Cromatografía

¿Qué es?

ES LA CIENCIA DE SEPARACIÓN ENTRE SÍ LOS LA SEPARACIÓN SE CONSIGUE A TRAVÉS DE DIVERSAS

COMPONENTES DE UNA SUSTANCIAS. TÉCNICAS CUYAS BASES MOLECULARES TIENE
DIFERENTES MUY DIVERSAS.
 Carga molecular

Tamaño molecular
Se pueden
separar por: Masas moleculares

Polaridad de sus enlaces

Estructura isómera o quiralidad.

 Gases Papel Líquidos

Líquida de
Tipos de Intercambio
Capa fina alta
iónico
cromatografía resolución

De afinidad
Cromatografía
en papel
 Cromatografía líquida en columna (CLC)
o cromatografía líquida (CL) .

Cromatografía Consiste en hacer pasar mediante

en columna gravedad la fase líquida sobre el sólido
(CC) soporte o activo, retenido en una
columna recta, generalmente de vidrio,
de dimensiones considerables , y
recogida del eluido en fracciones.
Cromatografía
en columna
Cromatografía por afinidad
Cromatografía
Se ha convertido en una técnica analítica que permite la separación,
identificación y cuantificación y cuantificación de los componentes.
Las separaciones cromatográficas se efectúan haciendo pasar
continuamente una fase, denominada móvil, sobre una segunda fase
que permanece fija o estacionaria.
La velocidad con que se mueve cada sustancia dependerá de su afinidad relativa por cada fase.

El fundamento del fenómeno cromatográfico se encuentra en la diferencia en alguna o algunas

de las propiedades físicas o fisicoquímica de los analitos como:
◦ Solubilidad.
◦ Adsorción.
◦ Volatilidad.
◦ Tamaño.
◦ Carga.
◦ Reactividad químico o bioquímica.
Historia
El botánico ruso Mikhail Tswett, en 1906, realizó un experimento que conjunto al descubrimiento
de lo que hoy se conoce como cromatografía. Colocó un extracto de pigmentos vegetales en la
parte superior de una columna de vidrio rellena de tiza (carbonato de calcio). Al agregar éter con
un poco de alcohol, observó que la mezcla original se separaba en diversas bandas coloridas que
descendían a través de la columna a diferentes velocidades. De esta forma consiguió separar los
pigmentos.
Tswett utilizó la palabra “cromatografía” para denominar a su método, que provienen del griego y
significa “escritura en colores”, porque cuando fue desarrollado los componentes separados eran
colorantes. Curiosamente, otros piensan que en la mente de Tswett, cromatografía quería decir
“escritura de Tswett”, dado que su apellido significa en ruso “color”.
Clasificación de las cromatografías
El estado físico de la fase
móvil y la fase estacionaria.
❖Cromatografía de líquidos.
❖Cromatografía de gases.
❖Cromatografía de fluidos
supercríticos.
Los mecanismos físicos o
químicos responsables de la
separación de los
componentes de la muestra.
❖Cromatografía de
adsorción.
❖Cromatografía de reparto.
❖Cromatografía de
intercambio iónico.
❖Cromatografía de afinidad.
❖Cromatografía de
exclusión molecular o
filtración en gel.
La disposición de la fase
estacionaria.
❖Cromatografía en
columna.
❖Cromatografía plana.
➢Cromatografía en papel.
➢Cromatografía en capa
fina.
Separación de dos componentes mediante cromatografía plana.
Parámetros básicos de
cromatografía
Retención y factor de capacidad
Cuando se introduce una sustancia en la corriente de la fase móvil de un sistema
cromatográfico, la sustancia se desplaza a la misma velocidad que la fase móvil, y emergerá de la
fase estacionaria cuando el volumen total de la fase móvil utilizado sea igual al volumen vacío de
la fase estacionaria. Ese volumen se le denomina volumen muerto.

❖Tiempo muerto, 𝑡𝑀 , es el tiempo que tarda en salir un componente que no se retiene.

❖Tiempo de retención 𝑡𝑅 , es el tiempo que tarda en salir un determinado compuesto.
❖Retención, capacidad real de la fase estacionaria para retardar la salida de un componente.
El tiempo de retención corregido, 𝑡𝑅′ , es el tiempo real que la fase estacionaria ha retardado el
avance de la sustancia, y se calcula con la siguiente formula:
Factor de capacidad ( o factor de retención), K’, es una medida de la fortaleza con que la fase
estacionaria retiene a un componente dado. En la cromatografía de líquidos depende de la
composición de la fase móvil y la fase estacionaria, en cromatografía de gases depende de la
velocidad de flujo de la fase móvil y de las dimensiones de la columna.
Dispersión de
bandas y eficacia
Los componentes se van separando y se
forman bandas para cada componente,
que según avanza se van ensanchando y
separando unas de otras, tienden a
distribuirse uniformemente en todo el
volumen disponible. A mayor tiempo,
mayor dispersión de bandas.
Factor de selectividad
La selectividad es la capacidad de la columna para separar dos sustancias, y se mide con el factor
de selectividad (σ) definido como la relación entre los factores de capacidad de las sustancias
que se van a separar.

A es siempre el componente que tiene un tiempo de retención más corto.

Resolución
Es un parámetro que expresa el grado de separación que se pude obtener en un sistema
cromatográfico para dos componentes.
Una buena resolución si los picos no se solapan y están perfectamente delimitados, sin que
coincida el final de uno con el principio del siguiente.
Para calcular la resolución, R, se utiliza la siguiente formula:

W son los anchos de base de los picos cromatográficos.

Optimización de las separaciones
cromatográficas
Existen tres parámetros fundamentales que determinan la resolución de una separación
cromatográfica:
➢La eficiencia de la columna o número de platos teóricos.
➢El factor de capacidad.
➢La selectividad.
Características analíticas y aplicaciones
Análisis cualitativo.

Análisis cuantitativo.

Calibración directa, absoluta o de patrón externo

Método del patrón interno o de calibración relativa.

Método de la normalidad de las áreas.

Método de adición estándar.

En el cromatograma, el eje horizontal corresponde al volumen o al tiempo equivalente, es
importante mantener constante la velocidad del flujo (velocidad /tiempo).
El tiempo puede ser siempre representado en el eje horizontal.
Optimización de las
separaciones
cromatográficas
Parámetros de determinación de la
resolución de separación cromatográfica.
La eficacia de la columna.

El factor de capacidad.

La selectividad.
Eficacia de la columna
Para una mejor eficacia de la columna, lo más fácil es aumentar la longitud de la
misma, pero esto también incrementaría en tiempo de análisis.

El aumento en el número de platos, puede conseguir reducir el tamaño de las

partículas de la fase estacionaria.
Los platos son un concepto imaginario que ayuda a entender el funcionamiento de los procesos
de separación en la columna.
Cuando mayor sea el número de platos teóricos (N) de una columna más eficiente será. E
igualmente, a menor altura (H) del plato teórico, mayor eficiencia.

Donde L es la longitud de la columna.

El número de platos teóricos se puede calcular a través del tiempo de retención (T R) y la altura
(w) del pico cromatográfico de un compuesto determinado después de su elución.
El número de platos teóricos depende tanto de las propiedades de la columna
como de las de la sustancia que se va a separar. Por lo tanto el número de paltos
teóricos de una columna dada no es fijo, y puede variar de unos componentes a
otros.
Para que estos parámetros sean útiles realmente en la comparación de dos
columnas, es esencial que se hayan determinado utilizando el mismo
compuesto.
El aumento del factor de capacidad o retención se consigue la composición de la fase móvil, la
superficie de interacción de la fase estacionaria o la temperatura de la elución.
La selectividad puede aumentar modificando la composición de la
fase móvil, cambiando la fase estacionaria, o trabajando a otras
temperaturas. La selectividad puede ser manipulada de modo muy
similar al factor de retención porque depende de él.
Características analíticas
y su aplicación
Análisis cualitativo
❖Informan el número de compuestos químicos existentes en
una mezcla ( según el número de picos que aparezcan en el
cromatograma), pero no aporta información sobre la naturaleza.

❖Podrá usarse para reconocer la presencia o ausencia de

componentes en mezcla que contengan un número limitado de
posibles especies de las que se conozca si identidad.

❖Proporciona evidencia segura de la ausencia de ciertos

compuestos, se en la muestra no aparece un pico con el mismo
tiempo de retención que el patrón, analizado en la mismas
condiciones, se puede asumir que dicho compuesto está
ausente.
Análisis cuantitativo.
Se basa en la medida de la altura o el área del pico cromatográfico del analito, que se compara
normalmente con la altura o el área de uno o más patrones inyectados bajo las mismas
condiciones.
Cuando los picos son agudos, estrechos, están bien definidos y son simétricos, aportan
exactitud.

Existen muchos métodos para la medida del área del pico, pero el más utilizado con diferencia
en la actualidad es la integración electrónica.
Para un análisis cuantitativo de los componentes separados de una muestra existe variedades de
métodos.
➢Calibración directa, absoluta o de patrón externo. Consiste en el empleo de patrones externos.

➢Método del patrón interno o de calibración relativa. Permite que varíen las condiciones de
operación entre muestras y muestra y no requiere de repetibilidad de las inyecciones.

➢Método de la normalización de las áreas. Todos los componentes se han separado y que cada
pico se ha resuelto completamente.
Cada día, millones de pies cúbicos de gas natural pasan a través de gasoductos desde
los suministradores hasta los distribuidores y, finalmente, llega a usuarios industriales o
particulares. El precio del gas depende de su valor calórico, y es valor se determina en
sitios a lo largo del gasoducto donde la custodia del gas pasa de un dueño a otro. Tanto
el vendedor como el comprador verifican el valor calórico del gas transferido.
Las medidas de valor calórico se hacen unas tres veces por hora con un proceso
automático de obtención de cromatogramas de gases. Los cálculos se hacen como se
indica a continuación. Una muestra de gas que se bombea a unas 70 atm se reduce a 1
atm, se filtra y pasa a través de un bucle de unos pocos L/min. Una submuestra de este
flujo pasa a través del bucle de muestra para ser inyectada periódicamente en el
sistema cromatográfico . Para optimizar la eficacia del análisis, se usa más de una
columna. Por ejemplo, la muestra se inyecta en la columna 1 hasta que eluye etano. A
continuación, la fracción más lenta y pesada vuelve a entrar en la columna 2, que es
más eficiente para algunos de los alcanos restantes. En total, se utilizan 3 columnas
diferentes, y todas las fracciones de hidrocarburo se detectan como el mismo detector
de conductividad térmica, pero variando la atenuación. Mientras las columnas están
desocupadas, se hace pasar hidrógeno a través de ellas y se limpian. El proceso entre
está contralado por computadora. Los cambios de columna, los cambios de eluyente,
las variaciones de la atenuación así como el rendimiento se muestra en el
cromatograma.
El valor calórico se calcula a partir de cantidades medidas de N2, co2, metano,
etano, propano, iso-butano, n-butano, iso-pentano, n-pentano, neo-pentano y
hexano así como de la densidad comprensible, contenido en agua, y calores de
combustión.
Cromatografía líquida de
alta eficacia (HPLC) y de
fluidos supercríticos (SFC)
 La cromatografía líquida de alta
resolución (high performance liquid
Cromatografía chromatography, HPLC), separar los
componentes de una mezcla
HPLC basándose en diferentes tipos de
interacciones químicas entre las
sustancias a analizar.
 • Emplea como fase estacionaria un líquido retenido sobre un soporte
Cromatografía de sólido, o bien enlazado químicamente al mismo. La separación de los
componentes de la muestra se basa en la diferente solubilidad entre la
reparto fase móvil y la fase estacionaria.

Cromatografía de • El relleno sólido de la columna actúa como fase estacionaria. Suele

emplearse sílice o alúmina. La fase estacionaria normalmente es polar,
adsorción por lo que suele utilizarse fases móviles no polares o de polaridad baja.

Cromatografía de
• La fase estacionaria es una resina polimerizada mediante enlaces
intercambio cruzados, unida de forma covalente a grupos funcionales iónicos.
iónico

Cromatografía de • La base de la separación es la capacidad del soluto para penetrar en los

poros del empaquetamieto de la columna. La fase estacionaria actúa
exclusión por de solo de soporte inerte, y las características de la fase móvil no
constituyen un factor decisivo en la discriminación de componentes.
tamaño
 Elección de fase
Tratamiento de Tratamiento de
estacionaria y
la muestra la fase móvil
fase móvil

Metodología Desarrollo del

Columna
Purga del
método sistema
de HPLC

Resultado
 Es la parte esencial en la cromatografía. Las columnas son tubos de
acero que miden entre 10 y 30 cm de longitud y cuyo diámetro oscila
entre 2 y 10 mm.

Características:

Columna
Detector
Cromatografía
de fluido
supercríticos
(FSC)
 Fase estacionaria esta retenida en una columna, generalmente de
vidrio y con diámetros de 1 a 5 mm y longitudes de 50 a 500 cm.

 El diámetro de la partícula de la fase estacionaria por lo general

era de 150 a 200 μm.
 Se puede usar una amplia gama de
columnas cromatográficas de diversos
tipos como son:
Filtración en gel
 Interacción hidrofóbica
 Intercambio iónico.
 Se emplea para la determinación de
composición de una mezcla de productos
químicos.

Análisis cuantitativo general de mezclas

Cromatografía multicomponentes de orgánicos
de gases (GC) volátiles.

Utiliza diversos gases en su operación en

función del analizador y del tipo de
detector concreto.
Argón
Helio
Hidrogeno
Nitrógeno
Electro separaciones
 Los iones negativos tienden a migrar hacia el potencial más alto
(positivo) y los iones positivos tienden a migrar hacia el potencial
más bajo (negativo) estén los iones en disolución o en un gas.

 La velocidad media de migración de una especie del analito es

proporcional a la carga del ion.

 La velocidad media de migración de una especie del analito es

proporcional al potencial medio aplicado.
 La velocidad media del movimiento de un ion es inversamente proporcional a su
sección transversal media.

 La calidad de las electroseparaciones en líquidos mejora cuando se suprime la

convección.

 La calidad de las electroseparaciones es líquidos mejora cuando la temperatura se

puede mantener constante durante el experimentos.
 La electroforesis es una técnica para la separación
de moléculas según la movilidad de estas en un
campo eléctrico a través de una matriz porosa, la
cual finalmente las separa por tamaños
moleculares y carga eléctrica.
 La técnica clásica utiliza una tira recubierta de una
sustancia porosa impregnada de un electrolito. Sus
extremos se sumergen en dos depósitos
independientes que contienen ambos al electrolito y
están unidos a los electrodos del generador de
corriente. La muestra se deposita en forma de un
pequeño trazo transversal en la tira. La distancia de
migración se mide en relación un marcador interno.
Las placas son reveladas con sales de plata, azul de
Coomassie, o reactivos en particular.
Cada molécula se desplaza por efecto del campo,
alcanzando rápidamente una velocidad constante al
equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo
eléctrico) con la resistencia al avance (fuerza de fricción o
rozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza.

Fuerza del campo eléctrico = Fuerza de fricción

𝒒∗𝑬 =𝒇∗𝒗

𝒒= Carga (C)
𝑬= intensidad del campo (V/m )
𝒇= coeficiente de fricción (kg/s)
𝒗 = velocidad de la molécula (m/s)
Electroforesis
Vertical
Electroforesis
Horizontal
 Elevada
Baja fricción
fricción
Medios de Gel de almidón
soporte para Papel

realizar la Gel de poliacrilamida

electroforesis Acetato de celulosa Gel de agarosa

Gel de agarosa +
poliacrilamida
Separación principal por
carga Separación por carga,
tamaño y forma de
Papel
• Elevada adsorción debido a los grupos hidroxilo de la celulosa.

Acetato de celulosa
• Los grupos –OH están acetilados, lo que reduce la adsorción; es posible transparentarla o disolverla para detectar y recuperar,
los componentes separados.
Almidón
• Actualmente se utiliza poco, ha sido sustituido por la poliacrilamida.

Agarosa
• Polisacárido, producto purificado de algas (composición similar al agar-agar). Se disuelve en caliente (50-60°C) y al enfriar
solidifica formando un gel, de alta porosidad.
Poliacrilamida
• El gel es el resultado de la polimerización química de una mezcla de acrilamida y bisacrilamida. Regulando la concentración de
ambas y su proporción se consiguen distintas porosidades.
Poliacrilamida con SDS
• El dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulphate; sinónimo: laurilsulfato sódico) es un detergente aniónico que se une a las
proteínas, desnaturalizándolas en una conformación extendida recubierta de moléculas de SDS. La movilidad electroforética de
la proteína depende exclusivamente de su masa molecular.
  Esta técnica permite separar bastante bien biomoléculas,
donde la cromatografía líquida se muestra menos eficaz,
y compuestos de pequeña masa molecular, difíciles de
estudiar por los procedimientos clásicos de
electromigración en soporte.
Electroforesis
capilar (CE)
Electroforesis  Es el procedimiento de electroforesis más habitual, en el
cual el capilar es recorrido por el electrolito a través de
capilar en zona un medio buffer que puede ser ácido (fosfato o citrato),
o en disolución básico (borato), o anfótero (carácter ácido y básico). El
flujo electro osmótico crece con el pH del medio
libre (CZE) electroforético.
  Esta es la transposición de la electroforesis en egel
de poliacrilamida o de agarosa. El capilar está
Electroforesis relleno con un electrolito que contiene al gel. Se
produce un efecto de filtración que ralentiza a las
capilar en gel grandes moléculas y que minimiza los fenómenos
(CGE) de convección o de difusión. Los
oligonucleótidos, poco frágiles, se pueden separar de
este modo.
  Esta técnica, también conocida como electroforesis en
soporte, consiste en crear un gradiente de pH lineal en
un capilar con pared tratada que contiene un anfótero.
Cada compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual
Isoelectroenfoque valor que su punto isoeléctrico (al pI su carga neta es
nula). Seguidamente, bajo el efecto de una presión
capilar (CIEF) hidrostática y manteniendo el campo eléctrico, se
desplazan las especies separadas hacia el detector. Las
altas eficiencias obtenidas con este procedimiento
permiten separar péptidos con pI que apenas difieren
entre sí 0.02 unidades de pH.
Separación de ❖SDS-PAGE o SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis,
electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de
proteínas por dodecilsulfato sódico.

SDS-PAGE
❖Gel de poliacrilamida, en placa, vertical.
discontinua
vertical ❖Separación de acuerdo con la masa molecular (estrictamente, con
la longitud de la cadena polipeptídica).
 La muestra se trata con SDS y se calienta brevemente a
90-100°C, para provocar la desnaturalización. Se añade
también β-mercaptoetanol para reducir los puentes
disulfuro, separando así las subunidades de la proteína
y permitiendo que se extiendan por efecto del SDS.
 En la preparación del gel se mezclan:
• un tampón de pH (comúnmente Tris-HCl)
• acrilamida y bisacrilamida
• un agente iniciador de la polimerización, como el
persulfato amónico (genera radicales libres)
• un agente catalizador de la polimerización, como el
TEMED (N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina)
• SDS
  Las moléculas de DNA de las células son excesivamente grandes
Separación de para avanzar a través de un gel de electroforesis normal, pero
pueden analizarse si previamente se han fragmentado de forma
DNA en geles controlada. Se suelen emplear geles de agarosa (concentración
entre 0,3% y 2%), más porosos que los de poliacrilamida. Las
de agarosa, características mecánicas de estos geles hacen aconsejable la
realización de la electroforesis en horizontal, habitualmente
electroforesis “submarina”. Las muestras se aplican en pocillos practicados
dentro del gel.
horizontal
 Una de las formas más comunes de fragmentar el DNA es el
submarina empleo de endonucleasas de restricción, que cortan en secuencias
diana características.
 La carga eléctrica de una molécula de DNA depende
de sus grupos fosfato, y el número de éstos es igual al
doble del número de pares de bases. La forma de todas
las moléculas de DNA es esencialmente la misma. En
consecuencia, resulta que la movilidad en
electroforesis depende exclusivamente de la longitud
de la molécula (medida habitualmente como número
de pares de bases, pb): la electroforesis separa los
fragmentos de DNA de acuerdo con su longitud en pb.
 El avance del frente de electroforesis se observa
gracias a colorantes como azul de bromofenol y xileno
cianol, añadidos a la muestra.
  Se pueden emplear sustancias coloreadas o fluorescentes que se
unan a las proteínas o los ácidos nucleicos.
 En el primer caso suelen ser colorantes orgánicos que
interaccionan con las proteínas de forma poco selectiva,
Tinción de principalmente electrostática, como, azul brillante de Coomassie.
proteínas y de  Para los ácidos nucleicos se usa el azul de metileno o, más
frecuentemente, compuestos fluorescentes e intercalantes, como
ácidos el bromuro de etidio.
nucleicos  Tras la electroforesis, el gel se sumerge en un recipiente con una
disolución del colorante y se espera a que aquél se impregne y así
el colorante se una a las moléculas separadas en el gel. Tras lavar el
gel para eliminar el exceso de tinción no unida específicamente, se
observa, fotografía o cuantifica mediante densitometría.
  También se llama enfoque isoeléctrico o IEF, de
isoelectrofocusing. Se trata de una variante de
electroforesis en la que el gel posee un gradiente de pH
fijado en su estructura. Esto se consigue incluyendo en
su preparación moléculas ionizables con valores de pK
diferentes. Como consecuencia, al avanzar los
componentes de la muestra a lo largo del gel se
Isoelectroenfoque encuentran en entornos de pH diferente, y
eventualmente alcanzan una región en la cual el pH
local es igual al punto isoeléctrico de la molécula
muestra y, en consecuencia, ésta detiene su avance. Se
alcanza, pues, un equilibrio y se consigue la separación
de los componentes de la muestra de acuerdo con su
punto isoeléctrico, que además se puede medir, pues
se conoce la geometría del gradiente de pH fijado al
gel.
  La carga media de todas las formas de una proteína es cero.
Punto
 Cuando una proteína se encuentra en su pH isoeléctrico no migra
isoeléctrico (pI) en un campo eléctrico.
  Tras realizar una primera separación su resultado se somete a otra
de diferente mecanismo en dirección perpendicular.
Electroforesis Generalmente la primera es un isoelectroenfoque en un gel
cilíndrico estrecho que luego se coloca como muestra para una
bidimensional SDS-PAGE. Se obtienen así mapas complejos de bandas, muy
característicos de cada muestra, cuya utilidad principal es la
comparación con el obtenido de otra muestra similar pero
conocida.
  Las moléculas o fragmentos de DNA de longitud superior a 20-40
kb no se pueden resolver (separar) empleando la electroforesis
convencional en gel de agarosa. Esto se debe, en primer lugar, a la
dificultad de manejo de los geles preparados con las bajas
concentraciones de agarosa que requerirían (inferior al 0,4%).
Además, las moléculas de DNA, que adoptan una conformación
Electroforesis más o menos globular, poseen un tamaño excesivamente grande
para atravesar los poros del gel y no se separan en función de su
de campo tamaño. Para solventar este problema se ha ideado una
modificación de la técnica, conocida como electroforesis de
pulsante campo pulsante (o pulsado, pulsed-field gel electrophoresis ,
PFGE). Se emplean geles de agarosa al 1%, pero se altera
periódicamente la orientación del campo eléctrico aplicado,
activando alternativamente dos pares de electrodos. El frecuente
cambio de dirección del campo eléctrico consigue que las
moléculas se desplieguen y avancen a través de los poros en
conformación extendida. A mayor tamaño, se reorientan con más
dificultad, por lo que avanzan más despacio.