Cromatografia Papel y Capa Fina

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUA
FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE QUIMICA
DIPLOMADO EN TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS: ANÁLISIS

AGROALIMENTARIO Y AMBIENTAL
MODULO6: CROMATOGRAFIA DE COLUMNA (CC), PAPEL

(PC) Y CAPA FINA (TLC).
Dr. Sergio José López Grío
León, Febrero de 2014

Comprender las cosas que nos rodean es la mejor
preparación para comprender las cosas que hay más
allá.
Hipatia (370- 415) Filósofa y matemática egipcia.
ALGUNOS CONCEPTOS A CONSIDERAR
La cromatografía es una técnica de separación de mezclas de
sustancias que se basa en la diferencia de velocidad con la que se
mueven cada uno de los componentes de una mezcla a través de
un medio poroso (fase estacionaria) arrastrados por un disolvente
en movimiento (fase móvil).
El fluido que pasa a través de la fase estacionaria se denomina

eluyente y al fluido que sale de ésta se denomina eluato.
El proceso de paso de un líquido o un gas a través de una fase

estacionaria se denomina llama elución.
3
ALGUNOS CONCEPTOS A CONSIDERAR
Es importante mencionar que en cromatografía se usa
indistintamente la definición de disolvente y eluyente, sin
embargo estos son diferentes.
El DISOLVENTE es capaz de disolver la muestra objeto de análisis

mientras que el ELUYENTE es quien arrastra a los componentes
de la muestra a través de la fase estacionaria.
4
CLASIFICACIÓN DE LOS DISTINTOS TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
Los tipos de cromatografía se pueden clasificar en base a:

1. EL ESTADO FÍSICO DE LA FASE MÓVIL
2. LA CONFIGURACIÓN DEL LECHO CROMATOGRÁFICO
3. EL MECANISMO DE SEPARACIÓN
1. SEGÚN EL ESTADO FÍSICO DE LA FASE MÓVIL

Aquí cabe incluir tres tipos de cromatografías:
• Cromatografía de gases (CG)
• Cromatografía de líquidos (CL)
• Cromatografía de fluidos supercríticos (CFS)
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2. SEGÚN LA CONFIGURACIÓN DEL LECHO CROMATOGRÁFICO

a) CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA: Es una técnica de separación en
la que el lecho estacionario está dentro de un tubo. Las partículas de
la fase estacionaria sólida, o del soporte recubierto con la fase
estacionaria líquida, pueden llenar el volumen interno del tubo
(columna rellena), o concentrarse sobre o a lo largo de la pared
interna del tubo, dejando un camino abierto sin restricción, en la parte
media, por el que circula la fase móvil (columna abierta). El flujo de la
fase móvil (líquido o gas) a través de la estacionaria se consigue: por
presión, por capilaridad o por gravedad.
b) CROMATOGRAFÍA PLANA: Es una técnica de separación en la que

la fase estacionaria es un plano o está sobre un plano. Este plano
puede ser un papel utilizado como tal, o impregnado con una
sustancia a modo de lecho estacionario (cromatografía en papel, PC),
o bien una capa de partículas sólidas que recubren un soporte, como
por ejemplo una placa de vidrio (cromatografía en capa fina, TLC).
6
En el caso de la Cromatografía plana, el flujo de la fase móvil
puede conseguirse de dos formas:
a) Por capilaridad, en el que podemos encontrar una
configuración: cromatografía horizontal u ascendente, en el que
flujo de fase móvil asciende a través de la fase estacionaria.
b) Por capilaridad y gravedad, en el que podemos encontrar una

configuración: cromatografía descendente, en el que flujo de
fase móvil desciende de la fase estacionaria por el influjo de la
capilaridad y la gravedad. (cromatografía descendente)

En la cromatografía plana queda excluido el uso de un gas como
fase móvil, por lo que ésta siempre es líquida.
7
3. SEGÚN EL MECANISMO DE SEPARACIÓN

a) Cromatografía de adsorción.
b) Cromatografía de reparto.
c) Cromatografía de intercambio iónico.
d) Cromatografía de exclusión.
e) Cromatografía de afinidad.
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Es un tipo de cromatografía en la que el lecho estacionario está

contenido dentro de un tubo.
Las partículas de fase estacionaria sólida, o de soporte recubierto con

una fase estacionaria líquida, pueden llenar por completo el tubo
(Columna Tubular Empaquetada) o estar concentradas sobre o a lo
largo de su pared interna, dejando una ruta abierta, no restringida,
para el paso de la fase móvil por el centro del tubo (Columna Tubular
Abierta).

La cromatografía en columna es una de las técnicas más ampliamente
aplicadas. Es la variante más antigua de la cromatografía, aunque su
importancia práctica sólo ha sido reconocida cuando su desarrollo, fue
catalizado por el de la cromatografía de gas y alcanzó el nivel que
actualmente conocemos como cromatografía líquida de alta eficacia o
alta resolución (HPLC).
9
CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA: PRINCIPIOS BÁSICOS
En cromatografía en columna, las fuerzas que dan origen a una retención
selectiva entre los analitos son debidas a la adsorción (retención del
soluto por parte de los grupos moleculares activos de la superficie
de un sólido) de éstos sobre el relleno de la fase estacionaria.

El mecanismo de separación obedece a fuerzas de retención por parte de
grupos activos del relleno sólido (fase estacionaria) que actúan de
manera diferencial con los analitos que están en la fase móvil.
El mecanismo se basa en la formación de un complejo analito-relleno

(X-Y)s, que expresado químicamente sería:
Donde:
• Xm = al analito X en la fase móvil
• Ys = son los grupos moleculares activos en el relleno, es decir, los
centros adsorbentes en la fase estacionaria
• (X-Y)s = es el adsorbato generado durante la retención del analito X.
10
DESPLAZAMIENTO EN CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
En cromatografía en columna existen dos métodos para lograr que los

compuestos pasen a través de la columna estos son:
• DESPLAZAMIENTO
DESPLAZAMIENTO: La solución que
• ELUSIÓN
contiene a los compuestos a separar es
agregada en la parte superior de la
columna y en el caso de dos compuestos A
y B, estos son adsorbidos fuertemente por
la columna. Si B es mas fuertemente
adsorbido que A, entonces al añadir un
solvente C, el compuesto A eluye mas
rápidamente que B y debido a que B es
readsorbido en los sitios próximos del
material inerte, esto fuerza a que A vaya
desplazándose mas rápidamente. Si
agregamos mas solvente C esto hace que
desplace a B y a su vez este desplace a A.
Las bandas formadas son en general
uniformes en concentración con la
excepción de pequeñas regiones entre las
bandas de alta pureza. 11
DESPLAZAMIENTO EN CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
ELUSIÓN: Cuando una solución
consistente de una mezcla de A y B, es
agregada en la parte superior de la
columna y la fase móvil es añadida los
componentes empiezan a bajar por la
columna y se distribuyen en la fase
estacionaria y la fase móvil.
Si mas del compuesto B se disuelve en la

fase estacionaria que A, entonces B
empezará a retrasarse respecto a A
después de un corto tiempo.
Esto es porque A no puede permanecer

retrasado tanto, y entonces baja de la
columna rápidamente. En este caso el
perfil de las bandas muestra que la
concentración no es la misma durante el
desplazamiento hasta la completa
separación de A de B. Este tipo de método
es preferido para el análisis cuantitativo.
12
INSTRUMENTACIÓN EN CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
En esta modalidad de cromatografía la fase estacionaria está
empaquetada en un recipiente cilíndrico de plástico, vidrio o metal abierto
por los extremos, llamado columna. El diámetro interno de las columnas
en cromatografía líquida convencionales es de aproximadamente de 10 a
15 mm.
El relleno de la columna se denomina lecho cromatográfico y empaquetar

la columna es la operación de prepararlo. La fase móvil fluirá por la
estructura porosa del lecho, y el flujo de la fase móvil dependerá de la
gravedad o de una bomba peristáltica de baja presión.
La disolución problema, disuelta previamente en la fase móvil, se

depositará sobre la parte superior del lecho, y se dejará que vaya fluyendo
hacia su interior, manteniendo el extremo opuesto de la columna abierto.
Cuando toda la solución de muestra ha penetrado, se adiciona fase móvil

sobre el lecho para evitar que éste se seque. El paso de fase móvil a
través de la columna se llama elución
13
Figura de Separaciones de bandas en cromatografía en columna
14
Los equipos de cromatografía convencional constan de un depósito que contiene
el eluyente conectado a la columna en la que se encuentra el lecho cromatográfico
y de la cual se recogen los eluatos conforme van saliendo de la columna; los
eluatos son fraccionados y recogidos por el operario o mediante un colector de
fracciones.

La diferencia de alturas entre el recipiente que contiene el eluyente y la recogida
de la muestra produce una presión hidrostática que es la que conduce el flujo de
la fase móvil. Cuando la columna es larga, el lecho cromatográfico ofrece una
mayor resistencia al paso de eluyente; en estos casos es necesario utilizar una
bomba peristáltica de baja presión.

El colector de fracciones está constituido por una célula fotoeléctrica sobre la que
incide un fino haz de luz. Cuando las gotas de eluato interceptan el rayo óptico se
genera una señal eléctrica que permite programar la recogida de alícuotas de
eluyente de forma automática. La detección de los solutos que emergen de las
columnas se realiza midiendo la absorbancia del eluato mediante un
espectrofotómetro.
Los datos de la absorbancia permiten obtener el perfil de elución.
15
16
MATERIALES DE RELLENO DE LAS COLUMNAS
El empaquetamiento de la columna es posible realizarlo con diversos
materiales entre otros tenemos:
 Tierras de relleno  Carbonato de potasio
 Carbón de leña  Carbonato de sodio
 Alúmina activada  Talco
 Magnesio silicato  Insulina
 Silica gel  Almidón
 Oxido de calcio  Azúcar en polvo (sacarosa)
 Oxido de magnesio  Sephadex
 Carbonato de calcio  Polisacáridos
 Fosfato de calcio  Otros polímeros sintéticos
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El empaquetamiento de la columna es posible realizarlo con diversos
materiales entre otros tenemos:
 Tierras de relleno  Carbonato de potasio
 Carbón de leña  Carbonato de sodio
 Alúmina activada  Talco
 Magnesio silicato  Insulina
 Silica gel  Almidón
 Oxido de calcio  Azúcar en polvo (sacarosa)
 Oxido de magnesio  Sephadex
 Carbonato de calcio  Polisacáridos
 Fosfato de calcio  Otros polímeros sintéticos
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Entre los solventes más frecuentemente utilizados están los siguientes:
 Éter de petróleo 30-50°
 Tetracloruro de carbono
 Ciclohexano
 Éter etílico
 Acetona
 Benceno
 Tolueno
 Esteres de ácidos orgánicos
 1,2-dicloro etano, dicloro metano, cloroformo
 Alcoholes
 Agua (varia con el pH y la concentración de sales)
 Piridina
 Ácidos orgánicos
 Mezclas de ácidos y bases con agua, alcohol o piridina
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SISTEMAS CROMATOGRAFICOS RECOMENDADOS PARA DIVERSAS
SEPARACIONES
SUSTANCIA ADSORBENTE SOLVENTE
Alúmina Agua
Aniones inorgánicos
8-Hidroxiquinolina Agua
Enzimas Bauxita Agua
Azucares Bauxita Agua
Ceniza de hueso Agua
Flavinas Frankonita Agua
Antiocinas Alúmina Agua
Alcaloides Alúmina Benceno o agua
Aminoácidos Titania Agua
Clorofilas Sacáridos Éter de petróleo o benceno
Citrato de magnesio Éter y éter de petróleo
Nitro compuestos Talco Benceno
Ácidos orgánicos Talco Benceno
Fenoles Cal Alcoholes
Alúmina Benceno
Esteres, cetonas y éteres Alúmina Éter de petróleo o benceno
Xantofilas Alúmina Benceno
Magnesia 1,2-Dicloro etano
Alcoholes alifáticos y esteroles Alúmina Éter de petróleo o benceno
Hidrocarburos insaturados Cal, Éter de petróleo
Alúmina Tetracloruro de carbono
Magnesia Benceno
Hidrocarburos saturados Alúmina Éter de petróleo
Magnesia Éter de petróleo
20
ECUACIONES DE CALCULO
El área de la columna se calcula de la forma siguiente:
A = Ai + As + A m
Donde A es el área de la columna, Ai es el área de la fase inerte, As es el
área de la fase estacionaria y Am es el área de la fase móvil, en cm2.
El coeficiente de reparto (K) del analito o compuesto entre el lecho poroso

(fase estacionaria) y la fase móvil se calcula así:
Concentrac ión de compuesto en fase estacionar ia
K 
Concentrac ión de compuesto en fase móvil
Por otra parte el factor de retardo o retención (Rf), que en este caso es la
relación de la distancia del soluto movido respecto a la distancia de
introducción de la fase móvil. Se calcula como:
Am * H Am
RF  
Vb Am  KAs
21
Donde H es la altura efectiva de platos teóricos, Vb es el volumen efectivo
de platos en cm3 . Este se puede calcular de la forma siguiente:
Vb  H ( Am  KAs )
EJEMPLO 1: Para la separación de acetil prolina y acetil fenilananina, se
usó una columna de 1 cm de diámetro de 20 cm de largo conteniendo 5
gramos de silicagel, 3.5 ml de agua y 10 ml de cloroformo. La mezcla se
eluyó usando cloroformo: butanol (99:1).
La densidad de la silicagel es de 2.27 g/mL. Se sabe que los coeficientes

de reparto son 9.5 y 1.3 para acetil prolina y acetil fenilalanina,
respectivamente.
Calcule el Rf de ambos compuestos.

El área de la columna la podemos calcular de la forma siguiente:
A   * r 2  3.14 * (0.5) 2  0.785cm 2

22
Por otra parte el volumen de la silicagel contenida en la columna se
puede calcular de la siguiente forma:
g silicagel 5 .0 g
VSilicagel    2.20mL
d silicagel 2.37 g / mL
A continuación calculamos las áreas de material inerte, agua y solvente

de la forma siguiente:
Vsilicagel2.20cm 3
Ai ( Silicagel )    0.110 cm 2
Longitud 20cm
Vagua 3.50cm 3
As ( agua )    0.175cm 2
Longitud 20cm
Vcloroformo
10 .0cm 3
Am ( cloroformo )    0.500 cm 2
Longitud 20 cm
23
Finalmente se calculan los Rf de los dos compuestos:
Am 0.500
R    0.23
f ( acetil prolina ) Am  KAs 0.500  (9.5 * 0.175 )
Am 0.500
R    0.69
f ( acetil fenialanin a ) Am  KAs 0.500  (1.3 * 0.175 )
24
EJERCICIO 1: Para la separación de propionil carnitina e isovaleril
carnitina, se usó una columna de 2.5 cm de diámetro de 25 cm de largo
conteniendo 12 gramos de silicagel, 10.5 ml de agua y 17 mL de
cloroformo. La mezcla se eluyó usando cloroformo: butanol (99:1).
La densidad de la silicagel es de 2.27 g/mL. Se sabe que los coeficientes

de reparto son 8.7 y 2.6 para propionil carnitina e isovaleril carnitina,
respectivamente.
Calcule el Rf de ambos compuestos.
25
EJEMPLO 2: Una columna de 15 cm tiene un Am de 0.30 y un As de 0.15. Una
mezcla de compuestos A y B son añadidos a esta columna. Cual es el volumen de
fase móvil necesario para desplazar al componente A, de forma que la media del
final de la banda del pico del compuesto A, se solape con la parte media del inicio
del pico del compuesto B en la salida de la columna (ver figura)?.
Datos adicionales:
H = 0.003 cm
KA = 1.5
KB = 1.7
Primer paso:
Se determina la relación de los relativas movimientos
de los compuestos a través de la columna:
R f ( A ) Am  K B * AS 0.30  1.7 * 0.15
   1.057
R f ( B ) Am  K A * AS 0.30  (1.5 * 0.15 )
Esta es la relación de velocidad con la que se mueve A
respecto a B. Para saber cuanto espacio necesita recorrer
A para lograr salir totalmente de la columna de 15 cm,
lo que hacemos es multiplicar la relación de velocidad
por la longitud de la columna. 26
Espacio de A para salir de columna  1.057 *15cm  15.86cm
Para que A salga totalmente de la columna A debe recorrer un espacio equivalente
a 15.86 cm.

Pero la pregunta se refiere a la cantidad del
eluyente necesario para lograr que la parte media
entre las bandas de B y A se ubique exactamente
a 15 cm, es decir la longitud de la columna.
Ver Figura.

Para saber cuanto de A ha avanzado a través de
la columna una vez que la parte media entre las
dos bandas de los picos ha llegado a la salida
de la columna lo que hacemos es dividir el
0.86 cm extra entre 2 y nos 0.43 cm.
Esto se lo sumamos a la banda de A para saber

cuanto ha avanzado en este momento (15.43 cm)
y se lo restamos a la banda de B (14.57), para
saber cuanto a ha avanzado B, esto se muestra
en la figura de la derecha: 27
Ahora nos toca calcular cuanto del eluyente es necesario agregar en las
condiciones experimentales para lograr desplazar a A hasta 15.43 cm de la
columna, aquí usamos la siguiente ecuación:
Volumen  N *Vb( A)
Fase móvil
Donde N es el numero de platos teóricos, Vb(A) es el volumen efectivo de platos del

compuesto A.
Longitud 15.43cm
N   5143platos
H 0.003cm
Dado que:
Vb  H ( Am  KAs )  0.003(0.30  1.5 * 0.15)  0.00158cm3

Finalmente calculamos el volumen de fase móvil:
Volumen  5143 * 0.00158cm3  8.10cm3

Fase móvil
28
EJERCICIO 2: Una columna de 25 cm tiene un
Am de 0.45 y un As de 0.28. Una mezcla de
compuestos C y D son añadidos a esta
columna. Cual es el volumen de fase móvil
necesario para desplazar al componente C, de
forma que la media del final de la banda del pico
del compuesto C, se solape con la parte media
del inicio del pico del compuesto D en la salida
de la columna (ver figura)?.
Datos adicionales:
H = 0.007 cm
KC = 2.8
KD = 1.9
29
EJERCICIO 2: Una columna de 25 cm tiene un Am de 0.45 y un As de 0.26. Una
mezcla de compuestos A y B son añadidos a esta columna. Cual es la fracción del
componente A que salió de la columna si el eluyente es cortado a la mitad de entre
los dos picos (ver figura)?.

Datos adicionales:
H = 0.007 cm
KC = 2.8
KD = 1.6
30
CROMATOGRAFÍA PLANA
Es una técnica de separación cromatográfica en la que la fase
estacionaria está en forma de plano o sobre un plano. Éste puede ser
un papel, que sirva como tal o que esté impregnado con una sustancia
que actúe de fase estacionaria (Cromatografía en Papel), o una capa
de partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de
vidrio (Cromatografía en Capa Fina, TLC).
A veces a la cromatografía plana se la llama también Cromatografía de

Lecho Abierto.

La cromatografía plana es un tipo de cromatografía liquida en la que la
fase estacionaria es una superficie plana, en lugar de estar contenida
en una columna.
Existen dos técnicas de cromatografía plana:

1. Cromatografía en papel (CP)
2. Cromatografía de capa fina (CCF)
CROMATOGRAFÍA PLANA
La CP es más antigua y es superada por la CCF debido a su mayor
rapidez, versatilidad y reproducibilidad.
Básicamente la metódica es la misma en ambos casos:

1. La muestra se aplica en forma de gota sobre una lámina o
superficie plana.
2. Después se evapora el disolvente en la zona en la que se aplica la
gota.
3. La lámina se coloca verticalmente en una cámara cerrada con su
extremo sumergido en la fase móvil (eluyente).
4. La fase móvil desplaza los compuestos de la muestra a través de la
fase estacionaria a distinta velocidad, teniendo lugar la separación.
5. Cuando el disolvente ha pasado de la mitad o dos tercios de la
longitud de la lámina se saca de la cámara.
6. Se seca la lamina poniéndose de manifiesto la presencia de las
especies separadas.
7. Posteriormente se relaciona ésta con la de estándares de referencia
para confirmar su presencia.
32
PRINCIPIOS BÁSICOS
La caracterización de los componentes se lleva a cabo mediante el
Factor de Retardo (Rf):
Los valores varían de 0 a 1 pero existen muchos factores que pueden

influir (T°, tamaño de la cámara, naturaleza de la mezcla, etc.), para
minimizar estas diferencias se calcula el parámetro Rx:
En éste caso es necesario considerar que el patrón debe ser diferente

de los que se analizan en la corrida.
33
PRINCIPIOS BÁSICOS
El factor de retención o factor de capacidad viene definido por la
expresión:
Donde:
• t´R es el tiempo realmente invertido en la retención de un soluto por la
fase estacionaria.
• tM es el tiempo de residencia del soluto en la fase móvil.
• dDisolvente es la distancia recorrida por el frente disolvente en la placa.
• dAnalito es la distancia recorrida por el analito en la placa.
• Rf es el factor de retardo del analito en las condiciones del análisis.
34
FACTOR DE RETENCIÓN O RETARDO
Cociente entre la distancia recorrida por
el centro de la mancha y la distancia
recorrida simultáneamente por la fase
móvil. Utilizando los símbolos de la
figura:
RF = b / a
Por definición, los valores de RF son

siempre menores que la unidad.
Generalmente se dan con dos cifras
decimales. Para simplificar la
representación, se pueden usar los
valores hRF, que corresponden a los
valores RF multiplicados por 100.
En condiciones ideales, los valores
RFcoinciden con los valores R (factor de
retardo en la cromatografía en
columna). 35
LOGARITMO DEL FACTOR DE RETENCIÓN O RETARDO (RM)
Es el logaritmo del valor RF:
RETARDO O RETRASO RELATIVO Rrel

Este término es equivalente a la retención relativa usada en la
cromatografía en columna: es el cociente entre el valor Rf de un
componente y el valor Rf de una sustancia patrón (o referencia).
Puesto que el frente de fase móvil es común para los dos, el valor (Rrel)
puede expresarse directamente como el cociente entre las distancias
avanzadas respectivamente por la mancha del compuesto de interés bi y
por la sustancia de referencia (bstd):
RF (i ) bi b
Rrel   
RF ( std ) bstd bR
36
CROMATOGRAFÍA PLANA BIDIMENSIONAL
Procedimiento en el que parte o todos los componentes de la muestra se
someten, una vez separados, a etapas adicionales de separación.
Esto se puede hacer, por ejemplo, conduciendo a una fracción en

particular que eluye de la columna hacia otra columna (o sistema) que
tenga diferentes características de separación. Cuando se combina con
etapas de separación adicionales, se puede hablar de Cromatografía
Multidimensional.
Esto se aplica en cromatografía plana tanto en la modalidad de papel

como de capa fina y consiste básicamente en separar los compuestos
mediante un eluyente hasta el frente del primer solvente dejar que se
seque y luego girar la placa 90° y eluir usando un según eluyente, en el
caso de la bidimensional.
Este tipo de técnica se usa cuando la separación entre las manchas de

los componentes de la mezcla no ha sido lo suficientemente satisfactoria
y es necesario dilucidar entre todos los componentes de la mezcla
usando par esto un segundo eluyente.
37
CROMATOGRAFÍA PLANA BIDIMENSIONAL
38
CROMATOGRAFÍA DE PAPEL
Es una técnica muy sencilla, se utiliza una tira de papel de filtro
(Whatman nº 1 por ejemplo) como soporte para la separación. El
mecanismo que interviene en la separación fundamentalmente es
de reparto.

El papel que se usa debe ser de una gran pureza, idealmente
debe contener celulosa pura y no debe contener lignina cobre u
otras impurezas.

Comercialmente es posible encontrar hojas de 18 a 22 pulgadas o
tiras de una pulgada por varios cientos de pies. El largo del papel
depende del uso direccional que se le vaya a dar.

Los papeles cromatográficos pueden contener impurezas
orgánicas y eso pude causar que cuando se interpreten espectros
del infrarrojo o ultravioleta aparezcan algunos desconocidos.
39
La fase estacionaria esta constituida por el agua absorbida sobre
las moléculas de celulosa del papel. El papel utilizado puede ser
papel de filtro estándar o papel especial para CP con porosidad,
espesor concreto y baja concentración de compuestos metálicos.

La fase móvil se selecciona empíricamente, se emplean mezclas
consistentes en compuestos orgánicos, agua y otras especies
(ácidos, bases, agentes complejantes…) que modifiquen la
solubilidad de los compuestos de la muestra.

Con el conocimiento de los coeficientes de partición del soluto
entre dos solventes nosotros podemos predecir mas o menos el
desplazamiento de los solutos en el papel, o sugerir un par de
solventes.
40
Es necesario tener en cuenta las siguientes recomendaciones, en el
caso de una mezcla de dos solvente (las mas comunes):

• Si la sustancia se mueve muy despacio, un incremento de uno de los
dos solvente puede constituir un aumento de la solubilidad del soluto,
por lo que se moverá mas rápido.
• Si el soluto se mueve cerca del frente del solvente (se mueve muy
rápido) incremente el otro solventes de la mezcla de separación, para
que se ralentice su movimiento.

Cuando se use un sistema de dos fases, la cámara cromatográfica debe
ser saturada con la fase estacionaria. (Ej. Agua cuando se use fenol).
Algunos solventes son:
• Fenol saturado con agua.
• Butanol - NH4OH
• Acetona – Agua.
Un solvente Universal es:
n-butanol – ácido acético –agua (40:10:50)
41
En la cámara cromatográfica hay que mantener una atmósfera
saturada de vapor de disolvente para evitar la evaporación del
disolvente. Por lo que se recomienda introducir la mezcla de
disolventes una media hora antes de realzar la separación
cromatográfica.
La cámara debe tener un sistema de sujeción tanto para la

cromatografía en papel ascendente como la descendente.
Generalmente sirven tubos de ensayos, beakers, jarras, vasos,

frascos de reactivos de vidrio transparentes, etc. Sin embargo las
casas comerciales venden cámaras especiales para este tipo de
cromatografía.
42
La separación se realiza en función de la afinidad de los solutos
con las dos fases, las más solubles en agua se quedarán cerca
del punto donde se aplicó la muestra, y las menos solubles en
agua y más solubles en el disolvente se desplazaran con el
frente del solvente y llegarán más lejos.
Las sustancias separadas se identifican

mediante manchas de colores en el
papel.
Cuando no se puede identificar las

manchas se usan diversos
procedimientos de revelado físicos o
químicos, que ponen de manifiesto las
manchas en el papel.
Para identificar la presencia de un determinado analito en una mezcla
se procede inicialmente a colocar en el papel un estándar del analito a
ser identificado, el que se “corre” o eluye en conjunto con la mezcla.
Se identifican las manchas del estándar del analito y de la mezcla y se
calcula el factor de retención, retraso o retardo (Rf) y si son iguales se
confirma la presencia del analito en la mezcla.
1: aplicación de la muestra
2: se sumerge el extremo inferior en la fase móvil
3 a 5: la fase móvil asciende por capilaridad y se va produciendo la
separación de los componentes
6: se marca el frente de avance del disolvente y se deja secar la placa
7: revelado de los componentes ya separados y medida de su avance
46
La identificación de las sustancias en una muestra se realiza
mediante la comparación del factor de retraso (Rf) del
estándar en función del calculado para los analitos en la
muestra
Los valores de Rf son característicos de cada compuesto por

lo que al comparar el valor de Rf de una mancha en una
mezcla con el Rf de la mancha de un estándar y si sus
valores son iguales es una indicación de que posiblemente
en la mezcla existe el analito.
Para la detección de las sustancias separadas se pueden
emplear las mismas técnicas que en CCF excepto aquellas
que impliquen el uso de reactivos que puedan dañar el papel
(H2SO4 concentrado).
La detección sobre el papel es mas sensible que en capa

fina ya que las muestras aparecen generalmente más
difusas.
Algunos ejemplos de sistemas de revelado pueden ser los

siguientes:

Ácidos orgánicos Indicadores ácido base
Azucares reductores Nitrato de plata NaOH
Amino ácidos Ninhidrina
48
Las dos técnicas de revelado de placas de papel más usadas son
el spray y la zambullida.

Para el spray se usa un atomizador o en su defecto, un sistema de
spray con un compresor de aire, sin embargo no se recomienda
cuando el spray contiene ácidos minerales.

La técnica de zambullir es entonces preferida y la única
consideración que de debe de tener es que las sustancias no
deben ser solubles en el revelador donde se zambullen.

La CP aun se usa en determinadas aplicaciones con finalidad
didáctica y para separación de muestras clínicas y bioquímicas así
como en otras aplicaciones analíticas generales por su gran
sencillez y bajo costo.
49
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA DE PAPEL
Existen diferentes tipos de cromatografía en papel entre estas tenemos:
1. Cromatografía en papel ascendente
2. Cromatografía en papel descendente
3. Cromatografía en papel bidimensional
4. Cromatografía en papel horizontal
5. Cromatografía en papel de fase reversa
1. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL ASCENDENTE
En este tipo de cromatografía la muestra es colocada ½ pulgada por encima de la
parte inferior del papel. El papel es suspendido verticalmente en una cámara
cromatográfica con la parte marcada (mancha), introducida y suspendida en
aproximadamente ¼ de pulgada del eluyente. El solvente asciende por el papel
por la acción de la capilaridad efectuando la separación de los componentes al
mismo tiempo que asciende.

La desventaja principal de este tipo de cromatografía consiste en que el eluyente
puede solo ascender unas 8 a 9 pulgadas. La principal ventaja es el tipo de
equipamiento usado que es muy simple.
50
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL ASCENDENTE

51
2. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL DESCENDENTE

En este tipo de cromatografía la muestra es colocada 2 a 3 pulgadas por
encima de la parte inferior del papel.
El papel es suspendido verticalmente en una cámara cromatográfica con

la parte marcada doblada como una mecha introducida en un
“tanquecito” o deposito de eluyente. Después que el eluyente asciende
por la mecha, desciende por el papel hasta la parte inferior suspendida
en la cámara.

Un sistema antisifón debe de ser colocado en la parte superior para
prevenir que el eluyente escurra hacia la cámara como producto de un
posible efecto de sifón.

Esta técnica permite que tiras de papel mas largas puedan ser usadas, a
diferencia de la cromatografía ascendente. Esto permite un incremento
en la resolución.
52
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL DESCENDENTE

53
3. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL BIDIMENSIONAL

En este tipo de cromatografía dos eluyentes son usados uno
después del otro. La muestra es “marcada” o “manchada” en una
esquina del papel o de la pieza rectangular del papel. Uno de los
eluyentes es usado para desarrollar el cromatograma en una
dirección. El papel es secado y girado 90° y un segundo eluyente
es entonces usado para desarrollar un segundo cromatograma.

La principal ventaja es que una mayor cantidad y variedad de
compuestos pueden ser separados en relación a una
monodimensional.
54
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL BIDIMENSIONAL

55
4. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL HORIZONTAL

Es también conocida como Técnica Rutter. La marca de la
muestra es colocada en el centro de un papel filtro
conteniendo una abertura del centro al perímetro del papel.
Por medio de esta mecha el eluyente es alimentado al papel
y la resolución ocurre como segmentos en lugar de las
manchas.

En este caso la cámara cromatográfica puede ser un plato
petri o un desecador.
56
A) frente de eluyente.
1,2 y 3: especies
separadas
Cromatograma Horizontal obtenido con una muestra de extracto

alcohólico de pétalos de flores desarrollada con una mezcla alcohol-
agua-HCl. 57
5. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL EN FASE REVERSA

En este tipo de cromatografía la fase estacionaria es una fase no polar y
la fase móvil es polar. Esta técnica es particularmente conveniente para
sustancias insolubles en agua tales como esteroides, ácidos grasos de
cadena larga o pesticidas organoclorados.
6. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL PREPARATIVA

Esta técnica consiste en rayar la muestra sobre una larga tira de papel
filtro. Mediante el uso de una tiras las zonas son localizadas y eluidas.
Generalmente se usa una pila de discos de papel filtro sujetados juntos.
58
Determinación de ácido málico en vino
Determinación de ácido málico, láctico, tartárico y succínico
CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA
En la cromatografía en capa fina, TLC (Thin layer chromatograhy) la
fase estacionaria es una capa, uniforme, de un absorbente
mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u
otro soporte. Básicamente se requiere un absorbente (ejemplo silica
gel), ubicado sobre una placa, un dispositivo que mantenga las
placas durante la elución del solvente, y una cámara en la que se
desarrollen las placas cubiertas.
La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un
sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el
eluyente o disolvente por lo general será menos polar que la
fase estacionaria, de forma que los componentes que se
desplacen con mayor velocidad serán los menos polares.
Los productos a examinar se disolverán, cuando sea

posible, en un disolvente orgánico que tenga un punto de
ebullición lo suficientemente bajo para que se evapore
después de la aplicación, lo más común es usar acetona.
Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para
realizar el proceso de siembra de la muestra a analizar, aunque
también pueden usarse tubos capilares.
El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del capilar

(micropipeta, etc) sobre la placa preparada.
Dejando una distancia al borde inferior de un centímetro

aproximadamente.
El punto de aplicación de la muestra se denomina toque.
Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el

disolvente, de forma que en la placa solo quedará la muestra a
analizar.
El principio de la separación entre las fases es semejante al de la HPLC,
pero el proceso experimental es diferente. Se distinguen tres etapas:

Aplicación de la muestra: aplicación de un pequeño volumen de una
disolución de la muestra manual o automáticamente, por medio de un
capilar de extremo plano.

Migración sobre la placa: la placa se introduce en una cubeta provista de
una tapadera, en el fondo de la cual se encuentra la fase móvil que sirve de
eluyente. La fase móvil migra por capilaridad a través de la fase
estacionaria, arrastrando a diferentes velocidades los constituyentes a
separar, cuando el frente del disolvente ha recorrido una distancia
suficiente, se retira la placa de la cubeta

Revelado postcromatográfico: para facilitar su visualización la mayor
parte de las placas contienen una sal de zinc fluorescente añadida a la fase
estacionaria. Al iluminar tal placa con una lámpara de vapor de mercurio se
ve aparecer en forma de manchas oscuras o coloreadas sobre un fondo
fluorescente las posiciones donde se encuentran los compuestos.
64
Al igual que en la cromatografía de papel, para identificar la presencia
de un determinado analito en una mezcla se “siembra” un estándar
conocido o a ser identificado, el que se “corre” o eluye en conjunto con
la mezcla.
Se identifican las manchas del estándar del analito y de la mezcla y se

calcula el factor de retardo (Rf) y si son iguales se confirma la presencia
del analito en la mezcla.
PASOS A SEGUIR EN CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA
1) Preparar o cortar, en su caso,

una placa de tamaño adecuado.
2) Disolver una pequeña

cantidad de la muestra y,
mediante un capilar de vidrio,
pinchar en la parte inferior de la
placa a cierta distancia del
borde.
66
3) Introducir la placa en un
recipiente con el disolvente
adecuado. Dicho recipiente debe
presentar una atmósfera saturada
en el vapor del disolvente por lo
que se pone trozo de papel de filtro
en la parte posterior y disponer de
un sistema de cierre.
4. Cerrar el recipiente y dejar que

el líquido ascienda por capilaridad.
67
5) Revelar la placa para poner de

manifiesto donde se encuentran los
puntos .
6) Determinar las posiciones

relativas de los puntos mediante el
cálculo del Rf
68
Se realiza en placas de vidrio o plástico recubiertos con una capa
delgada de partículas finamente divididas contenidas en la fase
estacionaria. El mecanismo predominante es la adsorción.

Particularidades de esta técnica:

1. Comprende un sistema donde están presentes tres fases distintas;
una fase estacionaria sólida, una fase móvil liquida y una fase vapor
en equilibrio.
2. La fase estacionaria esta parcialmente equilibrada por la fase liquida
antes del paso de los compuestos.
3. La capacidad de absorción disminuye a medida que una parte de las
posiciones de absorción están ocupados.
4. No es posible hacer variar el flujo de la fase móvil para mejorar la
separación.
5. La velocidad de migración del disolvente no es constante.
69
La técnica de cromatografía en capa fina (TLC) es una de las más
comunes empleadas en un laboratorio de Química Orgánica.
Entre oras cosas permite:
1. Determinar el grado de pureza de un compuesto
2. Comparar muestras
3. Realizar el seguimiento de una reacción
4. Controlar el contenido de las fracciones obtenidas en
cromatografía de columna
70
Para la fase estacionaria se emplean partículas cuyo tamaño oscila
entre 10 - 25 µm para facilitar el flujo e incrementar la resolución.
Tradicionalmente los materiales mas usados han sido:

• Gel de sílice: es el más utilizado, es una fase estacionaria inorgánica
de características polares; es necesario activarla por calor. Es una
fase adecuada para separar muchas sustancias: aminoácidos,
alcaloides, azucares, etc.
• Alúmina: requiere aplicación de calor (125-150 ºC) para obtener

resultados reproducibles y separaciones optimas

• Celita: material diatomáceo muy poroso y de gran área superficial,
pero su poder de adsorción es bajo.

• Poliamidas: son de gran utilidad para la separación de compuestos
relacionados con los fenoles al producirse interacciones entre los
solutos y la fase estacionaria por puentes de hidrogeno.
71
Para la fase móvil el disolvente a utilizar debe reunir una serie de
características:
1. Inerte frente a los componentes de la muestra y de la fase
estacionaria.
2. Elevada pureza.
3. Adecuada viscosidad y tensión superficial.
4. Bajo punto de ebullición para facilitar el secado de las placas.
5. Económico,
6. Baja inflamabilidad y toxicidad
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Para la identificación de los analitos en cromatografía de capa fina se
emplean dos métodos:
1. Químicos
2. Físicos
1. MÉTODOS QUÍMICOS,
Estos implican una reacción química ya sea específica para un
determinado componente o general:
• Vapor de yodo se adsorbe reversiblemente sobre una gran cantidad

de sustancias, origina puntos oscuros en la zona donde esta presente
el compuesto en la placa
• H2SO4 concentrado se pulveriza sobre una placa de sílice, permite
visualizar las sustancias orgánicas tras haber calentado la placa en
una estufa.
• Fluoresceína origina coloración amarillo-verdoso en gran cantidad de
sustancias orgánicas.
• Ninhidrina usada en la detección de aminoácidos.
73
2. MÉTODOS FÍSICOS,
Es el mas común es la radiación ultravioleta en combinación con un
indicador fluorescente; la placa contiene material fluorescente cuya
emisión a 254nm es inhibida por la mayoría de solutos. La placa se
ilumina y se ven las manchas de soluto más oscuras que el resto de la
placa que brilla.

La CCF tiene aplicación en análisis cualitativo, basándose en los
valores de los RF obtenidos respecto a patrones cuyo cromatograma se
ha desarrollado en las mismas condiciones. También se puede emplear
en estimaciones semicuantitativas por comparación de la mancha del
patrón con la del analito.
74
Determinación de aceites esenciales
Revelador vainillina
Determinación de composición de tintas de distintos lapiceros
Determinación de Patulina en productos derivados de manzana
Determinación de drogas
Determinación de ácido tetrahidro canabinóico (THC)
80

Cromatografia Papel y Capa Fina

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE NICARAGUA

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

DIPLOMADO EN TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS: ANÁLISIS

MODULO6: CROMATOGRAFIA DE COLUMNA (CC), PAPEL

Dr. Sergio José López Grío

León, Febrero de 2014

El fluido que pasa a través de la fase estacionaria se denomina

El proceso de paso de un líquido o un gas a través de una fase

El DISOLVENTE es capaz de disolver la muestra objeto de análisis

Los tipos de cromatografía se pueden clasificar en base a:

2. LA CONFIGURACIÓN DEL LECHO CROMATOGRÁFICO

1. SEGÚN EL ESTADO FÍSICO DE LA FASE MÓVIL

b) CROMATOGRAFÍA PLANA: Es una técnica de separación en la que

b) Por capilaridad y gravedad, en el que podemos encontrar una

3. SEGÚN EL MECANISMO DE SEPARACIÓN

Es un tipo de cromatografía en la que el lecho estacionario está

Las partículas de fase estacionaria sólida, o de soporte recubierto con

El mecanismo se basa en la formación de un complejo analito-relleno

En cromatografía en columna existen dos métodos para lograr que los

Si mas del compuesto B se disuelve en la

Esto es porque A no puede permanecer

El relleno de la columna se denomina lecho cromatográfico y empaquetar

La disolución problema, disuelta previamente en la fase móvil, se

Cuando toda la solución de muestra ha penetrado, se adiciona fase móvil

Los datos de la absorbancia permiten obtener el perfil de elución.

El coeficiente de reparto (K) del analito o compuesto entre el lecho poroso

La densidad de la silicagel es de 2.27 g/mL. Se sabe que los coeficientes

Calcule el Rf de ambos compuestos.

A   * r 2  3.14 * (0.5) 2  0.785cm 2

A continuación calculamos las áreas de material inerte, agua y solvente

La densidad de la silicagel es de 2.27 g/mL. Se sabe que los coeficientes

Calcule el Rf de ambos compuestos.

Esto se lo sumamos a la banda de A para saber

Donde N es el numero de platos teóricos, Vb(A) es el volumen efectivo de platos del

Vb  H ( Am  KAs )  0.003(0.30  1.5 * 0.15)  0.00158cm3

Volumen  5143 * 0.00158cm3  8.10cm3

A veces a la cromatografía plana se la llama también Cromatografía de

Existen dos técnicas de cromatografía plana:

Básicamente la metódica es la misma en ambos casos:

Los valores varían de 0 a 1 pero existen muchos factores que pueden

En éste caso es necesario considerar que el patrón debe ser diferente

Por definición, los valores de RF son

RETARDO O RETRASO RELATIVO Rrel

Esto se puede hacer, por ejemplo, conduciendo a una fracción en

Esto se aplica en cromatografía plana tanto en la modalidad de papel

Este tipo de técnica se usa cuando la separación entre las manchas de

La cámara debe tener un sistema de sujeción tanto para la

Generalmente sirven tubos de ensayos, beakers, jarras, vasos,

Las sustancias separadas se identifican

Cuando no se puede identificar las

Los valores de Rf son característicos de cada compuesto por

La detección sobre el papel es mas sensible que en capa

Algunos ejemplos de sistemas de revelado pueden ser los

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL ASCENDENTE

2. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL DESCENDENTE

El papel es suspendido verticalmente en una cámara cromatográfica con

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL DESCENDENTE

3. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL BIDIMENSIONAL

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL BIDIMENSIONAL

4. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL HORIZONTAL

Cromatograma Horizontal obtenido con una muestra de extracto

5. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL EN FASE REVERSA

6. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL PREPARATIVA