Metodología

La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una técnica nueva y muy precisa que
amplifica el material genético de manera constante a una temperatura constante. Se usó para
detectar la bacteria Salmonella, que puede causar intoxicación alimentaria. Se diseñaron
cebadores específicos y se optimizó la reacción a 65°C durante 60 minutos. La LAMP pudo
detectar Salmonella incluso en concentraciones muy bajas, mientras que la PCR necesitó una
concentración más alta. Este método podría ser útil para el diagnóstico rápido de Salmonella
en alimentos.

Metodología

Extracción de bacterias y ADN

Se utilizó una bacteria llamada S. enterica ser. Typhimurium ATCC 14028. Esta bacteria fue
revivida (es decir, puesta en un estado activo y viable) en un caldo de cultivo llamado Luria
Bertani (LB) en el laboratorio de la compañía Himedia en India.

La bacteria se incubó a una temperatura de 37°C durante un período de 18 horas. Esto

proporcionó el tiempo necesario para que las bacterias crecieran y se reprodujeran.

Después de la incubación, se procedió a extraer el ADN genómico de las bacterias. Para hacer
esto, se utilizó un kit de extracción de ADN llamado DNeasy de la compañía Qiagen en India. Se
siguieron las instrucciones proporcionadas por el fabricante del kit para llevar a cabo este
proceso. Esto implica una serie de pasos para liberar y purificar el ADN de las células
bacterianas.

Diseño de cebadores para ensayo LAMP.

Aquí en esta etapa se diseñan cebadores para llevar a cabo la tecnica (LAMP) dirigida a un gen
específico llamado invA.

Se diseñó un conjunto de cuatro cebadores, que se dividen en dos tipos: cebadores internos
(SalFIP y SalBIP) y cebadores externos (SalF3 y SalB3). Cada uno de estos cebadores tiene una
secuencia específica de nucleótidos que es complementaria a una región específica del gen
invA.

El gen InvA es un gen presente en bacterias del género Salmonella. Codifica para una proteína
conocida como invasina A, que es esencial para la invasión de células hospedadoras por parte
de Salmonella.

• Por ejemplo, el cebador SalFIP está diseñado para emparejarse con una región llamada
F2 del gen invA en su extremo 3', y tiene la misma secuencia que la región F1c en su
extremo 5', separada por una secuencia de nucleótidos TTTT.
• Similarmente, el cebador SalBIP está diseñado para emparejarse con una región
llamada B2 del gen invA en su extremo 3', y tiene la misma secuencia que la región B1c
en su extremo 5', también separada por una secuencia de nucleótidos TTTT.

Estos cebadores fueron diseñados utilizando una herramienta llamada primer explorerV4 y
están destinados a facilitar la amplificación selectiva del gen invA durante la técnica de LAMP.
Las secuencias exactas de estos cebadores están disponibles a solicitud.
Optimización de las condiciones de LAMP

Se realizaron una serie de experimentos para determinar las condiciones óptimas de

temperatura y tiempo para llevar a cabo la técnica de LAMP, utilizando una mezcla de reacción
específica y ADN genómico de una cepa de referencia.

ADN Genómico de la Cepa de Referencia:

Se utilizó ADN genómico aislado de una cepa de referencia para llevar a cabo la optimización
de las condiciones.

Optimización de la Temperatura de Reacción:

Se probó la reacción a diferentes temperaturas constantes entre 60°C y 65°C para determinar
la temperatura óptima.

Optimización de la Duración de la Reacción:

Se realizó un experimento para determinar la duración óptima de la reacción LAMP. Se

probaron tiempos de 15 minutos a 60 minutos, con incrementos de 15 minutos entre cada
punto de tiempo.

Composición de la Mezcla de Reacción:

La reacción se llevó a cabo en un volumen de 12.5µL y contenía los siguientes componentes:

1µL de cada cebador interno (a una concentración de 20 picomoles cada uno).

0.5µL de los cebadores externos F3 y B3.

6.25µL de una mezcla de reacción 2X que contiene diferentes componentes químicos como Tris
HCl, KCl, MgSO4, (NH4)2SO4, Tween 20 y betaina, todos a concentraciones específicas.

Polimerasa de ADN Bst:

Se añadió 0.5µL de una enzima llamada Bst DNA polimerasa, que es responsable de replicar el
ADN durante la reacción.

ADN Blanco (Objetivo):

Se añadió 1µL de ADN objetivo.

Temperaturas de Incubación:

Se realizó la reacción a temperaturas de 60°C, 63°C y 65°C durante 60 minutos.

Terminación de la Reacción:

La reacción se detuvo elevando la temperatura a 80°C durante 10 minutos.

Optimización del Tiempo de Reacción:

Se determinó que un tiempo de reacción de 60 minutos fue el óptimo, basado en un patrón

claro de amplificación observado en la electroforesis en gel.
Especificidad de la LAMP

Se evaluó la especificidad de las pruebas de LAMP. Se utilizó ADN de bacterias pertenecientes a

géneros diferentes pero relacionados cercanamente dentro de la misma familia que la bacteria
de interés (Salmonella). Estos otros géneros incluyeron Proteus mirabilis, Escherichia coli,
Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter aerogenes. se quería confirmar si la
prueba de LAMP era capaz de identificar de manera precisa la presencia de la bacteria
Salmonella en comparación con otras bacterias relacionadas en términos de taxonomía.

Sensibilidad del ensayo LAMP utilizando muestras artificiales enriquecidas

se evaluó la sensibilidad de la técnica de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP)

utilizando muestras artificiales contaminadas.

Preparación de la Cultura de Salmonella:

Se seleccionó una sola colonia de la bacteria S. enterica ser. Typhimurium ATCC 14028 de una
placa de agar nutritivo y se inoculó en un caldo de cultivo llamado Luria Bertani (LB). Luego, se
incubó a 37°C con agitación hasta que la cultura alcanzó una densidad óptica (OD600) de
aproximadamente 0.6, lo que corresponde a una concentración de 3 x 10^8 UFC/ml,
previamente determinada por el método de placa extendida.

Diluciones Seriadas de la Cultura:

La cultura fue diluida en solución salina fisiológica para obtener diferentes concentraciones:
3x10^3, 3x10^2, 30, 3 y menos de 0 UFC/ml.

Preparación de las Muestras de Pollo:

Se adquirió carne de pollo en el mercado local y se picó finamente con una cuchilla estéril.
Luego, se distribuyó como una fina capa en placas de Petri estériles y se sometió a tratamiento
con luz ultravioleta durante 15 minutos en ambas superficies.

Inoculación de las Muestras de Pollo:

Se añadieron 100 µl de las diluciones de la cultura a 5 gramos de carne de pollo picada tratada
con luz ultravioleta. Las muestras se dejaron absorber la cultura a temperatura ambiente
durante 15 minutos.

Control sin Contaminación:

Se mantuvo una muestra de carne de pollo sin contaminar como control.

Enriquecimiento y Detección:

Se transfirieron las muestras de prueba y el control a botellas de cultivo que contenían 45 ml

de caldo de Selenito cisteína (FSC). Las botellas se agitaron vigorosamente y se tomaron
muestras de pre-enriquecimiento de 1 ml. Las botellas de FSC se incubaron a 37°C durante 18
horas y se tomaron muestras de enriquecimiento de 1 ml. Los caldos de enriquecimiento se
cultivaron en agar Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) para detectar Salmonella utilizando el
método de cultivo tradicional.

Extracción de ADN y Detección por PCR y LAMP:

Se extrajo el ADN de las muestras de pre-enriquecimiento y enriquecimiento, y luego se llevó a

cabo la detección utilizando tanto PCR como la técnica de LAMP.

Además, se menciona que se recolectaron muestras de carne de pollo de diferentes tiendas

locales del mercado, y se extrajo ADN de estas muestras sin necesidad de enriquecimiento.
Luego, los ADN extraídos se utilizaron para realizar pruebas de PCR y LAMP.
Resultados

Optimización de las Condiciones de la Reacción LAMP:

Se llevó a cabo una serie de experimentos para encontrar las mejores condiciones de
temperatura y tiempo para la reacción de LAMP utilizando una plantilla de ADN de Salmonella
typhimurium. Se determinó que la amplificación era más efectiva a una temperatura de 65°C
durante 60 minutos. No se observó amplificación a 60°C durante 60 minutos.

Especificidad de la Prueba LAMP:

Se probó la especificidad de la reacción de LAMP utilizando ADN extraído de bacterias de

géneros relacionados, como Proteus mirabilis, Escherichia coli, Shigella flexneri, Klebsiella
pneumoniae y Enterobacter aerogenes. Se observó que solo la Salmonella mostró
amplificación, lo que indica que la prueba es específica para detectar Salmonella y no otras
bacterias de géneros similares.

Sensibilidad de la Prueba LAMP:

Se realizaron diluciones seriadas de la cantidad inicial de bacterias (3.8x10^8 UFC/ml) y se

utilizaron para contaminar muestras de carne de pollo en diferentes cantidades (300 CFU, 30
CFU, 3 CFU y menos de 3 CFU). La técnica de LAMP pudo detectar hasta 3 CFU de Salmonella
directamente en la carne de pollo, mientras que la PCR convencional solo pudo detectar el gen
objetivo después de 6 horas de enriquecimiento en caldo de Selenito cisteína (FSC).

En resumen, se logró optimizar la técnica de LAMP para detectar Salmonella typhimurium con
éxito, demostrando alta especificidad y sensibilidad, lo que la convierte en una herramienta
valiosa para la detección rápida y precisa de esta bacteria en muestras de carne de pollo.