conservadas en el extremo 3 'de las cuatro
partir de hojas de tabaco infectadas conVirus del mosaico del pepino (CMV) -A.
especies de ARN de CMV. Carril 1: inoculado sin transformar; Carril 2: control
Las líneas de barra de cada histograma indican el error estándar.
saludable; Carriles 3 y 6: línea de planta J3-2-2; Carriles 4 y 7: línea de plantas
J3-2-6 y carril 5: hoja inoculada de la línea J3-2-7.

Figura 10. Hibridación por transferencia Northern de la generación T3 N.

Figura 8. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima-sándwich de doble
benthamiana Líneas J3-2-2 y J3-2-6 (J3-2-2-2 y J3-2-6-4) que muestran
anticuerpo (DAS-ELISA) de la hoja superior de la generación T2 de la línea
acumulación de Virus del mosaico del pepino (CMV) ARN en las hojas
transgénica J3-2 que muestra diferentes niveles de acumulación de virus a 30
inoculadas y superiores. Carril 1: inoculado sin transformar; Carriles 2 y
dpi. Las plantas fueron desafiadas con inóculo diluido diez veces preparado a
4: acumulación de ARN en las hojas inoculadas y superiores de la línea
partir de hojas de tabaco infectadas conVirus del mosaico del pepino (CMV) -A.
J3-2-2-2, respectivamente; Carriles 3 y 5: acumulación de ARN en las
Las líneas de barra de cada histograma indican el error estándar.
hojas inoculadas y superiores de la línea J3-2-6-4, respectivamente.

El análisis de transferencia Northern de las hojas inoculadas y

de niveles más altos de ARN de CMV 3 y 4, respectivamente, que los
sistémicas a 8 dpi para determinar la acumulación de CMVRNAs
ARN 1 y 2 en las líneas de plantas inoculadas y superiores de las
reveló que el mRNA podría detectarse en ambas líneas (J3-2-2 y
plantas resistentes a 25 dpi (figura 10). Por el contrario, el control
J3-2-6) en sus hojas inoculadas (figura 9A) . Sin embargo, el nivel de
no transformado mostró una mayor acumulación de las cuatro
acumulación de transcripciones en sus hojas superiores (figura 9B)
especies de ARN de CMV.
fue de nuevo mucho más bajo (~ 2 a 2,5 veces más bajo que el de
los enfermos) y se correlacionó con los resultados de ELISA. A pesar
de las diferencias en los niveles de acumulación de virus, no se 3.4 Resistencia a cepas estrechamente relacionadas
pudieron identificar diferencias fenotípicas entre las dos líneas. En
la generación T3, una observación notable, además de la reducción También se evaluó la resistencia frente a cepas estrechamente relacionadas
de la acumulación de ARN viral, fue la detección CMV-Da y CMV-H (que poseen una identidad de secuencia del 98% con

J. Biosci. 33 (2), junio de 2008

 Recubrimiento de la resistencia mediada por proteínas contra CMV
Figura 11. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima-sándwich de
doble anticuerpo (DAS-ELISA) de hojas inoculadas (barras abiertas) y
superiores (barras cerradas) de generación T3 N. benthamiana Líneas
J3-2-2 que muestran niveles de acumulación de virus a 25 dpi. Se
inocularon tres plantas cada una conVirus del mosaico del pepino (CMV)
-D (D-1 a D-3) o CMV-H (H-1 a H-3). Las líneas de barra de cada
histograma indican el error estándar.
CMV-A) del subgrupo IB (Srivastava y Raj 2004). Las pruebas se
realizaron tomando tres plantas de la línea de progenie J3-2-2
para cada cepa de virus. Estas plantas fueron designadas como
D-1 a D-3 y H-1 a H-3, dependiendo de la cepa de virus con la
que fueron inoculadas. Los resultados indicaron que el 66% de
las plantas en cada caso fueron capaces de protegerse de la
infección por las cepas CMV-D y CMV-H incluso después de un
mes después de la inoculación (figura 11). Sin embargo, no
hubo mucha diferencia en los niveles de acumulación de virus
entre las hojas inoculadas o superiores, excepto en dos plantas
(D-2 y H-3), donde la diferencia fue comparativamente mayor.
4. Discusión
Se ha demostrado que los genes CP son eficaces para prevenir la
infección o reducir la enfermedad causada por virus homólogos y
estrechamente relacionados (Gonsalves y Slightom 1993). Se ha
observado resistencia tanto contra las partículas de virus
infectantes como contra el ARN viral. En este estudio, la resistencia
mostrada por las plantas transgénicas al CMV indicó que estaba
mediada por proteínas en lugar de mediada por ARN porque la CP
se detectó en niveles bajos mediante ELISA en las hojas superiores
de las plantas transgénicas después de inoculaciones de desafío.
El T0 transformado N. benthamiana las plantas analizadas por
PCR, los análisis del sur, norte y oeste confirmaron que el CMV CP
se había integrado con éxito en el genoma de la planta y estaba
funcionando como se esperaba. Sin embargo, la incorporación del
gen CP en varias líneas transgénicas según lo determinado por el
análisis de Southern no mostró ningún aparente
255
correlación con los niveles de acumulación de ARN. La evaluación
de la resistencia en diferentes líneas de plantas a la infección por
CMV en la generación T1 según lo determinado por los niveles de
acumulación de virus en diferentes momentos (dpi) y de diferentes
ubicaciones de la hoja (hoja inoculada y / o hoja superior) indicó
que varió desde una resistencia casi completa. a ninguno.
Principalmente, todas las plantas transgénicas resistentes (> 50%)
exhibieron un retraso en el desarrollo de síntomas como se informó
en varios estudios (Nakajimaet al 1993; Gielenet al 1996), aunque
también se obtuvieron algunas plantas fuertemente resistentes en
las que no se desarrollaron síntomas ni siquiera a los 30 dpi.
Los niveles de acumulación de virus significativamente
reducidos en las hojas sistémicas de las plantas T1 en comparación
con las hojas inoculadas fueron respaldados por los bajos niveles
de virus detectados en las hojas superiores por ELISA a 30 dpi.
Okunoet al (1993) también reportaron una mayor acumulación de
virus en las hojas inoculadas de plantas transgénicas que expresan
el gen CP que en las hojas superiores. También mostraron
resistencia las plantas que permanecieron asintomáticas durante
todo su ciclo de vida, aunque acumularon virus en niveles altos en
sus hojas superiores (pero menos que el control).
Como se observó en las progenies T1, la hibridación Northern y / o
ELISA de las progenies de generación T2 y T3 de la línea J32 también
mostraron niveles de acumulación de virus muy reducidos en las hojas
superiores o un retraso en el desarrollo de la enfermedad. Powell-Abel
ha registrado anteriormente observaciones similares.et al (1986). Los
niveles más altos de CP en las plantas transgénicas inoculadas
presumiblemente han afectado el desprendimiento de la partícula del
virus en etapas posteriores. De acuerdo con Reimann-Philipp (1998), se
observa con frecuencia una tasa reducida de acumulación de virus en
hojas inoculadas y una propagación sistémica más lenta en plantas
transgénicas que acumulan PC debido a tasas de replicación más lentas
o interferencia con el transporte de virus local o sistémico. La mayor
acumulación de CMV en las hojas inoculadas, pero sin diseminación
sistémica, puede deberse a la interferencia con la entrada al floema o
con el transporte vascular a larga distancia, como sugirieron
anteriormente Taliansky y García-Arenal (1995).
Las limitadas pruebas realizadas demostraron que se podía lograr
resistencia no solo contra la infección homóloga (CMV-A) sino también
contra las cepas relacionadas de CMV (CMVD y CMV-H) del mismo
subgrupo 1B. Sin embargo, ELISA mostró una mayor acumulación de
virus en las hojas superiores en comparación con las hojas inoculadas en
todas las plantas. Aunque los niveles de acumulación de virus en todas
las plantas analizadas fueron comparables con el control no
transformado, no se observaron síntomas sistémicos incluso a 45 dpi.
Xueet al (1994) también observaron hallazgos similares en líneas de
tomates transgénicos que contienen el gen CP de la cepa CMV-WL, un
miembro del subgrupo II. Se encontró que las plantas R0 que
acumularon niveles detectables de CMV-WL CP eran resistentes a otra
cepa de CMV-China (un miembro del subgrupo I). La progenie de las
plantas R0 probadas para determinar su resistencia a la infección por
CMV-WL y CMV-China mostró un alto nivel de resistencia a la infección
sistémica tanto por las cepas como por
J. Biosci. 33 (2), junio de 2008
256 A Srivastava y SK Raj
no se pudo recuperar el virus de plantas inoculadas
asintomáticas.
El objetivo principal de este estudio fue determinar si la
estrategia de resistencia mediada por CP (MR) podría aplicarse para
cultivar plantas transgénicas resistentes utilizando el gen CP de la
cepa de CMV aislada de la India. Evaluación del transgénico
N. benthamiana La línea J3 hasta tres generaciones mostró que se
podía lograr resistencia tanto contra el homólogo como contra
otras dos cepas de CMV estrechamente relacionadas. La novedad
del trabajo es que el CP de un aislado del subgrupo IB de CMV se ha
utilizado para generar plantas transgénicas por primera vez en
India para demostrar resistencia en estas plantas contra cepas de
CMV homólogas y afines del subgrupo IB. Por lo tanto, la estrategia
puede aplicarse a cultivos de importancia comercial como el
tomate, el chile y la berenjena en los que el CMV provoca una
reducción drástica del rendimiento y la calidad (Tomlinson 1987).
Agradecimientos
Los autores agradecen al Director del Instituto Nacional de
Investigación Botánica de Lucknow por proporcionar las
instalaciones y al Consejo de Investigación Científica e Industrial de
Nueva Delhi por una beca para AS. También agradecemos al
profesor HN Verma, ex director del Departamento de Botánica de la
Universidad de Lucknow, por sus valiosos conocimientos sobre el
trabajo realizado.
Referencias
Beachy RN, Loesch-Fries S y Tumer NE 1990 Proteína de la capa
resistencia mediada contra la infección por virus; Annu. Rev.
Phytopathol.28 451–74
Bhat AI, Faisal TH, Madhubala R, Hareesh PS y Pant RP
2004 Purificación, producción de antisuero y desarrollo de un diagnóstico
basado en ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas para
Virus cucumbermosaico infectingblackpepperPiper nigrumL.);
J. Especias Cultivos aromáticos 13 16-21
Canto T, Prior DAM, Hellwald KH, Oparka-Kaper J y
Palukaitis P 1997 Caracterización de Virus del mosaico del pepino.
IV. La proteína de movimiento y la proteína de la cubierta son esenciales para el
movimiento de célula a célula del virus del mosaico del pepino;Virología 237
237–248
Cuozzo M, O'Conell KM, Kaniewski W, Fang R, Chua N y
Tumer NE 1988 Protección viral en plantas de tabaco transgénicas que
expresan la proteína de la cubierta del virus del mosaico del pepino o su
ARN antisentido; Biotecnología 6 549–557
Dellaporta SL, Wood J y Hicks JB 1983 ADN vegetal
minipreparación: versión II; Planta. Mol. Biol. Reps.1 19-21
Fienberg AP y Vogelstein B 1983 Una técnica de radiomarcaje
Fragmentos de endonucleasas de restricción de ADN hasta una actividad
específica alta; Ana. Biochem.132 6
Fitchen J y Beachy RN 1993 Protección de ingeniería genética
contra virus en plantas transgénicas; Annu. Rev. Microbiol.47
739–763
J. Biosci. 33 (2), junio de 2008
Gielen J, Ultzen T, Bontems S, Loots W, van Schepen A,
Westerbock A, de Haan P y van Grinsven M 1996 Protección mediada
por proteínas de la capa de Virus del mosaico del pepino infección en
tomate cultivado; Euphytica 88 139-149
Gonsalves D y Slightom JL 1993 Revestimiento mediado por proteínas
protección: análisis de plantas transgénicas para determinar su resistencia en
una variedad de cultivos; Semin. Virol.4 397–406
Horsch RB, Fry JE, Hoffmann NL, Eichholtz D, Rogers SG y
Frailey RT 1985 Un método simple y general para transferir
genes a plantas; Ciencias 227 1229-1231
Loesch-Fries LS, Merlo D, Zinnen T, Burhop L, Hill K, Krahn K,
Jarvis N, Nelson S y Halk E 1987 La expresión del virus del mosaico de la
alfalfa RNA4 en plantas transgénicas confiere resistencia al virus; EMBO
J. 6 1845-1851
Lomonossoff GP 1995 Resistencia a las plantas derivada de patógenos
virus; Annu. Rev. Phytopathol.33 323–343
Madhubala R, Bhadramurthy V, Bhat AI, Hareesh PS, Retheesh
ST y Bhai RS 2005 Aparición de Virus del mosaico del pepino
en vainillaVainilla planifolia Andrews) en India; J. Biosci. 30
339-350
McCormick S 1991 Transformación de tomate con Agrobacterium
tumefaciens; Cultivo de tejidos vegetales. Manual6 1-9
McDonald NA, Swift AE, Przybyla AE y Chargwin JM 1987
Aislamiento de ARN utilizando sales de guanidinio; Métodos Enzymol.
152 219-227
Nakajima M, Hayakawa T, Nakamura I y Suzuki M 1993
Protección contra las cepas O y Y del virus del mosaico del pepino (CMV) y
el virus del crisantemo en las plantas de tabaco transgénicas que expresan
la proteína de la cubierta del CMV-O; J. Gen. Virol. 74 319–322
Ng JCK, Liu S y Perry KL 2000 Virus del mosaico del pepino
mutantes con propiedades físicas alteradas y con defectos en la
transmisión del vector del pulgón; Virología 276 395–403
Okuno T, Nakayama M, Yoshida S, Furusawa I y Komiya T
1993 Susceptibilidad comparativa de plantas de tabaco transgénicas y
protoplastos que expresan el gen de la proteína de la cubierta del virus del
mosaico del pepino a la infección con viriones y ARN; Fitopatología
83 542–547
Palukaitis P y García-Arenal F 2003 Cucumovirus; Adv. Virus
Res. 62 241–323
Powell-Abel P, Nelson RS, De B, Hoffmann N, Rogers SG,
Fraley, RT y Beachy RN 1986 Retraso del desarrollo de la enfermedad en plantas
transgénicas que expresan el gen de la proteína de la cubierta del virus del
mosaico del tabaco; Ciencias 232 738–743
Reimann-Phillipp U 1998 Mecanismo de resistencia: expresión de
proteína de capa; enMétodos en biología molecular, protocolos de
virología vegetal: del aislamiento del virus a la resistencia transgénica
Vol. 2 (eds) GD Foster y SC Taylor (Totowa, NJ: Humana Press) págs.
521–532
Samad A, Raj SK, Srivastava A, Chandra G, Ajayakumar PV,
Zaim M y Singh BP 2000 Caracterización de un Virus del mosaico
del pepino aislado que infecta el beleño egipcioHyoscyamus
mutichus L.) en India; Acta Virol. 44 131-136 Sambrook J, Fritsch
EF y Maniatis T 1989 Clonación molecular: a
manual de laboratorio 2da edición (Cold Spring Harbor, NY: Cold
Spring Harbor Laboratory Press)
Srivastava A y Raj SK 2004 Alta similitud molecular entre
Aislamientos indios de Virus del mosaico del pepino sugiere un
origen común; Curr. Sci.87 1126-1131
 Recubrimiento de la resistencia mediada por proteínas contra CMV 257

Srivastava A, Chandra G y Raj SK 2004 Proteína de capa y
caracterización molecular basada en genes de proteínas de movimiento de
Amaranthus cepa de Virus del mosaico del pepino; Acta Virol.48
229–239
Srivastava A, Raj SK, Haq QMR, Srivastava KM, Singh BP
y Sane PV 1995 Asociación de Virus del mosaico del pepino
cepa con enfermedad del mosaico del banano,Musa paradisiaca) -
una prueba que utiliza sondas de inmuno / ácido nucleico; Indian J.
Exp. Biol.33 986–988
Suzuki M, Kuwata S, Kataoka J, Masuta C, Nitta N y Takanami
Y 1991 Análisis funcional de mutantes de deleción del virus del
mosaico del pepino RNA3 usando un in vitro sistema de transcripción;
Virología 183 106-113
Taliansky ME y García-Arenal F 1995 Papel de Cucumovirus
proteína de la cápside en movimiento a larga distancia dentro de las plantas
infectadas; J. Virol. 69 916–922
Tomlinson JA 1987 Epidemiología y control de enfermedades víricas de
verduras; Ana. Apl. Biol.110 661–681
Varma A, Jain RK y Bhat AI 2002 Transgénico resistente al virus
plantas para el manejo ambientalmente seguro de enfermedades virales;
Indian J. Biotechnol. 1 73–86
Xue B, Gonsalves C, Provvidenti R, Slightom JL, Fuchs
M y Gonsalves D 1994 Desarrollo de tomate transgénico que
expresa un alto nivel de resistencia a las cepas del virus del
mosaico del pepino de los subgrupos I y II; Plant Dis. 78
1038-1041

MS recibió el 20 de septiembre de 2007; aceptado el 29 de enero de 2008

miPublicación: 5 de abril de 2008

Editor correspondiente: SOJOS EHASNAIN

J. Biosci. 33 (2), junio de 2008