REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA

UNIVERSIDAD DEL ZULIA

FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE BIOANALISIS
CATEDRA: ANALISIS INSTRUMENTAL

Cromatografía líquida de Alta

Resolución HPLC
 Cromatografía
 Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de
retención selectiva cuyo objetivo es separar los
distintos componentes de una mezcla y en algunos
casos identificar estos si es que no se conoce su
composición.
 Cromatográma
 Es una gráfica u otro tipo de presentación de la
respuesta de un detector, la concentración de un
analito en el efluente u otra magnitud usada como
medida de la concentración en el efluente, frente al
volumen de efluente o al tiempo.
 Términos Básicos
TIEMPO DE RETENCIÓN
 Es el tiempo transcurrido entre
el instante en que se introduce
la mezcla y el instante en que
se detecta la señal propia del
componente en su máxima
intensidad. Los tiempos de
retención no son reproducibles,
ni siquiera en una misma
columna cromatográfica.
PLATOS TEÓRICOS
 Se utiliza como una medida de
la eficiencia de la columna, este
directamente relacionado con la
varianza, por ello resulta
convenientemente medir la
eficiencia de la columna en los
términos de varianza y longitud
de la columna.
 Términos Básicos
RESOLUCIÓN
 Es el parámetro que expresa el
grado de separación que se
puede obtener en un sistema
cromatográfico para dos
componentes dados. Relaciona
la capacidad separadora de un
sistema cromatográfico para
dos componentes.
SELECTIVIDAD
 Muestra las diferencia de
afinidad por los solutos de las
fases involucradas, indica el
potencial de separación de esos
solutos en el sistema, pero no
mide la separación real.
 Términos Básicos
EFICIENCIA

ELUCIÓN  Es el procedimiento en el que la fase móvil se

pasa de forma continua a través o a lo largo
del lecho cromatográfico y la muestra se
suministra al sistema de forma discreta, como
una pequeña cantidad en un tiempo breve.
 Términos Básicos
FASE ESTACIONARIA
 Es la que recubre la columna cromatográfica, interiormente sin
desplazarse. La fase estacionaria consiste en partículas, generalmente
sólidas, pequeñas y con una superficie micro porosa, de forma que
presenta un amplio desarrollo superficial. Puede estar empaquetada en
forma de columna o extendida en forma de capa.
 Puede ser un líquido o un gas que recorre la

FASE MÓVIL columna cromatográfica transportando los

componentes de la mezcla a través de dicho sistema.

Es aquella sustancia que se pone en contacto con la fase

ELUYENTE estacionaria y permite que se desplace la muestra.
 Fundamento de la cromatografía
EXISTEN DOS TIPOS DE FUNDAMENTO:
 Fundamento remoto: Este
fundamento se encuentra en
alguna o algunas propiedades
físicas o físico químicas de los
analitos: solubilidad, adsorción
(tendencia a ser retenidos en
sólidos finamente divididos),
volatilidad, tamaño, carga,
reactividad química o en estas diferencias, que pueden
bioquímica, etc.
 Fundamento próximo: Se
encuentra en el hecho de que es
muy improbable que dos
especies presenten
cuantitativamente el mismo par
de propiedades físicas o físico -
químicas frente a un sistema
cromatográfico dado. Por tanto,
ser muy pequeñas, se basa la
separación cromatográfica.
Cromatograma
 Componentes de un instrumentos
de cromatografía HPLC
 Bomba: Envía al solvente a través de caños de diámetro pequeño,
generalmente de acero inoxidable.

 Tipos de Bombas:
 Bombas reciprocas
 Bombas de desplazamiento
 Bombas neumáticas
 Componentes de un instrumentos
de cromatografía HPLC
 Válvula Inyectora: Consiste en una válvula de seis vías que
permite introducir en el flujo de solvente, la muestra contenida
en un aro o loop de volumen calibrado. Se producen pequeñas
cantidades de muestra (0.1-100μL)

 Columnas: Las columnas para cromatografí­a de líquidos se

construyen de ordinario con tubo de acero inoxidable de
diámetro interno uniforme, aunque en algunas ocasiones se
encuentran tubos de vidrio de paredes resistentes. Estas ultimas
solo se utilizan a presiones menores de unos 600 psi. Existen
diversos tipos: columnas analíticas, precolumnas, columnas
termostatizadas.
 Componentes de un instrumentos de
cromatografía HPLC
DETECTOR
 Produce una señal eléctrica
proporcional a la cantidad de
materia y esa señal es enviada al
registrador. Deben de tener un
volumen interno pequeño para
reducir el ensanchamiento de
pico. Basados en una propiedad
de la fase móvil (refracción,
densidad etc.) y en una propiedad
del soluto (absorbancia en UV,
fluorescencia etc.)
REGISTRADOR INTEGRADOR
 Realiza un gráfico de
intensidad en función del
tiempo (cromatograma) que
idealmente, se trata de picos
gaussianos y cada pico
corresponde a un componente
de la muestra original. Este que
El integrador calcula además el
área correspondiente a cada
pico, la cual es proporcional a
la cantidad de sustancia
Componentes de un instrumentos de
cromatografía HPLC
Cuadro comparativo de Detectores
 Cromatografía de fase normal y de fase
inversa
 Fase normal: se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Esta
técnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar, y se utiliza cuando
el compuesto de interés es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido
por la fase estacionaria. La fuerza de adsorción aumenta a medida que aumenta la
polaridad del compuesto y la interacción entre el compuesto polar y la fase
estacionaria polar (en comparación a la fase móvil) aumenta el tiempo de retención.

La fuerza de interacción no sólo depende de los grupos funcionales del compuesto de

interés, sino también en factores estéricos de forma que los isómeros estructurales a
menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilización de disolventes más
polares en la fase móvil disminuye el tiempo de retención de los compuestos
mientras que los disolventes más hidrofóbicos tienden a aumentar el tiempo de
retención.

Cayo en desuso debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos de retención

puesto que los disolventes próticos cambiaban el estado de hidratación de la silica o
alúmina de la cromatografía.
 Cromatografía de fase normal y de fase
inversa
Fase inversa: consiste en una fase inmóvil apolar y una fase móvil de
polaridad moderada. El tiempo de retención aumenta con la adición de
disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la introducción de
disolventes más hidrofóbicos. La cromatografía de fase reversa es tan
utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificación
adicional. La cromatografía de fase reversa se basa en el principio de las
interacciones hidrofóbicas que resultan de las fuerzas de repulsión entre
un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y
una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unión del
compuesto a la fase estacionaria es la disminución del área del segmento
apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofóbico está
dominado por la disminución de la energía libre de la entropía asociada
con la minimización de la interfase compuesto-disolvente polar.
Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que
las columnas de silica normales.
 Separación isocrática y separación con
gradiente
Diferencias

Isocrática Gradiente

Sólo se realiza a alta presión Puede realizarse a alta o baja presión

El gradiente separa los componentes de la Los distintos analitos son eluídos

muestra como una afinidad del compuesto cambiando la composición de la fase
por la fase móvil utilizada respecto a la móvil en la fase orgánica
afinidad de la fase estacionaria

La fase móvil no puede ser alterada La fase móvil puede ser alterada
durante el transcurso del análisis durante el análisis
Parámetros que afectan la resolución de la
columna
 Diámetro de la partícula: La mayoría de HPLC
tradicionales se realizan con una fase estacionaria unida al
exterior de partículas esféricas de silica. Estas partículas
pueden tener diferentes medidas, siento las de 5\mum de
diámetro las más utilizadas. Partículas más pequeñas
ofrecen una mayor superficie y una mejor separación, pero
la presión que se requiere por obtener una velocidad lineal
óptima aumenta de forma inversamente proporcional al
cubo del diámetro de la partícula. Esto significa que
disminuir la medida de las partículas a la mitad, aumentaría
la resolución de la columna, pero a la vez, aumentaría la
presión necesaria en un factor de ocho.
Parámetros que afectan la resolución de la
columna
 Longitud de la columna: El diámetro interno de una columna de
HPLC es un aspecto crítico que determina la cantidad de muestra
que se puede cargar a la columna y también influye en su
sensibilidad. La resolución aumenta con la longitud de la
columna. La banda individual de cada sustancia puede
ensancharse con el tiempo debido a procesos disfuncionales,
disminuyendo por tanto la resolución.
 Parámetros que afectan la resolución de la
columna
 Diámetro de la columna: El diámetro interno de una columna de
HPLC es un aspecto crítico que determina la cantidad de muestra
que se puede cargar a la columna y también influye en su
sensibilidad. Las columnas de diámetro interno más grande (>10
mm) se utilizan normalmente en la purificación de compuestos
para su utilización posterior. En cambio, las columnas de
diámetro interno menor (4-5 mm) se utilizan en el análisis
cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la
sensibilidad y la minimización del consumo de disolventes que
conllevan. Estas columnas se suelen denominar columnas de
rango analítico y normalmente están asociadas a un detector UV-
VIS.
 Características del solvente (fase
móvil).
• Es un solvente líquido, el cual puede ser puro o una
mezcla de solventes.
• El tiempo de retención aumenta con la adición de
disolvente polar a la fase móvil y disminuye con la
introducción de disolventes más hidrofóbicos.
• El líquido, se obliga a pasar a través del sólido bajo
presión o bien se deja percolar a través de él, por
efecto de la gravedad.
Análisis cualitativos y cuantitativos en HPLC
Aplicación de la HPLC en análisis Diversos
 Compuestos iónicos, como aminoácidos, sales inorgánicas, ácidos
orgánicos, etc.
 Compuestos de alto peso molecular, como polímeros, hidrocarburos
polinucleares, productos naturales, etc.
 Compuestos termolábiles y no volátiles, como vitaminas, pesticidas,
esteroides, plastificantes, drogas y un producto muy grande de otros
productos farmacéuticos.
 Análisis de compuestos vitamínicos es posible en corto tiempo.
 Determinaciones de constituyentes de ácidos nucleicos (nucleótidos,
nucleósidos) por cromatografía de intercambio iónico.
 Determinación de esteroides.
 El análisis de medicamentos (determinación de los componentes activos
de una tableta analgésica, análisis de barbitúricos, anticonceptivos, etc).
Aplicación de la HPLC en análisis Diversos
 En separaciones según el tipo químico, ya que su finalidad no es la
separación de compuestos individuales, sino de grupos diferentes de
sustancias presentes en las mezcla.
 La identificación y cuantificación aproximada de azúcares (separación
de isómeros de las aldohexosas que son difíciles de separar con otras
técnicas cromatográficas) aunque está restringido a laboratorios que
puedan hacer frente a los altos costes que esta técnica tiene.
 Los edulcorantes a granel al igual que los azúcares se determinan por
HPLC (en refrescos y alimentos), como el aspartamo o la sacarina.
 También se emplea para la determinación de vitaminas, como es el
caso de la vit. B2 (riboflavina), vit. E, vit. D, vit. A y carotenoides.
 Y para el análisis de residuos de pesticidas en frutas y verduras,
además de la observación de ácidos orgánicos, lípidos, aminoácidos,
toxinas y contaminantes.