TECNOLOGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE

ECATEPEC

División de Ingeniería Química y Bioquímica.

Protocolo #2

Determinación de Salmonella spp en productos cárnicos por las técnicas de

PCR y NMP
Presenta

Equipo No. 3

Integrantes:
Carrasco Martínez Ricardo
Flores Mondragon Emmanuel
Hernández Ortiz Veronica
Rojano Patiño Liz Francia
Valdez Guerrero María de los Angeles

Ingeniería Bioquímica

Ecatepec de Morelos, de 2021

Resumen

La salmonella spp es uno de los principales agentes causales de intoxicaciones alimentarias

a nivel mundial coloniza en la mayoría de los animales y el ser humano, no es detectable en
muestras que tienen un bajo número de células y los métodos mas tradicionales para su
aislamiento tienen baja especificidad, baja sensibilidad y consumen mucho tiempo.

En los últimos años se han desarrollado protocolos utilizando diferentes métodos moleculares
para la detección de Salmonella spp a partir de muestras clínicas y alimentos , los costos para
la detección es elevada a comparación de métodos tradicionales, pero la alta sensibilidad y
especificidad que ofrece PCR, los beneficios al sector salud al lograr un diagnóstico rápido
y preciso , las ventajas y desventajas de los métodos microbiológicos tradicionales y
moleculares para detectar Salmonella spp en diferentes matrices permite establecer la mejor
estrategia a seguir la detección y diagnostico de microorganismos de difícil aislamiento.

Por otro lado, el otro método que se pretende aplicar llamado Numero Mas Probable (NMP)
para la cuantificación de Salmonella spp es una estrategia eficiente de estimación de
densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células
individuales no es factible.

La técnica a emplear en este estudio es la del Número Más Probable (NMP), una prueba
estándar semicuantitativa que puede realizarse mediante una fermentación en tubos múltiples
(a través de las fases presuntivas y confirmatorias o prueba completa).

Introducción

A pesar de los estrictos controles exigidos a la industria alimentaria, se ha calculado que cada
año mueren aproximadamente 1.8 millones de personas como consecuencia de enfermedades
diarreicas, siendo la causa principal el consumo de agua o alimentos contaminados.

En la actualidad se han descrito mas de 250 enfermedades diferentes transmitidas a través de

los alimentos dentro de este grupo de enfermedades se encuentra la salmonelosis es una
zoonosis de distribución mundial, las infecciones por salmonella spp pueden causar pequeños
brotes en la población entre 60 y 80% de los casos esporádicos a veces se producen grandes
brotes en hospitales, jardines infantiles, hogares geriátricos y restaurantes. (Castaño,2019)

La detección de Salmonella spp por métodos de cultivo microbiológicos tradicionales se

dificulta por el bajo número de células bacterianas y el alto grado de injuria después de los
procesos tecnológicos aplicados para la producción de alimentos que determinan sus
características fisicoquímicas, como la escasa actividad de agua.
La utilidad de la técnica PCR para la detección de microorganismos en diferentes matrices
está limitada por la presencia de sustancias que inhiben la DNA polimerasa tales como: sales
biliares, bilirrubina, hemoglobina o derivados, compuestos polifenolicos, proteinasas,
polisacáridos complejos y grasa, que también interfieren en la unión de la enzima con el
cloruro de magnesio o que desnaturalizan el DNA.

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio utilizada para

amplificar secuencias de ADN, el método utiliza secuencias cortas de ADN llamados
cebadores para seleccionar la parte del genoma a amplificar, la temperatura de la muestra se
sube y se baja repetidamente para ayudar a la enzima de replicación del ADN a duplicar la
secuencia del ADN que está siendo copiada, con esta técnica se pueden producir un billón de
copias de la secuencia en estudio en sólo unas pocas horas. (Gonzalez,2014)

La técnica NMP Numero Mas Probable se basa en la determinación de presencia o ausencia

en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de microorganismos presentes
en muestras de suelos u otros ambientes.

Los resultados del estudio de las diluciones replicadas se expresan en términos del NMP de
microorganismos existentes. Es decir que este número es el resultado del cálculo de la
densidad media de los microorganismos, y está basado en unas fórmulas de probabilidad
predeterminadas.

En la actualidad, para evaluar Salmonella spp. como indicador se debe emplear el NMP
porque es una técnica que permite recuperar bacterias viables no cultivables en los procesos
de desinfección. (Ruiz,2018).

Objetivo General

Aplicar y comprender la metodología de las dos técnicas a utilizar (PCR y NMP) para la
cuantificación de microorganismos en algún tipo de alimento a analizar.

Objetivo especifico

 Aplicar la técnica más apropiada de acuerdo con el microorganismo indicador en

nuestro alimento
 Aplicar la metodología en el desarrollo del producto hasta su etapa final
 Garantizar un análisis de inocuidad aplicando cada una de estas técnicas
 Proponer los puntos críticos de control de acuerdo con el microorganismo indicador
Salmonella ssp.
Metodología

TECNICA NMP

ESTERILIZACION CONTEO

LAVADO DE PREPARAR MEDIR 10 ml DE

CAJAS PETRI MUESTRA MUESTRA
ASEPTICA Salmonella spp.

ACONDICIONAR HIDRATAR 50g

MATERIAL A AGAR EN MEDIO HOMOGENIZAR
UTILIZAR LITRO DE AGUA EN 9ML DE AGUA
DESTILADA

REALIZAR
IDENTIFICAR Y REPOSO 15 MIN Y DILUCIONES
EMPACAR EBULLIR 1 MIN DECIMALES
INTRUMENTAL (1ML) CON 9 ML
DE AGUA EN

PREPARAR
AUTOCLAVE ENFRIAR A 45 °C
HOMOGENIZAR
LA MUESTA EN
AGAR E
ESTERILIZAR: INCUBAR A 35°C
CONSERVAR A
121 °C APROX 15 DURANTE 24
– 30 MIN Y A 2 – 8 °C

REGISTRAR COMO
FINALIZAR
POSITIVOS TUBOS
CICLO DE UTILIZAR CAJAS
EN DONDE SE
ESTERILIZADO PETRI PARA
OBSERVE
CULTIVO
TURBIDEZ
DESPRESURIZAR DESPUÉS DE UN
Y RETIRAR INOCULAR PERÍODO DE
MATERIAL Salmonella spp
DURANTE 24
CONSULTAR
HORAS
TABLA DE
ORGANISMOS/ml
 Norma ISO- Pesar 25 g de
6579:2002 muestra

Homogeneizar con
225 ml en solución
diluyente

Enriquecimiento Incubar 18-24

selectivo horas a 37°C

Siembra con asa

bacteriológica

Caldo Tetrationato-
bilis-verde brillante,
caldo Rappaport-
Vasiliadis (RV) y
Selenito cistina
(SC).

Incubar a 37°C Aislamiento con

Incubar a 37°C
durante 18 a 24 Agar Xilosa Lisina Identificación
durante 18 a 24
horas. Desoxicolato de colonias
horas.
(XLD)

Colonias rosadas Concentración de

con o sin centro microorganismos
negro 1.5x108 UFC/ml
 Método PCR

60 Muestras porcinas,
cultivados en agua
peptonada

Gen Inv. A de
Salmonella
(Proveniente de carne)

Cultivar 3 ml de
caldo Luria Bernati
(LB) 24 horas a 37°C

Inocular 1 ml del caldo

(LB) en 9 ml de caldo
Rappaport

Incubar a 42°C
por 24 horas

Sembrar una alícuota del

caldo Rappaport agotando
estrías en placa de agar
salmonella y agar Xilosa-
Lisina-Termitol.

Incubar a 37°C
por 24 horas.

Electroforesis en Separación de
gel de agarosa moléculas cargadas a
través del gel.
Resultados

En el criterio microbiológico se define la aceptabilidad de un producto en este caso la carne

u otro ingrediente alimentario en base a la presencia o ausencia, o el número de
microorganismos ya sea por unidad de masa, volumen, área o lote. Se debe contemplar las
técnicas de ensayo para la detección o cuantificación en este protocolo del microorganismo
como la salmonella spp., el plan que define el número de muestras del lote a ser analizadas;
y el número de unidades de muestras defectuosas.

En el requisito microbiológico recomendado en técnicas para la cuantificación es que el

microorganismo o grupo de microorganismos que debe ser analizado, aunque no
rutinariamente, y el incumplimiento de los límites establecidos para el número de
muestras analizadas ayuda a alertar al responsable del producto sobre la necesidad de
identificar y corregir los factores causantes del problema. (Irarte,2006).

Valor n = Es el número de unidades de muestra (paquetes, envases, botellas, etc.) de un lote

que se deben examinar para satisfacer un plan de muestreo dado.

Valor c = Es la cantidad máxima de unidades que se permite excedan el criterio

microbiológico m. Cuando este número se excede, el lote se rechaza, aunque
obligatoriamente no tenga que destruirse.

Valor m = Es el número máximo de unidades formadoras de colonias (UFC) o número más

probable (NMP) sobre gramo o mililitro de alimento. En un plan de tres clases, m separa los
productos de buena calidad (valores < m) de los aceptados marginalmente (valores > m).

Valor M = Es una cantidad de unidades formadoras de colonias (UFC) o número más

probable (NMP) sobre gramo o mililitro de alimento que se usa para separar la
calidad marginalmente aceptable de la inaceptable. M se utiliza en los planes de tres clases.
Cifras mayores a M, en cualquiera de las unidades analizadas, son inaceptables y están
relacionadas con riesgo sanitario, indicadores sanitarios o con un deterioro potencial.

Los resultados microbiológicos deben de ser reportados por el laboratorio oficial, aprobado
o autorizado, en términos cualitativos (ausencia o presencia) dentro de las 24 horas
posteriores a la emisión del resultado. El valor de aceptación para Salmonella spp será
ausencia del microorganismo.

Discusión

Según SAGARPA, Si durante el muestreo anual, no rebasa el máximo de resultados positivos

permitidos (muestras con presencia de Salmonella spp). Podrá concluirse el muestreo anual
del año en curso, para volver a iniciarlo el año siguiente.

Si durante el muestreo anual se rebasa el máximo de resultados positivos permitidos

(muestras con presencia de Salmonella spp), el establecimiento deberá:
  Realizar acciones correctivas encaminadas a corregir la presencia de Salmonella spp.
en el establecimiento. Las acciones correctivas deberán realizarse de manera
inmediata.
 Reiniciar el muestreo anual
Si durante el 2° bloque de muestreo se rebasa nuevamente el máximo de resultados positivos
permitidos, el establecimiento deberá:

 Revisar y reevaluar el plan HACCP.

 Realizar acciones correctivas adecuadas, encaminadas a eliminar la presencia de
Salmonella spp. en el establecimiento.
 Reiniciar una vez más el muestreo anual (3er bloque)
Si durante el 3er bloque de muestreo se rebaza una vez más el máximo de resultados
positivos permitidos el establecimiento deberá:

 Suspender el proceso del producto hasta garantizar que se ha validado nuevamente el

plan HACCP.
 Asegurarse que realmente se han aplicado las medidas y acciones necesarias para
reducir la prevalencia de Salmonella spp. en el establecimiento.
 siempre deberán notificar a la Dirección General de Inocuidad Agroalimentaria,
Acuícola y Pesquera, por escrito en cualquiera de los tres casos donde se rebase el
máximo de resultados positivos permitido. (SAGARPA,2015).

Conclusión

De acuerdo con las técnicas vistas y siguiendo sus metodologías para la cuantificación de
microorganismos de Salmonella spp. Podemos concluir que para un análisis de cuantificación
la mejor técnica sería el método de PCR. Ya que por su rápida efectividad y confiabilidad
podemos realizar el conteo de una forma mas rápida y segura, además de reducir costos,
tiempo y material, siguiendo claro todo bajo las normas establecidas y así poder obtener los
resultados esperados de cualquier muestra que estemos analizando además de Salmonella
ssp. Por lo que se sugiere en casos de precisión, efectividad y reducir el tiempo de los
resultados implementar la técnica de PCR.
Bibliografía

 Castaño A. (2019). EVALUACIÓN DE LA REMOCIÓN DE Salmonella spp. A

PARTIR DE DOS CALIDADES DE AGUAS SINTÉTICAS TRATADAS CON
FILTROS CASEROS. 2017, de Universidad Santiago de Cali Sitio web:
https://repository.usc.edu.co/bitstream/handle/20.500.12421/1740/EVALUACI%D3
N%20DE%20LA%20REMOCI%D3N.pdf;jsessionid=B3D6F1DA65344BB95B58
EC92DB211145?sequence=1

 González J. et al. (2014). Aislamiento microbiológico de Salmonella spp. y

herramientas moleculares para su detección. 2012, de scielo Sitio web:
http://www.scielo.org.co/pdf/sun/v30n1/v30n1a09.pdf

 González, P. J., Pereira, S. N., Soto, V. Z., Hernández, A. E., & Villareal, C. J.
(2014). Aislamiento microbiano de Salmonella spp. Y herramientas moleculares
para su detección. Articulo. Salud Uninorte. Barranquilla. Recuperado de:
http://www.scielo.org.co/pdf/sun/v30n1/v30n1a09.pdf

 Iriarte, M. M. (2006, diciembre). Interpretación de resultados de análisis

microbiológicos en alimentos: Planes de atributos. Recuperado 21–05-18, de
http://ve.scielo.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0798-04772006000200006

 Mariela, A., Cabrera, D. F., Ruarte, S., Garbini. A., Jakubowski, N. (2018).
Verificación intralaboratorio de la norma ISO 6579: Método horizontal para la
determinación de Salmonella spp. en formula en polvo para lactantes. Revista
Ciencia Reguladora de la Animat. Buenos Aires, Argentina. Recuperado de:
https://www.argentina.gob.ar/sites/default/files/verificacion_intralaboratorio_de_la
_norma_iso_6579_metodo_horizontal_para_la_deteccion_de_salmonella_spp._en_
formula_en_polvo_para_lactantes_articulo_3_no2.pdf

 Ruiz, M. J., Ramallo, G., Colello, R., Villalobo, C., Monteavaro, C., Etcheverria, A.,
& Padola, N.L. (2018). Diferentes métodos para aislamiento y detección de
Salmonella spp. en canales porcinas. Rev. Colomb. Biotecnol. Vol. XX No.2.
Laboratorios de Inmunología y Biotecnología, Facultad de Ciencias Veterinarias.
Recuperado de: http://www.scielo.org.co/pdf/biote/v20n2/0123-3475-biote-20-02-
117.pdf

 SAGARPA. (2015, junio). MANUAL DE REDUCCIÓN DE PATÓGENOS PARA

LA DETECCIÓN DE: Salmonella spp. Recuperado 21–05-18, de
 https://www.gob.mx/cms/uploads/attachment/file/229964/27._Reducci_n_de_pat_g
enos-Salmonella.pdf

 SENASICA (2015). MANUAL DE REDUCCIÓN DE PATÓGENOS PARA LA

DETECCIÓN DE: Salmonella spp. DIRECCIÓN GENERAL DE INOCUIDAD
AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA.
https://www.gob.mx/cms/uploads/attachment/file/229964/27._Reducci_n_de_pat_g
enos-Salmonella.pdf

 Práctica 7. Técnicas para la enumeración de microorganismos: análisis

microbiológico del agua y de otras diversas muestras. (2012).
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/P7_EnumeracionMicroorganismos_19
616.pdf
Anexos

Interpretación de los resultados

a) Los cultivos determinados como presuntivos con las pruebas bioquímicas y

confirmados por la serología, informar como:
Salmonella spp en 25g: PRESENCIA.
 b) Descartar los cultivos con resultados atípicos a partir de las pruebas bioquímicas
miniaturizadas clasificadas como no Salmonella spp, informar:
Salmonella spp en 25g: AUSENCIA.
c) Placas con agar XLD, ASB y el tercer medio selectivo sin desarrollo y/o colonias
atípicas, informar:
Salmonella spp en 25g: AUSENCIA.
d) En caso de que la cantidad sea menor a 25g se debe reportar la presencia o ausencia
de Salmonella spp en la porción de ensayo (g o mL) de producto utilizado.
e) Para los casos en los que se analiza una pieza de producto reportar como presencia o
ausencia por piezas analizadas. ( NOM-210-SSA1-2014).

Interpretación de resultados de análisis microbiológicos en alimentos:

Planes de atributos

Se aplican cuando no se cuenta con información acerca de los antecedentes del producto
alimenticio y por tanto no se puede realizar un plan de muestreo que dependa de la
distribución de la frecuencia de los microorganismos en los lotes del alimento. Los planes de
muestreo de atributos se clasifican como de dos y tres clases, dependiendo de si se puede
permitir o no la presencia de una muestra positiva en cualquiera de las unidades de muestra.

Este tipo de planes de atributos está recomendado para la aceptación de productos

alimenticios que llegan a puertos de entrada o sitios parecidos, pues es común en esos lugares
que, al recibir partidas de alimentos, los mismos no traigan consigo información sobre la
forma cómo fue procesado el alimento o ésta sea insuficiente.

Idealmente, el control microbiológico de los alimentos se debe hacer en la etapa de

producción, proceso o preparación para el consumo. Sin embargo, en muchos alimentos que
se comercializan internacionalmente no existe el conocimiento del control de la fuente o de
las condiciones existentes durante el procesamiento y manejo de esos alimentos. Por lo tanto,
existe la necesidad de aplicar algún criterio para evaluar la aceptabilidad de los alimentos en
el puerto de entrada de alimentos importados (SAGARPA,2015).

Programas de atributos de dos clases (aceptación o rechazo)

En este tipo de programa, las pruebas microbiológicas están encaminadas a comprobar la

presencia o ausencia de un microorganismo, generalmente patógeno, o puede ser un recuento
en placa para comprobar si es inferior o superior a un nivel crítico.

Ejemplo: Salmonella en 25 g: n = 5 c = 0 m = 0

Esto en la práctica significa que se eligen cinco unidades de muestra (n = 5) aleatoriamente

de un mismo lote, para realizarles cinco análisis de detección de Salmonella. Para decidir la
aceptación del lote en cuestión, se consideran los resultados. En ninguna de las unidades (c
= 0) debe detectarse Salmonella (m = 0).
Otro ejemplo de programa de dos clases sería: Coliformes fecales (NMP/g): n = 5 c = 2 m =
11 Lo que indica este ejemplo es que se deben analizar cinco unidades del producto escogido
aleatoriamente. Si en dos unidades de muestra o menos (c = 2) se detecta hasta 11 NMP/g de
coliformes, el lote se acepta respecto a esta característica. Pero si en tres o más se detecta
presencia en cantidades mayores a 11 NMP/g, no se estaría acatando el criterio
microbiológico, se incumpliría con la norma correspondiente y, por tanto, se rechazaría el
lote.

Programa de atributos de tres clases

El diseño conveniente de los planes de muestreo de tres clases considera la inevitable

variabilidad tecnológica, así como la severidad deseada con la cual recuentos bacterianos
altos encontrados en una unidad de muestra pueden conducir a rechazar un lote, aun cuando
cumpla las condiciones de buenas prácticas de manufactura.

En este programa se dan unos criterios microbiológicos que permiten dividir la calidad del
lote de alimentos en tres categorías o clases de atributos: aceptable,
provisionalmente aceptable o marginal y rechazable. Se utilizan generalmente con los
microorganismos indicadores de higiene.

Para ello, se eligen dos niveles de recuentos (m y M).

Si el recuento de cualquier unidad de muestra es superior a M, el lote de alimentos no es

aceptable.

Tampoco es aceptable el lote si existen más unidades que las estipuladas en c, presentando
recuentos entre m y M.

La tercera opción es aceptar el lote marginalmente, cuando igual o menor cantidad de

unidades especificadas en c, tienen recuentos mayores que el valor m pero menores o iguales
al valor M.

Y la última alternativa es aceptar el lote cuando todas las unidades de muestra tienen valores
microbiológicos inferiores a m.