METODOLOGIA

1.1 AREA DE ESTUDIO

El presente estudio se llevó a cabo en 6 granjas de pequeña producción avícola,

ubicadas en la zona del Cañón del Combeima en la ciudad de Ibagué. Cada
granja se seleccionó por el método no probabilístico a disposición de los dueños
de las granjas y teniendo en cuenta que la cantidad de aves por lote fuera inferior
a los 1000. La granja 1 produce aproximadamente 50 pollos de engorde por lote y
se encuentra ubicada en la vereda Villa María; la granja 2 ubicada en la vereda
Llanitos, produce 600 aves; la granja 3 se encuentra ubicada en la vereda
Chapetón parte alta y produce menos de 70 pollos de engorde por lote; las granjas
4 y 5 con producciones inferiores a 50 pollos por lote, se encuentran ubicadas en
las veredas Astilleros y El Corazón respectivamente; y la granja 6 con
producciones superiores a 200 pollos por lote, se encuentra ubicada en Astilleros.

1.2 ENCUESTA

Con el objetivo de correlacionar los datos microbiológicos con el manejo de la

cama y el estado sanitario de las aves, se realizó una encuesta al propietario de
cada granja, antes de iniciar con los muestreos, donde se incluyeron variables
como medidas de bioseguridad, tipo de cama (nueva o usada), prácticas de
limpieza y saneamientos de las camas en caso de ser reutilizadas, estado
sanitario de las aves, uso de antibióticos y medicamentos (Anexo X).

1.3. RECOLECCION DE LA MUESTRA

La colecta de las muestras de cama en cada granja se llevó a cabo en tres etapas,
las dos primeras correspondientes al tiempo de ingreso de los pollos al galpón sin
importar su edad; etapa 1 (3 días) y etapa 2 (50 días o día de ayuno), y la tercera
etapa correspondiente a la cama como residuo, luego de haberle realizado algún
tratamiento. En las dos primeras etapas se seleccionaron 3 puntos de muestreos,
correspondientes a zonas próximas a los bebederos, comederos y rincones del
galpón; cada muestra se colectó con guantes estériles a una profundidad de 2 a 3
cm, sin raspar la superficie del suelo original; además se tomó una cuarta muestra
de arrastre con polainas estériles, donde se caminó por toda la cama de forma
zigzagueante hasta obtener una considerable cantidad de muestra. En la tercera
etapa, se colectaron 3 muestras del residuo de la cama, luego de haberla
sometido a algún tratamiento.

Las muestras colectadas se guardaron en bolsas ziploc y fueron llevadas al

Laboratorio de Microbiología y Micorrizas (LMM) de la Universidad del Tolima en
cajas de icopor refrigeradas para su procesamiento.

Durante los muestreos, se midió pH, temperatura (°C) y humedad (%) de la cama,
con el fin de correlacionar estos factores fisicoquímicos con la presencia de
Escherichia coli. Para determinar el pH, se pesaron 10g de muestra de cama y se
mezclaron en 90 mL de agua destilada, se agitó y se dejó reposar durante 30 min
para luego medir con un electrodo de pH metro. El registro de la temperatura (°C)
se midió in-situ en la cama en tres puntos del galpón con un termómetro aguja.
Para la medición del contenido de humedad se pesaron 10g de muestra de cama
y se colocaron en un horno a 121°C y después de las 24 horas se volvieron a
pesar; la perdida de peso se calculó con la siguiente formula:

Peso de muestra fresco-Peso de muestra seco

Humedad (%)= Peso de muestra seco *100

1.4. ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LA CAMA

1.4.1. Aislamiento e identificación de Escherichia coli en camas.

Para el pre-enrequecimiento se colocaron 10g de cama de pollos y se
suspendieron en 90 mL de agua peptonada buferada (BPW) para obtener una
proporción 1:10; las muestras se homogenizaron en Stomacher durante 20s y se
llevaron a incubación por 24h a 37°C. Posteriormente, se realizó el aislamiento
mediante siembra por agotamiento semicuantitativo por triplicado en agar
MacConkey y se llevó a incubación durante 24h a 37°C.

Para la identificación de E. coli, se seleccionaron las colonias presuntivas en agar

MacConkey y se subcultivaron en agar EMB, posteriormente se llevaron a
incubación durante 24h a 37°C. Las colonias que presentaron brillo metálico, típico
de E. coli, fueron resembradas por agotamiento en agar nutritivo para su
purificación.

La confirmación de las colonias positivas en EMB se realizó mediante las pruebas

bioquímicas de Indol (SIM), triple azúcar hierro (TSI), agar Simmons citrato (SC) y
lisina hierro agar (LIA) y mediante siembra por agotamiento en agar cromogénico
TBX.

1.5. PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

La prueba de sensibilidad se determinó mediante el método de Kirby-Bauer a los

aislados confirmados como Escherichia coli. Se emplearon 15 antibióticos usados
comúnmente en las producciones avícolas y en prácticas clínicas humanas. Los
antibióticos seleccionados fueron: β-lactámicos (Penicilina G: P 10µg; Ampicilina:
AMP 10 µg; Amoxicilina + Acido clavulánico: AMC 20/10 µg; Cefotaxima: CTX 30
µg; Ceftiofur: FUR 30 µg), Quinolonas (Ciprofloxacina: CIP 5 µg; Enrofloxacina:
ENR 5 µg; Acido nalidixico: NA 30 µg), Aminoglucósidos (Gentamicina: CN 10 µg;
Estreptomicina; S 10 µg), Tetraciclinas (Tetraciclina: TE 30 µg; Doxiciclina: DO 30
µg), Macrólidos (Eritromicina: E 15 µg), Polimixinas (Colistina: CT 25 µg) y
Sulfonamidas (Trimetoprima Sulfametoxazol (SXT: 25 µg).

A partir de agar nutritivo se seleccionaron de 3 a 5 colonias aisladas positivas de

E. coli y se inocularon en solución salina estéril hasta obtener una suspensión con
densidad de 0,5 en la escala de McFarland. La suspensión se inoculó en placas
de agar Mueller Hinton con un hisopo estéril mediante siembra masiva, sin dejar
zona libre. Posteriormente, se dejó secar cada placa y se colocaron los
sensidiscos de los antibióticos con pinzas estériles, presionándolos suavemente
para asegurar su contacto con la superficie del agar. Por placa se colocaron 5
sensidiscos y se llevaron a incubación durante 24h a 37°C. La lectura se realizó
midiendo los halos de inhibición y se interpretaron como sensibles, intermedios o
resistentes según la tabla de interpretación del Clinical and Laboratory Standards
Institute – CLSI, (2021). Cada placa se sembró por duplicado y como control de
calidad se utilizó la ATCC 25922 de Escherichia coli.

1.6. DETECCION E IDENTIFICACION DE GENES DE RESISTENCIA DE

Escherichia coli

1.6.1. Extracción de ADN de aislados resistentes. Se seleccionaron aislados de E.

coli resistentes a Cefotaxima para evaluar por PCR la presencia de los genes de
resistencia a beta-lactamasas de espectro extendido (BLEE). La extracción de
ADN se realizó mediante el método de lisis bacteriana, donde las colonias aisladas
fueron inoculadas en 5 mL de BHI durante 24h a 37°C, después se transfirieron
200 µl de cada aislado a tubos eppendorf estériles y se mezclaron con 800 µl de
agua estéril, seguidamente se llevaron a 95°C en ThermoMixer confort (eppendorf)
durante 10 minutos y se centrifugaron durante 5 minutos a 12000 rpm. Finalmente
se pasó el sobrenadante a un nuevo tubo y se guardó en refrigeración a -20°C
hasta su uso.

1.6.2. Detección e identificación de genes de resistencia. Los genes analizados

fueron blaCTX-M-F, blaCTX-M-1, blaCMY, blaTEM y blaSHV. Para el gen blaCTX-M-F la PCR se
realizó con una desnaturalización inicial de 94°C a 5 min, con 35 ciclos (30s de
denaturación a 94°C, 30s de anillamiento a 61°C, y 60s de extensión a 72°C)
después un paso de 5 min a 72°C. Para blaCTX-M-1 y blaTEM la PCR se realizó en 30
ciclos con una denaturación inicial de 95°C a 5 min (30s de denaturación a 94°C,
30s de anillamiento a 55°C, 60s de extensión a 72°C) después un paso final de 5
min a 72°C. Para el gen blaCMY la PCR se realizó en 35 ciclos con una
denaturación inicial de 94°C a 3 min (30s de denaturación a 94°C, 30s de
anillamiento a 58°C, 90s de extensión a 72°C) después un paso de 5 min a 72°C.
Para el gen blaSHV la
PCR se realizó con una desnaturalización inicial de 94°C a 5 min, con 30 ciclos
(30s de denaturación a 94°C, 30s de anillamiento a 55°C, y 60s de extensión a
72°C) después un paso de 5 min a 94°C. El procedimiento fuera realizado en un
volumen final de 12,5 µl, conteniendo 1µl de cada cebador, 3,25µl de agua
molecular, 1µl de ADN y 6,25 µl de la mezcla de mix para PCR anteriormente
mencionada.

Las amplificaciones fueron evaluadas mediante electroforesis en geles de agarosa

al 1% (TBE 0,5%) en una cámara electroforética horizontal a 90V durante 40 min.

1.7. ANALISIS ESTADISTICO

El análisis de los resultados obtenidos se realizó con el programa INFOSTAT. Con

los datos obtenidos se realizó la Prueba de Normalidad (Shapiro & Wilk).
 2. RESULTADOS

2.1. ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LA CAMA

2.1.1. Aislamiento e identificación de Escherichia coli en camas.

Se evaluó la presencia de E. coli en el medio Agar MacConkey seleccionando 990

colonias presuntivas (fermentadoras de lactosa) provenientes de las seis granjas
evaluadas. De estos aislados, 598 (60,4%) mostraron brillo metálico en EMB
(Figura X a) y 403 (40,7%) se clasificaron como presuntivas mediante pruebas
bioquímicas como SIM (+), TSI (+), LIA (+) y SC (-) (Figura X b); estos aislados se
sembraron en Agar Cromogénico TBX y se confirmaron 147 (14,84%) cepas de E.
coli del total de las colonias presuntivas aisladas.

Figura X. a. Presencia de brillo metálico en aislados presuntivos seleccionados del

Agar MacConkey. b. Presuntivos de E. coli en pruebas bioquímicas (SIM (+), TSI
(+), LIA (+), y SC (-)).

Fuente: Autor
De las 598 cepas aisladas en el medio EMB, 403 se confirmaron como presuntivas
mediante pruebas bioquímicas, encontrando la mayor presencia de estas en las
granjas 2, 4 y 6, y la menor presencia en la granja 1 (Figura X); de estas
presuntivas solo se confirmaron como Escherichia coli 147 cepas en el medio TBX
cromogénico (Figura X), evidenciándose una mayor presencia en la granja 3
(21,08%), seguida de la granja 5 (17,68%), la granja 4 (17,0%), la granja 1 (15,64),
la granja 6 (14,96%) y finalmente una menor presencia en la granja 2 (13,60%).

Figura X. Cepas de E. coli presuntivas mediante pruebas bioquímicas por granja y

etapa evaluada.

80

70

60
N° cepas presuntivas

50

40

30

20

10

0
G1 G2 G3 G4 G5 G6

Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3

Figura X. Cepas de E. coli confirmadas en el medio TBX cromogénico.

 35

30

N° CEPAS CONFIRMADAS
25

20

15

10

0
G1 G2 G3 G4 G5 G6

Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3

2.2. PARÁMETROS FISICOS DE LA CAMA

Los parámetros físicos evaluados fueron humedad, pH y temperatura. En la tabla

X se muestran los valores para cada granja y etapa, mostrando que el pH de las 6
granjas se mantuvo en el rango óptimo para el crecimiento de Escherichia coli. La
temperatura de la cama en las seis granjas oscilo entre los 28°C y 52,3°C, esta
última temperatura registrada en la etapa 3 de la granja 1, siendo la única
temperatura mayor a 50°C respecto a las demás etapas y granjas. En cuanto a la
humedad, esta oscilo en un rango de 22,1% a 81,98%.

Tabla X. Parámetros fisicoquímicos de la cama en las seis granjas evaluadas.

Granja Etapa Temperatura °C Humedad % pH

1 1 35,5 25,7 5,52
2 34 36,71 7,31
3 52,3 29,36 7,09
2 1 40,5 46,9 5,8
2 38 34,09 7,07
3 30 22,1 7,13
3 1 30 42,56 6,71
2 29,8 50,97 7,24
3 29,3 32,76 7
4 1 32,3 37,59 6,68
2 31 46,02 6,6
3 29,6 81,98 6,49
5 1 28 34,24 5,63
2 38 58,3 6,98
 3 36 51,59 7,02
6 1 37,6 40,18 7,07
2 36 36,99 7,48
3 31,3 64,67 7,61

2.3. PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

Se realizó la prueba de susceptibilidad antimicrobiana a las 147 cepas

confirmadas como Escherichia coli en el medio TBX cromogénico con 15
antimicrobianos de importancia en medicina veterinaria y humana (Figura X).
Como control de calidad se tomó la cepa de E. coli ATCC 25922 (Figura X).

Figura X. Resistencia fenotípica del aislado G2E1B9 (Escherichia coli)

Fuente: Autor

Figura X. Antibiograma cepa control E. coli ATCC 25922

 Fuente: Autor

El 90,48% (133) de las cepas mostraron multiresistencia a 3 o más de 3

antibióticos. Se encontró que el 100% de los aislados mostraron resistencia a
penicilina G (P) de la familia de Betalactámicos, el 80,95% mostró resistencia a la
tetraciclina (TE) de la familia de Tetraciclinas y el 61,9% mostró resistencia a la
eritromicina (E) de la familia de Macrólidos, respecto a los demás antibióticos
evaluados, se puede observar la resistencia fenotípica de los perfiles de
resistencia en la Tabla X.

En cuanto a las familias de antibióticos evaluados, el 61,9% de los aislados mostró

resistencia a la familia de los macrólidos (E), el 57,14% a las tetraciclinas (TE y
DO), el 53,74% a las sulfonamidas (SXT), el 37,82% a los Betalactámicos (P,
AMP, AMC, CTX y FUR), el 21,77% mostró resistencia a la familia de Quinolonas
(CIP, ENR y NA), el 16,67% a los Aminoglucósidos (CN y S) y el 1,36% a las
Polimixinas (CT) (Figura x).

Respecto a los antibióticos Betalactámicos, el 100% de los aislados mostró

resistencia a la penicilina G (P), el 55,1% a ampicilina (AMP), el 21,8% a
amoxicilina + AC (AMC), el 10,9% a cefotaxima (CTX) y el 1,36% a ceftiofur
(FUR).

Tabla X. Resultados de la resistencia fenotípica de los aislados de E. coli

obtenidos de las granjas avícolas.

Antibiótico Concentración Diámetro de la zona de Número de

(µg) inhibición (mm) microorganismos E. coli
S I R S I R
CTX* Cefotaxima 30 ≥26 23-25 ≤22 131 0 16
CIP* Ciprofloxacina 5 ≥26 22-25 ≤21 58 52 37
FUR** Ceftiofur 30 ≥21 18-20 ≤17 142 3 2
CT** Colistin 25 ≥13 ≤12 145 0 2
E* Eritromicina 15 ≥16 11-15 ≤10 15 41 91
S* Estreptomicina 10 ≥15 12-14 ≤11 41 70 36
AMP* Ampicilina 10 ≥17 14-16 ≤13 49 17 81
P** Penicilina G 10 ≥ ≤22 0 0 147
 NA* Ácido nalidico 30 ≥19 14-18 ≤13 49 62 36
CN* Gentamicina 10 ≥15 13-14 ≤12 122 12 13
TE* Tetraciclina 30 ≥15 12-14 ≤11 18 10 119
DO* Doxiciclina 30 ≥14 11-13 ≤10 50 48 49
ENR** Enrofloxacina 5 ≥23 17-22 ≤16 74 50 23
SXT* Trimetoprim 25 ≥16 11-15 ≤10 67 1 79
sulfametoxazol
AMC* Amoxicilina + 20-10 ≥18 14-17 ≤13 93 22 32
Acido
clavulánico
* Interpretación del diámetro de inhibición de acuerdo a CLSI 2021
** Interpretación del diámetro de inhibición de acuerdo a EUCAST y artículos científicos
relacionados.

Figura X. Perfiles de susceptibilidad antimicrobiana de todos los aislados

provenientes de las seis granjas evaluadas.

Abreviaturas: Ma: Macrólidos, Te: Tetraciclinas, Sul: Sulfonamidas, Be:

Betalactámicos, Qui: Quinolonas, Ami: Aminoglucósidos, Po: Polimixinas.

Se encontraron aislados resistentes a más de tres antibióticos del total de los

evaluados en las seis granjas. En la granja 1, de los 23 aislados, el 100% mostró
resistencia a P (100%), el 95,65% a E y el 73,91% a TE y los menores porcentajes
de resistencia se presentaron en los antibióticos CTX y DO (4,35%) y en FUR, CT
y AMC, no se presentó resistencia alguna (Figura Xa). En la granja 2, de los 20
aislados, el 100% mostró resistencia a P, el 85% a E y el 80% a TE; la menor
resistencia la tuvieron con CTX (15%), CN (10%), FUR (5%) y con CT y AMC no
presentaron resistencia (Figura Xb). En la granja 3, de los 31 aislados, el 100%
mostró resistencia a P, seguido de TE (93,54%) y E (74,19%), y la menor
resistencia la tuvieron con los antibióticos CIP Y ENR (6,45%), CT (3,22%) y FUR
(0%) (Figura Xc). En la granja 4, de los 25 aislados, el 100% mostró resistencia a
P, el 80% a TE y el 72% a SXT; el 4% mostro resistencia a CTX, CIP, NA y CN, y
los antibióticos a los que presentaron resistencia nula (0%) fueron FUR y CT
(Figura Xd). En la granja 5, de los 26 aislados, el 100% tuvo resistencia a P, el
88,46% a TE y el 50% a E y AMP, la menor resistencia se presentó con los
antibióticos FUR y CT (3,84%) (Figura Xe). Finalmente, para la granja 6, de los 22
aislados, el 100 % tuvo resistencia a P, el 63,63% a TE y SXT, el 50% a E y AMP;
la menor resistencia la presentaron con los antibióticos CN (9,09%) y FUR y CT
(0%) (Figura Xf).

Figura X. Resistencia fenotípica de aislados de las granjas 1, 2, 3, 4, 5, y 6.

a b

c d
 e f

2.4. IDENTIFICACION DE GENES DE RESISTENCIA A BETALACTAMASAS DE

ESPECTRO EXTENDIDO

De las 147 cepas aisladas, se seleccionaron las 16 cepas que mostraron

resistencia a CTX para la identificación de genes de resistencia a Betalactamasas
de espectro extendido (BLEE), de las cuales: 1 fue de la granja 1, 3 de la granja 2,
3 de la granja 3, 1 de la granja 4, 3 de la granja 5 y 5 de la granja 6 (Tabla X).

El gen blaCTX-M-F de 592 pb fue encontrado en 3 de las 16 cepas (Figura X), al igual
que el gen blaCTX-M-1 de 944 pb (Figura X). Los aislados positivos para estos genes
corresponden a aquellos que mostraron una resistencia fenotípica a CTX menor a
10 mm de diámetro en el halo de inhibición observado en el antibiograma. En
cuanto al resto de genes evaluados, no se encontró en ninguno de los aislados.

Tabla X. Resistencia fenotípica y genotípica de los 16 aislados seleccionados para

la detección de genes.

GRANJ AISLADO RESISTENCIA RESISTENCIA GENOTIPICA

A FENOTIPICA
G1 G1E3M1- CTX, E, P
13
G2 G2E1B9 CTX, CIP, FUR, E, S, blaCTX-M-F, blaCTX-M-1
AMP, P, NA, CN, TE,
ENR, SXT
G2E1C10 CTX, E, S, AMP, P, NA, blaCTX-M-F, blaCTX-M-1
CN, TE, DO, SXT
G2E1C12 CTX, E, AMP, P
G3 G3E1A4 CTX, E, S, AMP, P, TE,
SXT
G3E2R9 CTX, E, P, TE, DO
 G3E2A3 CTX, CIP, E, AMP, P, NA,
TE, ENR, SXT, AMC
G4 G4E1A1 CTX, E, S, AMP, P, TE,
DO, SXT
G5 G5E1A4 CTX, FUR, S, AMP, P, blaCTX-M-F, blaCTX-M-1
NA, CN, TE, DO
G5E2B7 CTX, S, AMP, P, TE, SXT,
G5E2C12 CTX, E, P
G6 G6E1C14 CTX, CIP, E, AMP, P, NA,
SXT, AMC
G6E2R6 CTX, AMP, P
G6E2B6 CTX, CIP, E, S, P, NA, TE
G6E2B11 CTX, P, TE, SXT
G6E3M2- CTX, AMP, P, CN, TE,
15 AMC

Abreviaturas: G: Granja, E: Etapa, M1: Muestra 1, M2: Muestra 2, B: Bebedero, C:

Comedero, R: Rincones, A: Arrastre, CTX: Cefotaxima, E: Eritromicina, S:
Estreptomicina, FUR: Ceftiofur, AMP: Ampicilina, TE: Tetraciclina, P: Penicilina,
CIP: Ciprofloxacina, NA: Acido nalidico, CN: Gentamicina, DO: Doxiciclina, SXT:
Trimetoprim sulfametoxazol, AMC: Amoxicilina + Acido clavulánico, ENR:
Enrofloxacina.

Figura X. Confirmación por PCR del gen blaCTX-M-F en los aislados de E. coli.

592 pb

Figura X. Confirmación por PCR del gen blaCTX-M-1 en los aislados de E.coli.

944 pb 944 pb
1013
800
600
450
300
200
100
2.5. RELACION ENTRE LAS MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD EN LA GRANJA
CON LA PRESENCIA DE E. coli RESISTENTE

Se realizó una encuesta previa al muestreo en cada granja, con el fin de conocer
las medidas de bioseguridad, tipo de cama que se usa, el estado sanitario de las
camas durante y después del ciclo productivo, control de vectores, control de
factores fisicoquímicos, uso de antibióticos, entre otros aspectos (Tabla X), para
relacionarlos con la presencia o ausencia de E. coli resistente.

Tabla X. Respuestas a la encuesta sobre prácticas de bioseguridad en cada

granja.

Encuesta Granja 1 Granja 2 Granja 3 Granja 4 Granja 5 Granja 6

Edad a que ingresan las

1 1 >15 (30) >15 (30) 1 1
aves

Aves por lote 52 600 ≤70 ≤50 ≤50 ≥200

Reutiliza Reutiliza
Cama nueva o Reutilizada
Nueva da (4 Nueva da (2 Nueva
reutilizada / ciclo (2 ciclos)
ciclos) ciclos)
Cascarilla
Cascarill
de arroz- Cascarilla Cascarilla Cascarilla Cascarilla
Material de la cama a de
Viruta de de arroz de arroz de arroz de arroz
arroz
madera

Apilamiento
Cal y
Cal y Cal, /
Se aplica a desinfectan
desinfect desinfectan Fermentaci
Saneamiento de la cultivos y tes
antes tes cal ón, cal y
cama luego se comerciales
comercia comerciales desinfectan
fumiga (Resoirox y
les y formol tes
yodo)
comerciales

20 a 30
Tiempo de vacío 15 días ≤5 días ≤ 10 días ≤10 días ≤ 15 días
días
Normas Lavabotas NO SI SI SI NO SI
de a la
biosegurid entrada el
ad galpón
 Unidades
de lavado NO SI SI NO NO SI
de mano
Desinfecci
ón de
equipos a NO SI SI SI NO SI
la entrada
del galpón
Uso de
ropa
exclusiva NO SI SI NO NO SI
para la
granja
Control de
NO SI SI NO NO SI
vectores
Corte de
maleza SI SI SI SI SI SI
aledaña
Uso de
guantes,
gorro, NO SI NO SI SI SI
botas y/o
tapabocas
Lavado de
manos al
NO SI NO SI SI SI
ingreso
del galpón
Control de factores
NO SI NO NO NO SI (T°)
fisicoquímicos
Análisis microbiológico
NO NO NO NO NO NO
de la cama
Uso de antibióticos SI SI NO NO NO SI