Replicación del ADN

BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

Objetivos de la sesión
Comprender conceptos fundamentales de la biología molecular
• ADN y genómica
• Replicación del ADN (enzimas)
•Reparación del ADN
 El ADN como material genético
• El ADN se extrajo por primera vez de los núcleos en 1870
• Llamados 'nucleína' por su fuente.
• Análisis químico
– determinó que el ADN era un ácido débil rico en fósforo.

• Su nombre aporta mucha información sobre el ADN:

– ácido nucleico desoxirribosa:
– Contiene una fracción de azúcar (desoxirribosa),
– Es débilmente ácido,
– y se encuentra en el núcleo.

• Debido a su:
– Localización nuclear.
– Identificación posterior como componente de los cromosomas.
– Se le implicó como portador de información genética.
 Are genes composed of DNA or protein?
• También se sabe que los cromosomas contienen proteínas:
– así que desde el principio fue un desafío demostrar que el ADN era realmente la molécula
que contenía la información genética.
• ADN
– Solo cuatro subunidades diferentes componen el ADN.
– Los cromosomas contienen menos ADN que las proteínas en peso.
• Proteína
– 20 subunidades diferentes: mayor variedad potencial de combinaciones.
– Los cromosomas contienen más proteínas que ADN en peso.

• Los datos experimentales clásicos confirmaron que el ADN era el material genético.
 La transformación bacteriana implica al ADN como
sustancia de los genes
• 1928 - Frederick Griffith - experimenta con cepa lisa (S), virulenta Streptococcus pneumoniae, y
áspera (R), cepa no virulenta.
– La transformación bacteriana demuestra la transferencia de material genético.

• 1944 - Oswald Avery, Colin MacLeod y MacIyn McCarty - determinó que el ADN es el
material de transformación
Experimento de Griffith: transformación de bacterias
 Experimento de Griffith
• Griffith observó que las bacterias S vivas podían matar a los ratones inyectados con ellas.

• Cuando mató con calor las variantes S y las mezcló con variantes R vivas, y luego inyectó la
mezcla en los ratones, murieron.

• Griffith fue capaz de aislar las bacterias de los ratones muertos y descubrió que eran de la
variedad S.
•De este modo, las bacterias se habían transformado de la versión áspera a la lisa.

• La capacidad de una sustancia para cambiar las características genéticas de un organismo se

conoce como transformación.

• Los científicos se propusieron aislar este "principio transformador", ya que estaban convencidos
de que era el portador de la información genética.
Experimento de Avery, MacLeod y McCarty:
Identidad del Principio Transformador
 Experimento de Hershey y Chase

• 1952 - Alfred Hershey y Martha Chase proporcionan pruebas convincentes de que el ADN es
material genético.

• Experimento de la licuadora Waring con bacteriófagos T2 y bacterias.

• Marcadores radiactivos 32P para ADN y 35S para proteínas.

 Experimento de Hersey-Chase
¿Las proteínas llevan la información genética?
 Experimento de Hershey y Chase
• Realizado en 1952, utilizando bacteriófagos, un tipo de virus que tienen una estructura muy
simple:
- Un núcleo externo y un componente interno.

• Los fagos están formados por partes iguales de proteínas y ADN.

• Se sabía que el fago infectaba anclando la capa externa a la superficie celular y luego depositaba los
componentes internos a la célula, infectándola.

• Los científicos estaban interesados en averiguar si era el componente proteico o el componente

ADN el que se depositaba dentro de la célula infectada.

• Mediante la incorporación de radiomarcaje en la proteína o en el ADN del fago infeccioso,

determinaron que, efectivamente, el ADN se introdujo en las bacterias infectadas, lo que provocó la
proliferación de nuevos fagos.
 El modelo Watson-Crick: el
ADN es una doble hélice

• 1951 - James Watson aprende sobre el patrón de difracción

de rayos X proyectado por el ADN
• Conocimiento de la estructura química de los nucleótidos.
• azúcar desoxirribosa, fosfato y base nitrogenada.

• Los experimentos de Erwin Chargaff demuestran que.

• la relación de A y T es de 1:1
• la proporción de G y C es de 1:1

• 1953 - James Watson y Francis Crick proponen su

modelo de doble hélice de la estructura del ADN
 Patrones de difracción de rayos X producidos por
fibras de ADN Rosalind Franklin y Maurice Wilkins
• El ADN es polar: 5' a 3'

• El enlace beta N-
glicosídico conecta el
azúcar con la base
nitrogenada.

• Un enlace fosfodiéster
conecta un nucleótido con
el siguiente.

• La columna vertebral del

fosfato de azúcar es idéntica
en todas las moléculas de
ADN.

• En cualquier purina de ADN

= pirimidina
 Modelo Watson-Crick
• Estructura helicoidal doble.
• Las dos hebras son antiparalelas.
• Es una hélice dextrógira, esta estructura se llama ADN B.

• Emparejamiento de bases complementarias:

– tres enlaces de hidrógeno entre C y G;
– dos enlaces de hidrógeno entre A y T.
• La disposición de las bases nitrogenadas determina el mensaje genético.
• En cada posición, hay 4 posibilidades,
– por lo tanto, para una molécula de ADN de 100 pares de bases de largo,
hay 4100 variaciones posibles.
Emparejamiento de bases complementarias:
Reglas de Chargaff
• Proporciones de nucleótidos
• A=T y G=C
• A+T no tiene por qué ser igual a G+C.

tres enlaces de hidrógeno entre C y G

dos enlaces de hidrógeno entre A y T.

Linus Pauling

1940s
Descubrió la estructura alfa-helicoidal de las proteínas.
Replicación del ADN
• La doble hélice explicaba cómo el ADN
se copia a sí mismo.
• Estudiaremos este proceso, la
replicación del ADN, con más detalle.
¿Cómo se replica el ADN?

Hipótesis:

Conservador Semiconservador Dispersivo

 ¿Cómo se replica el ADN?

Hipótesis:
• A finales de la década de 1950, se propusieron tres mecanismos diferentes para la replicación del
ADN.
• Modelo conservador.
• Ambas hebras parentales permanecen juntas después de la replicación del ADN.

• Modelo semiconservador.
• El ADN bicatenario contiene una hebra parental y una filial después de la replicación.

• Modelo dispersivo.
• El ADN parental e hijo se intercalan en ambas hebras después de la replicación.
 Replicación del ADN

La molécula "madre" tiene dos hebras complementarias de ADN.

Cada uno está emparejado por base mediante enlaces de hidrógeno con su socio específico:
A con T
G con C
 Replicación del ADN

El primer paso en la replicación es la separación de las dos hebras.

 Replicación del ADN

Cada hebra parental sirve ahora como plantilla que determina el orden de las bases
a lo largo de una nueva hebra complementaria.
Replicación del
ADN
• Los nucleótidos están
conectados para formar la
columna vertebral de azúcar-
fosfato de las nuevas hebras.
• Cada molécula de ADN
"hija" consta de una hebra
parental y una nueva hebra.
 Replicación del ADN procariota
Un origen

• La síntesis de ADN comienza en un

sitio denominado el origen de la
replicación.
• Cada cromosoma bacteriano tiene
un solo cromosoma.
• La síntesis de ADN se realiza
bidireccionalmente alrededor del
cromosoma bacteriano.
• Las horquillas de replicación
finalmente se encuentran en el lado
opuesto del cromosoma bacteriano.
• Esto finaliza la replicación.
 Inicio de la replicación
◼ El origen de la replicación en E.
coli se denomina oriC
◼ Origen de la replicación
cromosómica
◼ Tres tipos de secuencias de
ADN en oriC son
funcionalmente significativas.
◼ Región rica en AT
◼ Cajas de ADN
◼ Sitios de metilación de GATC
◼ Otras proteínas como HU e IHF
también se unen.
◼ Esto hace que la región se
envuelva alrededor de las
proteínas DnaA y separa la región
rica en AT
◼ La replicación del ADN se inicia mediante la unión de
las proteínas de ADNA a las secuencias de la caja de
ADNA.
◼ Esta unión estimula la unión cooperativa de 20 a
40 proteínas DnaA adicionales para formar un
gran complejo.
 Compuesto por seis unidades
Viaja a lo largo del ADN en la
dirección de 5' a 3'
Utiliza energía de ATP

Replicación bidireccional
◼ La helicasa de ADN separa las dos hebras de ADN rompiendo los
enlaces de hidrógeno entre ellas.
◼ Esto genera un superenrollamiento positivo antes de cada
bifurcación de replicación.
◼ La ADN girasa viaja por delante de la helicasa y alivia estas superbobinas.
◼ Las proteínas de unión de cadena única se unen a las cadenas de
ADN separadas para mantenerlas separadas.
◼ A continuación, la primasa de ADN sintetiza cebadores de ARN
cortos (de 10 a 12 nucleótidos).
◼ Estas cadenas cortas de ARN inician, o preparan, la síntesis de ADN.
◼ Más tarde se eliminan y se reemplazan con ADN.
 ADN polimerasas
◼ Las ADN polimerasas son las enzimas que catalizan la
unión de nucleótidos para producir nuevo ADN.

◼ En E. coli hay cinco proteínas con actividad polimerasa.

ADN pol I, II, III, IV y V.

◼ ADN pol I y III .

◼ Replicación normal.
◼ ADN pol II, IV y V .
◼ Reparación del ADN y replicación del ADN dañado.
 ADN polimerasas
◼ ADN pol I
◼ Compuesto por un solo polipéptido.
◼ Elimina los cebadores de ARN y los reemplaza con ADN.

◼ ADN pol III

◼ Compuesto por 10 subunidades diferentes.
◼ La subunidad A sintetiza el ADN.
◼ Los otros 9 cumplen otras funciones.
◼ El complejo de los 10 se conoce como la holoenzima
ADN pol III.
 Las ADN polimerasas no
pueden iniciar la síntesis
de ADN

El problema se supera
con los cebadores de
ARN sintetizados por la
primasa

El problema se supera
sintetizando las hebras de 3'
a 5' en pequeños
fragmentos

Las ADN polimerasas pueden

unir nucleótidos solo en la
dirección de 5' a 3'

Características inusuales de la función de la ADN polimerasa

◼ Las dos nuevas hebras hijas se sintetizan de
diferentes maneras.
◼ Hebra principal.

◼ Un cebador de ARN se fabrica en el origen.

◼ El ADN pol III une nucleótidos en una dirección de 5' a
3' a medida que se desliza hacia la abertura de la
horquilla de replicación.
◼ Hebra rezagada
◼ La síntesis también está en la
dirección de 5' a 3'.
◼ Sin embargo, se produce lejos
de la bifurcación de
replicación.
◼ Se requieren muchos
cebadores de ARN.
◼ DNA pol III utiliza los cebadores
de ARN para sintetizar
pequeños fragmentos de ADN
(de 1000 a 2000 nucleótidos
cada uno).
◼ Estos se denominan
fragmentos de Okazaki en
honor a sus descubridores.
◼ DNA pol I elimina los cebadores de ARN y rellena el
hueco resultante con ADN.
◼ Utiliza su actividad exonucleasa de 5' a 3' para digerir el
ARN y su actividad polimerasa de 5' a 3' para
reemplazarla con ADN.

◼ Una vez que se llena el espacio, todavía falta un

enlace covalente.

◼ La ADN ligasa cataliza un enlace fosfodiéster.

◼ Conectando así los fragmentos de ADN.
 Mantiene las hebras
Rompe los enlaces parentales separadas
de hidrógeno entre Sintetiza hebras de
las dos hebras ADN hijas

III

Alivia el
superenrolla Enlaza covalentemente
miento fragmentos de ADN entre sí

Sintetiza un
cebador de ARN
La reacción de la ADN polimerasa
◼ Las ADN polimerasas catalizan un enlace
fosfodiéster entre el
◼ Grupo fosfato más interno del trifosfato desoxinucleósido
entrante.
◼ ADN

◼ 3'-OH del azúcar del desoxinucleótido anterior.

◼ En el proceso, se liberan los dos últimos fosfatos
del nucleótido entrante.
◼ En forma de pirofosfato (PPi).
Fosfato más
interno
 Finalización de la replicación
◼ Opuesto a oriC hay un par de secuencias de
terminación llamadas secuencias ter
◼ Estos se designan T1 y T2

◼ La proteína tus (sustancia de utilización de

terminación) se une a estas secuencias
◼ A continuación, puede detener el movimiento de las
bifurcaciones de replicación
 Permite el avance de la horquilla móvil CW
Evita el movimiento de la horquilla móvil CCW

(T1)

(T2)

Permite el avance de la horquilla móvil CCW

Evita el movimiento de la horquilla móvil CW

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 Finalización de la replicación
◼ La replicación del ADN termina cuando las bifurcaciones
que avanzan opuestamente se encuentran
(generalmente en T1 o T2).

◼ Finalmente, la ADN ligasa une covalentemente las

cuatro cadenas de ADN.

◼ La replicación del ADN a menudo da como resultado

dos moléculas entrelazadas.
◼ Las moléculas circulares entrelazadas se denominan
catenanos.
◼ Estos están separados por la acción de las topoisomerasas.
 Catenanas

Catalizado por
topoisomerasas de ADN

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 Replicación del ADN EUCARIOTA: "Burbujas" de replicación

• Múltiples orígenes de la replicación > Estas

"burbujas" son los puntos de partida de la
replicación.

• Horquilla de replicación: región en forma de 'Y'

donde se alargan nuevas hebras de ADN.
 Múltiples orígenes de la replicación
◼ Los eucariotas tienen cromosomas lineales largos.
◼ Por lo tanto, requieren múltiples orígenes de replicación.
◼ Garantizar que el ADN pueda ser replicado en un tiempo razonable.

◼ En 1968, Huberman y Riggs proporcionaron evidencia

de los múltiples orígenes de la replicación.

◼ La replicación del ADN procede bidireccionalmente a

partir de muchos orígenes de replicación.
 Bidrectional
DNA synthesis

Replication
forks will
merge
 Múltiples orígenes de la replicación
◼ Los orígenes de la replicación encontrados en los
eucariotas tienen algunas similitudes con los de las
bacterias.

◼ Los orígenes de la replicación en Saccharomyces cerevisiae se

denominan elementos ARS (Secuencia de Replicación
Autónoma).
◼ Tienen una longitud de 100-150 pb.
◼ Tienen un alto porcentaje de A y T.
◼ Tienen tres o cuatro copias de una secuencia específica.
◼ Similar a las cajas de ADN bacteriano.
 Múltiples orígenes de la replicación
◼ Complejo de reconocimiento de origen (ORC).
◼ Complejo de seis subunidades que actúa como iniciador de la
replicación del ADN eucariota.
◼ Parece encontrarse en todos los eucariotas.

◼ Requiere ATP para enlazar elementos ARS.

◼ El ADN monocatenario estimula el ORC para hidrolizar el ATP.

 Eukaryotes Contain Several Different DNA
Polymerases
◼ Las células de mamíferos contienen más de una docena de ADN
polimerasas diferentes.

◼ Cuatro: alfa (a), delta (d), épsilon (e) y gamma (g) tienen la
función principal de replicar el ADN.
◼ a, d y e → ADN nuclear
◼ g → ADN mitocondrial
◼ La ADN pol a es la única polimerasa que se asocia
con la primasa.
◼ El complejo ADN pol a/primasa sintetiza un híbrido corto
de ARN-ADN.
◼ 10 nucleótidos de ARN seguidos de 20 a 30 nucleótidos de ADN.
◼ Esto es utilizado por DNA pol d o e para el alargamiento
procesivo de las hebras principales y rezagadas.
◼ La evidencia actual sugiere un mayor papel de la pol d del ADN.
◼ El intercambio de ADN pol a por d o e se denomina
switch de polimerasa.
◼ Ocurre solo después de que se hace el híbrido ARN-
ADN.
◼ Las ADN polimerasas también desempeñan un papel
en la reparación del ADN
◼ El ADN pol b no está involucrado en la replicación del ADN
◼ Desempeña un papel en la reparación de la escisión de la
base
◼ Eliminación de bases incorrectas del ADN dañado

◼ Recientemente, se han identificado más ADN

polimerasas
◼ Polimerasas replicadoras de lesiones.
◼ Implicado en la replicación del ADN dañado.
◼ Pueden sintetizar una hebra complementaria sobre la región
anormal.
Nucleosomas y replicación del ADN
◼ La replicación duplica la cantidad de ADN
◼ Por lo tanto, la célula debe sintetizar más histonas para adaptarse a
este aumento

◼ La síntesis de histonas se produce durante la fase S

◼ Las histonas se ensamblan en estructuras de octámeros
◼ Se asocian con el ADN recién creado muy cerca de la horquilla de replicación

◼ Por lo tanto, después de la replicación del ADN, cada hebra

hija tiene una mezcla de histonas "viejas" y "nuevas".
Newly made
histone proteins
REPARACIÓN DEL
ADN
Reparación por
escisión de base
Reparación por
escisión de nucleótidos
Genómica
La genómica es una rama de la biología que se encarga del estudio de
los genomas, que son el conjunto completo de material genético
contenido en el ADN de un organismo. Se ocupa del análisis y la
comprensión de la estructura, la función, la evolución y la edición de
los genomas. La genómica abarca una variedad de enfoques, técnicas y
disciplinas que se utilizan para investigar y comprender la información
genética de los organismos.

La genómica tiene importantes implicaciones en una amplia gama de

campos, incluyendo la medicina, la biotecnología, la agricultura y la
conservación. Ha sido fundamental para el avance en la comprensión
de enfermedades genéticas, la terapia génica, la agricultura de
precisión, la identificación de marcadores genéticos y la comprensión
de la evolución y la diversidad biológica.
Algunos aspectos clave de la genómica incluyen:
1. Secuenciación del genoma: El proceso de determinar el orden de las bases
nucleotídicas en el ADN de un organismo.
2. Análisis de genes y funciones: La identificación y caracterización de los genes y
su función dentro de los organismos.
3. Comparación de genomas: La comparación de secuencias genómicas entre
diferentes organismos para comprender la evolución y la relación entre ellos.
4. Estudio de la expresión génica: La investigación de cómo se expresan y regulan
los genes en diferentes contextos y condiciones.
5. Edición genética: La manipulación de secuencias genómicas para comprender la
función de genes específicos o para alterar características genéticas con fines de
investigación o aplicaciones prácticas.
Secuenciamiento
Gracias…