Departamento de Industrias Alimentarias

IES Gregorio Prieto Cromatografía

La cromatografía es un conjunto importante de técnicas que permiten la separación de los

componentes de una mezcla compleja. La cromatografía es un método físico de separación
basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija
o estacionaria y otra móvil.

En todas las separaciones cromatográficas la muestra se disuelve en una fase móvil, que puede
ser un gas un líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar a través de una
fase estacionaria inmiscible, la cual se mantienen fija en una columna o sobre una superficie
sólida. Las fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen de
modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son
retenidos con más fuerza por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo; por el
contrario los componentes que unen débilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez.
Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en
bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente.
▪ Clasificación de las técnicas cromatográficas.
1ª clasificación: Atendiendo a la fuerza responsable de la separación.
Cromatografía de adsorción.
En este caso la FE es un sólido adsorbente. Los sólidos disueltos en la FM van siendo
adsorbidos por la FE. La disolución de la FM se va empobreciendo gradualmente en los solutos
que están siendo retenidos. Las fuerzas responsables de la retención son de tipo Van der
Waals.
Cromatografía de partición o de reparto.
Las fuerzas de retención de los distintos solutos se basan en la diferente solubilidad de los
solutos en ambas fases miscibles, que pueden ser: Ambas líquidas ó FM gaseosa y FE líquida
Cromatografía de intercambio iónico.
Las fuerzas que retienen las moléculas en la fase estacionaria son de tipo electrostáticas.

La FE es una resina sólida, donde la superficie de su red tiene unos grupos cargados positiva o
negativamente, Así son denominadas catiónicas o aniónicas respectivamente.
Los solutos cargados se intercambian con el ión que retiene la resina.
2ª Clasificación: Atendiendo a la naturaleza de la FM y FE

FM: gaseosa FE: Líquido Cromatografía gaseosa de partición

Cromatografía de Cromatografía gaseosa de adsorción

gases FE: Sólido

FE: sólido C. Líquida de

adsorción
Columna
FE: Líquido C. Líquida de
partición
FM: Líquido
Papel

Plana Gel

Capa fina

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1. Cromatografía líquida:

1.1. Cromatografía en columna.

La FE se mantiene dentro de un tubo estrecho, por el que se hace pasar la FM. Inicialmente
para que la FM pasase a través de la FE se utilizaba la fuerza de la gravedad. Actualmente
la FM se hace pasar por la columna que retiene la FE a presión, disminuyendo los
problemas de lentitud que se daban al principio.
Existen tres metodologías de trabajo para este tipo de cromatografías:
• El desarrollo se lleva a cabo por elución.
Es el método más utilizado y consiste en
introducir la muestra disuelta en una pequeña
proporción de disolvente por la parte superior
de la columna. Seguidamente de forma
contínua, va introduciéndose la FM, de tal
manera que se van arrastrando los diferentes
componentes de la muestra en función de su
coeficiente de distribución. A Mayor coeficiente
de distribución mayor es la retención de los
componente y más lento será el desplazamiento
(𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜)𝑒𝑠𝑡𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑎𝑟𝑖𝑎
𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑠𝑡𝑟𝑖𝑏𝑢𝑐𝑖ó𝑛 =
(𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜)𝑚ó𝑣𝑖𝑙
• Frontal
10 Este tipo de desarrollo se emplea
con fines cualitativos y
composición

A+B+C
cuantitativos, y a veces con fines
5 A+B
A preparatorios.
Consiste en adicionar
0 continuamente la disolución de la
tiempo muestra. Como la constante de
distribución de los diferentes
componentes de la muestra es distinta la concentración en los distintos
componentes irá variando al salir de la columna.
En primer lugar saldrá de la columna una mezcla con mayor concentración del
soluto menos retenido por la FM, después una mezcla con el soluto menos
retenido y el siguiente, y por último una mezcla de los tres solutos.
• Desarrollo por desplazamiento.
La muestra se introduce en una columna, pero a diferencia del primer método,
pero a diferencia del otro método, la FM tiene un nuevo componente que es más
retenido que los otros componentes de la muestra, por tanto los desplaza y fuerza
su salida de la columna. En este caso los componentes salen en orden creciente de
su relación de distribución.
Al final de la columna se sitúa un detector que recoge las señales en función del tiempo o del
volumen de FM, obteniendo un gráfico con una serie de picos que se denomina cromatograma.
Se define el tiempo de retención para un determinado soluto como el tiempo en el cual se
alcanza la máxima concentración del pico cromatográfico.

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Para definir la eficacia de una columna, se utilizan los términos: Número de platos teóricos (N)
y altura de plato (H). Cuanto más altura tiene la columna el número de platos teóricos será
mayor.
El plato teórico sería el lugar donde se establece el equilibrio entre la FM y FE.

2. Cromatografía de gases.

La FM se encuentra en estado gaseoso.

La muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de la columna cromatográfica y la elución se

produce por el flujo de la FM (gas inerte), que tiene como única función transportar los analitos
a través de la columna.

Las cromatografía de gases tiene limitaciones en dos casos concretos:

▪ compuestos poco volátiles, generalmente los de peso molecular superior a 300 u.m.a.
▪ compuestos sensibles a una elevación de la temperatura incluso moderada (determinados
compuestos de interés biológico)
▪ compuestos que se encuentran en forma iónica (puesto que son e n general poco volátiles)
Por esta razón, la cromatografía de gases se emplea cuando los componentes de la mezcla
problema son volátiles o semivolátiles y térmicamente estables a temperaturas de hasta 350-
400ºC. En cambio, cuando los compuestos a analizar son poco volátiles y/o termolábiles, la
técnica separativa adecuada suele ser la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
A menudo la cromatografía de gases se emplea para confirmar de la presencia o ausencia de un
compuesto en una muestra determinada.

Existen dos tipos de cromatografía de gases:

Gas- sólido: cromatografía de adsorción. Debido a que el proceso de adsorción es

semipermanentel, se obtienen picos con cola, lo que hace que su utilidad quede limitada a la
separación de especies gaseosas de bajo peso molecular.

Gas-líquido: cromatografía de partición. Como FE se utiliza un líquido soportado sobre un

sólido.

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2.1. Componentes de un cromatógrafo de gases.

• Gas portador: Debe ser inerte, fácilmente disponible y
puro, económico y adecuado para el detector del
cromatógrafo. Normalmente en balas o generadores.
• Sistemas de manómetros y reguladores de flujo que
permitan un suministro constante y regular.
• Sistema de inyección de la muestra: microjeringa
• Columna: las columnas pueden ser de dos tipos:
2.1..1. Empaquetadas o de relleno. consisten en unos
tubos de vidrio, metal (inerte a ser posible como el acero inoxidable, níquel,
cobre o aluminio) o teflón, de longitud de 2 a 3 metros y un diámetro
interno de unos pocos milímetros, típicamente de 2 a 4. El interior se rellena
con un material sólido, finamente dividido para tener una máxima
superficie de interacción y recubierto con una capa de espesores entre 50 nm
y 1 μm. Para que puedan introducirse en el horno, se enrollan
convenientemente.
2.1..2. Tubulares abiertas o capilares. De mayor rapidez y eficiencia, de 2 a 60
metros de longitud, enrolladas helicoidalmente para ser introducidas en un
horno.
• Detector: debe tener una respuesta lineal con la cantidad de analito, elevada
sensibilidad, tiempo corto de respuesta, amplio intervalo de temperatura de
trabajo, medidas estables y reproducibles, etc. Hay diferentes tipos: de captura
electrónica, de ionización de llama, etc.

2.2. Aplicaciones de la cromatografía de gases.

• Medioambientales: Análisis de pesticidas y herbicidas, análisis de hidrocarburos,

semivolátiles y volátiles, análisis del aire...
• Alimentos y aromas: fragancias y aromas, aceites, bebidas, ácidos orgánicos,
azúcares, FAMES, ésteres metílicos, triglicéridos, alcoholes...
• Química Industrial: alcoholes, ácidos orgánicos, aminas,aldehídos y cetonas,
ésteres y glicoles, hidrocarburos, disolventes, anilinas, gases inorgánicos...

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• Biociencia: drogas, fármacos, alcoholes y contaminantes en sangre, disolventes
residuales...
• Derivadas del petróleo: gas natural, gases permanentes, gas derefinería, gasolinas,
gasóleos, parafinas...

3. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que
contiene a la fase fija. La separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones
específicas entre las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y estacionaria.
A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento
(HPLC, de high-performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la
estabilidad térmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles,
materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso
molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para
la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de
estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.
HPLC preparativa
Es la técnica escogida para aislamiento y purificación de productos de valor en las industrias
químicas y farmacéuticas así como en la biotecnología y la bioquímica. La cromatografía
preparativa comprende un amplio rango de aplicaciones, desde el aislamiento de 1µg de
muestra para identificación espectroscópica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una
mezcla de 100 g.

3.1. Aplicaciones

Campos de Aplicación de HPLC

• Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos

• Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
• Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas,
aditivos
• Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos,
propulsores, colorantes
• Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
• Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
• Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina,
estrógenos.

Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa

• Separación y purificación de metabolitos

• Separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes de
muestras de orina
• Purificación y separación de enantiómeros
• Purificación de compuestos naturales
• Purificación y caracterización de enzimas y proteínas.

Azucena Camacho Villalta

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