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Análisis Cromatográfico

Dr. Jorge Herrera Murillo


Mayo 2021
La fase estacionaria en cromatografía es aquella
que está fija en su lugar, ya sea dentro de una
columna o sobre una superficie plana.

Cromatografía
Es una técnica en la que los
componentes de una mezcla se
separan basándose sobre diferencias
de las velocidades a las cuales son
acarreados por una fase móvil gaseosa
o líquida a través de una fase
La fase móvil en cromatografía es aquella que
estacionaria fija.
se mueve sobre la fase estacionaria o a través de
ésta acarreando con ella la mezcla de analitos.
Puede ser un gas, un líquido o un fluido
supercrítico.
Tipos de Cromatografía
En la cromatografía en columna, la fase estacionaria
se mantiene dentro de un tubo delgado, y la fase
móvil es forzada a través del tubo mediante presión o
gravedad.

En la cromatografía plana, la fase estacionaria está


sostenida sobre una placa plana o en los poros de un
papel, y la fase móvil se mueve a través de la fase
estacionaria por capilaridad o por la influencia de la
gravedad.
Cromatografía de elución en columna
Elución Eluyente Eluido
• Proceso en el • Es un • Es la fase
que los disolvente móvil que
solutos son utilizado para sale de la
lavados a acarrear los columna.
través de una componentes
fase de una
estacionaria mezcla a
mediante e través de una
movimiento fase
de una fase
estacionaria.
sólida
Cromatograma

Un cromatograma es una gráfica de alguna función


de la concentración de soluto contra el tiempo o
volumen de elución.
Velocidades de migración de los solutos
La efectividad de una columna cromatográfica en la separación de dos solutos depende en parte de las
velocidades relativas a las que las dos especies químicas son eluidas.

• Para un soluto en una


Constante cromatografía es igual a la
relación de su concentración
de molar en la fase estacionaria
distribución con su concentración molar
en la fase móvil

• El tiempo muerto (tiempo


vacío), tM, es el tiempo que
Tiempo le toma a una especie
muerto química
atravesar
no
una
retenida
columna
cromatográfica.
Velocidades de migración de los solutos

El tiempo de retención, tR, es el tiempo entre la inyección de la muestra y la aparición


de un pico de soluto en el detector de una columna cromatográfica
Velocidades de migración de los solutos

La velocidad lineal promedio, u, de las moléculas de la fase móvil es

Relación entre la velocidad de flujo volumétrico y la velocidad de flujo lineal:


Factor de retención

El factor de retención, kA, para


el soluto A está relacionado con
la velocidad a la que A migra a
través de la columna; es la
cantidad de tiempo que un
soluto pasa en la fase
estacionaria en relación con el
tiempo que pasa en la fase móvil
Idealmente, el factor de
retención para los analitos
en una mezcla está entre 1
y5
Factor de Selectividad

El factor de selectividad, a, para


los solutos A y B se define como
la relación entre la constante de
distribución del soluto retenido
con más fuerza (B) y la
constante de distribución del
soluto retenido con menos
fuerza (A) De acuerdo con esta definición, a siempre es mayor que
la
unidad.

El factor de selectividad para dos analitos en una


columna
brinda una medida de cuán bien van a ser separados
estos dos analitos en dicha columna
Eficiencia de una columna
Dos términos se utilizan ampliamente como mediciones cuantitativas de la eficiencia de una columna
cromatográfica: 1) la altura de plato, H, y 2) el número de platos, o el número de platos teóricos, N.

La eficiencia de las
columnas
cromatográficas se
incrementa a medida
que el número de
platos N aumenta y
conforme la altura de
plato H se reduce
¿Cómo se calcula el número de platos?
Variables que afectan la eficiencia de la columna

Efecto de la velocidad del flujo de la fase móvil


El grado de ensanchamiento de la banda depende del tiempo en
el que la fase móvil está en contacto con la fase estacionaria,
que a su vez depende de la velocidad del flujo de la fase móvil.
Resolución de la columna
La resolución, Rs, de una columna nos
indica cuán separadas están dos
bandas en relación con su anchura.

La resolución proporciona una medida


cuantitativa de la capacidad de la
columna para separar dos analito
Optimización
Variación en la altura de plato:
La resolución de una columna mejora a media que la raíz cuadrada del número de platos
aumenta. El aumentar el número de platos no surte ningún efecto en términos de tiempo, a
menos que el aumento se consiga reduciendo la altura de plato y no aumentando la
longitud de la columna.

Los métodos para minimizar la altura de plato, incluyen la reducción del tamaño de la
partícula del material de empacamiento, el diámetro de la columna y el grosor de la
película líquida.
Optimización
Variación en el factor de retención.

Comúnmente, una separación se puede mejorar de manera significativa mediante la


manipulación del factor de retención kB. El aumento en kB por lo general mejora la
resolución (pero a expensas del tiempo de elución).
Optimización
Variación en el factor de retención.

Comúnmente, una separación se puede mejorar de manera significativa mediante la


manipulación del factor de retención kB. El aumento en kB por lo general mejora la
resolución (pero a expensas del tiempo de elución).
Cromatografía de gases
-Los componentes de una muestra vaporizada se separan al ser distribuidos
entre una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria líquida o sólida retenida
en una columna.

-La muestra es vaporizada e inyectada en la parte superior de una columna


cromatográfica.

-La elución ocurre por el flujo de una fase móvil inerte gaseosa. La fase móvil
no interactúa con las moléculas del analito. Su única función es transportar al
analito a través de la columna.
-
Cromatografía de gases

Cromatografía Cromatografía
Gas-Líquido Gas-Sólido
Se basa en la partición del analito entre Se basa en una fase estacionaria sólida
una fase móvil gaseosa y una fase en la cual la retención de los analitos
líquida inmovilizada en la superficie de ocurre debido a una adsorción física.
un empaque sólido inerte o en las
paredes del tubo capilar. Tiene una aplicación limitada debido a
la retención semipermanente de
moléculas activas o polares.

La formación de colas en los picos se


debe al carácter no lineal del proceso de
adsorción. Esto es una limitación
Cromatografía de gases: Instrumentación
Al gas de la fase móvil en la cromatografía de gases se
le llama gas transportador y debe ser químicamente
inerte.

El helio es la fase móvil más común, aunque también


se utiliza argón, nitrógeno e hidrógeno.

Para controlar la velocidad de flujo del gas se


requieren reguladores de la presión, calibradores
y medidores de flujo.

Las velocidades de flujo en los cromatógrafos de


gases son reguladas controlando la presión de entrada
Los cromatógrafos más nuevos utilizan controladores de del gas. Se utiliza un regulador de presión de dos
presión electrónicos tanto para las columnas empacadas etapas en el cilindro del gas y algún tipo de regulador
como para las capilares.
de presión o regulador de flujo montado en el
cromatógrafo
Cromatografía de gases: Instrumentación
Para una alta eficacia de columna, una muestra de tamaño
adecuado debe ser introducida como un “tapón” de vapor.

Una inyección lenta o muestras de gran tamaño provocan


ensanchamiento de banda y pobre resolución.

Se utilizan microjeringas calibradas, para inyectar muestras


líquidas a través de un diafragma de goma o de silicón, o septo,
en un puerto calentado para la muestra localizado en la parte
superior de la columna.

El puerto de la muestra generalmente se mantiene a alrededor de


más de 50 ºC por encima del punto de ebullición del componente
menos volátil de la muestra.
Cromatografía de gases: Instrumentación
Para columnas analíticas empacadas, el tamaño de las muestras va
desde unas pequeñas décimas de microlitro hasta 20 uL. Las
columnas capilares requieren muestras que sean menores por un
factor de 100 o más.

Para columnas capilares, a menudo se necesita un separador de la


muestra para llevar una fracción pequeña conocida (1:100 a
1:500) de la muestra inyectada, mientras que el resto es enviado a
los desechos.
Cromatografía de gases: Instrumentación
Columnas Empacadas: están fabricadas con vidrio o con tubería
metálica. Normalmente tienen un largo de 2 a 3 m y tienen
diámetros internos de 2 a 4 mm. Estos tubos están densamente
empacados con un material de empaque uniforme y finamente
dividido, o con un soporte sólido que está recubierto con una capa
delgada (0.05 a 1 mm) de la fase líquida estacionaria.

Columnas Capilares: son llamadas columnas tubulares abiertas


debido a que tienen una trayectoria de flujo abierta. Hay dos tipos
básicos: tubulares abiertas con la pared cubierta (WCOT, por sus
siglas en inglés) y tubulares abiertas con el soporte cubierto
(SCOT, por sus siglas en inglés).
Cromatografía de gases: Instrumentación
Cromatografía de gases: Instrumentación
La longitud de las columnas cromatográficas va desde menos de 2
m hasta 60 m o más. Con el fin de ajustarlas en un horno para la
regulación de la temperatura, usualmente se arreglan como
bobinas que tienen diámetros de 10 a 30 cm

La columna normalmente se aloja en un horno con la temperatura


regulada. La temperatura óptima depende del punto de ebullición
de la muestra y del grado de separación requerido.

Una temperatura igual o ligeramente por debajo del punto de


ebullición de una muestra resulta en un tiempo de elución
razonable (de 2 a 30 min). Para muestras con un intervalo de
ebullición amplio, a menudo es deseable utilizar una
programación de temperatura, en la cual la temperatura es
incrementada ya sea continua o paulatinamente conforme procede
la separación.
Cromatografía de gases: Instrumentación
-Sensibilidad adecuada. En general, las sensibilidades de los detectores actuales
se encuentran en el intervalo de 10–8 a 10–15 g soluto/s.

-Buena estabilidad y reproducibilidad.

-Una respuesta lineal a los solutos que se prolonga a lo largo de varios órdenes
Características ideales de magnitud.
de un detector -Un intervalo de temperatura que va desde temperatura ambiente hasta al menos
400 ºC.

-Un tiempo de respuesta corto que es independiente de la velocidad del flujo.

-Alta confiabilidad y facilidad de uso.

-Similitud en la respuesta para todos los solutos

-No debe destruir la muestra.


Cromatografía de gases: Instrumentación
Tipos de Detectores
Cromatografía de gases: Instrumentación
Tipos de Detectores
Detector de Fotoionización de llama:

-El efluente de la columna es dirigido a una pequeña flama de


aire/hidrógeno.

-La mayoría de los compuestos orgánicos producen iones y


electrones cuando se pirolizan a la temperatura de una flama
de aire/hidrógeno.

-Estos compuestos son detectados al monitorear la corriente


producida al colectar los iones y los electrones.

-Para colectar los iones y los electrones se aplican unos


cuantos cientos de volts entre la punta del quemador y el
electrodo colector localizado sobre la flama.
Cromatografía de gases: Instrumentación
Tipos de Detectores
Detector de Fotoionización de llama:

-El detector de ionización de flama responde al número de


átomos de carbono que entran al detector por unidad de
tiempo, es un dispositivo sensible a la masa, más que sensible
a la concentración.

-Tiene la ventaja de que los cambios en la velocidad de flujo


en la fase móvil tienen pocos efectos en la respuesta del
detector.

-Los grupos funcionales, como carbonilo, alcohol, halógeno y


amina, producen menos iones (o ninguno) en una flama.
Cromatografía de gases: Instrumentación
Tipos de Detectores
Detector de Conductividad Térmica:

-Este dispositivo consiste en una fuente calentada eléctricamente


cuya temperatura, a energía eléctrica constante, depende de la
conductividad térmica del gas circundante.

-El elemento calentado puede ser un alambre fino de platino, oro


o tungsteno, o bien, un pequeño termistor. La resistencia eléctrica
de este elemento depende de la conductividad térmica del gas.

-Con frecuencia se utilizan cuatro elementos de resistencia


sensibles a la temperatura. Un par de referencia se localiza por
delante de la cámara de inyección de la muestra y un par de la
muestra se localiza inmediatamente después de la columna.
Cromatografía de gases: Instrumentación
Tipos de Detectores
Detector de Conductividad Térmica:
-Las conductividades térmicas de helio e hidrógeno son
aproximadamente entre seis y diez veces mayores que aquellas de
la mayoría de los compuestos orgánicos.

-Las pequeñas cantidades de especies orgánicas causan


disminuciones relativamente grandes en la conductividad térmica
del efluente de la columna, resultando en un aumento considerable
en la temperatura del detector.

-Las ventajas de este detector son su sencillez, su gran intervalo


dinámico lineal (cerca de cinco órdenes de magnitud), su respuesta
general tanto a especies orgánicas como inorgánicas y
su carácter no destructivo.

-La principal limitación de este detector es su sensibilidad


relativamente baja.
Cromatografía de gases: Instrumentación
Tipos de Detectores
Detector de Captura Electrónica:
-Responde selectivamente a compuestos orgánicos que contienen
halógenos, como los pesticidas o los bifenilos policlorados.

-La muestra eluida de una columna se hace pasar por un emisor


beta radiactivo, usualmente níquel-63. Un electrón del emisor causa
la ionización del gas transportador (generalmente nitrógeno) y la
producción de una explosión de electrones.

-En ausencia de especies orgánicas, este proceso de ionización


resulta en una corriente permanente y constante entre un par de
electrodos. Sin embargo, la corriente disminuye notablemente en
presencia de moléculas orgánicas que contienen grupos
funcionales electronegativos que tienden a capturar electrones.
Cromatografía de gases: Instrumentación
Tipos de Detectores
Detector de Captura Electrónica:
-Con alta sensibilidad, se detectan compuestos como los
halógenos, los peróxidos, las quinonas y los grupos nitro.

-El detector es insensible a grupos funcionales como las aminas,


los alcoholes y los hidrocarburos.

-Son muy sensibles y tienen la ventaja de no alterar


significativamente la muestra

-La respuesta lineal del detector está limitada a cerca de dos


órdenes de magnitud.
Cromatografía de gases: Instrumentación
Tipos de Detectores
Detector de Espectrometría de masas:

-Un espectrómetro de masas mide la relación masa-carga (m/z) de


iones que se han producido a partir de la muestra. La mayoría de
los iones producidos tienen una carga única.

-La velocidad de flujo de las columnas capilares por lo general es lo


suficientemente baja como para que la salida de la columna pueda
ser alimentada de manera directa en la cámara de ionización del
espectrómetro de masas

-Las fuentes más comunes de iones para CG/EM son de impacto


de electrones y ionización química. Los analizadores de masas más
comunes son los analizadores de cuadrupolo y los de trampa
iónica.
Cromatografía de gases: Instrumentación
Tipos de Detectores
Detector de Espectrometría de masas:

-El espectrómetro de masas escanea repetidamente las masas


durante un experimento cromatográfico.

-Los instrumentos de CG/EM han sido utilizados para la


identificación de miles de componentes que están presentes en
sistemas naturales y biológicos.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
-La fase móvil es un disolvente líquido que contiene a la muestra en la
forma de una mezcla de solutos.

-Suelen clasificarse con base en su mecanismo de separación o según el


tipo de fase estacionaria, en:
1) cromatografía de partición o cromatografía líquido-líquido;
2) cromatografía de adsorción o cromatografía líquido-sólido;
3) cromatografía de intercambio iónico o cromatografía iónica;
4) cromatografía de exclusión molecular;
5) cromatografía de afinidad;
6) cromatografía quiral.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
-Es un tipo de cromatografía que combina una fase móvil líquida y una fase
estacionaria finamente dividida. Con el fin de obtener velocidades de flujo
satisfactorias, el líquido debe ser presurizado a varios cientos o más de libras por
pulgada cuadrada.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Reservorios de Fase Móvil y
sistemas de tratamiento de disolvente
Estos instrumentos están equipados con uno o
más reservorios de vidrio para los disolventes.

Generalmente se toman precauciones para


remover los gases disueltos y el polvo de los
líquidos. Los gases disueltos pueden producir
velocidades de flujo no reproducibles y
ensanchamiento de banda.

Los instrumentos para eliminar gases pueden


consistir en un sistema de bombeo de vacío, un
sistema de destilación, un dispositivo para agitar o
calentar, o, un sistema de burbujeo
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Reservorios de Fase Móvil y
sistemas de tratamiento de disolvente

Elución isocrática en HPLC es aquella en la cual


la composición de disolvente permanece
constante.

Elución en gradiente es aquella en la cual la


composición de disolvente se cambia de manera
continua o en una serie de pasos (de manera
escalonada).
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Sistema de Bombeo

Los requerimientos para las bombas utilizadas en cromatografía líquida


incluyen:
-La generación de presiones de más de 6000 psi (lb/in2)
-Salida libre de pulsos
-Velocidades de flujo de 0,1 a 10 mL/min
-Reproducibilidades de flujo relativas de 0.5% o mejores
-Resistencia a la corrosión por una variedad de disolventes
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Sistema de Bombeo
Bombas tipo jeringa impulsadas por tornillos: Bombas tipo émbolo:

Producen una salida libre de pulsos cuya velocidad Consiste en una pequeña cámara cilíndrica que se
se controla con facilidad. llena y se vacía mediante el movimiento hacia atrás
y hacia delante de un pistón.
Tienen una capacidad relativamente baja (alrededor
de 250 mL) y son poco prácticas cuando se deben El bombeo produce un flujo pulsado que debe ser
cambiar los disolventes. atenuado después debido a que los pulsos
aparecen como ruido basal en el cromatograma.

Las ventajas de las bombas de émbolo incluyen su


pequeño volumen interno (de 35 a 400 mL), su alta
presión de salida (de hasta 10,000 psi), su facilidad
para adaptarlas a la elución en gradiente y sus
velocidades de flujo contantes
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Sistema de Inyección de muestras

Los equipos para cromatografía líquida y tienen asas intercambiables capaces de


permitir la elección del tamaño de muestra en un intervalo que va de 1 a 100 mL
o más.

La reproducibilidad de las inyecciones con un asa de muestreo típica es de unas


cuantas décimas de un por ciento relativo.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Columnas
Las columnas para cromatografía líquida suelen construirse de tubería de acero inoxidable,
aunque en ocasiones también se utiliza tubería de vidrio o de polímeros.

La mayoría de las columnas tienen una longitud de entre 5


y 25 cm, y tienen diámetros internos de 3 a 5 mm. Siempre
se utilizan columnas rectas.

El tamaño de partícula más común para los empacamientos


es de 3 a 5 mm.

Las columnas de este tipo generan de 40,000 a 70,000


platos/m.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Precolumnas

Existen dos tipos:

Se utiliza una columna “de desperdicios”


entre el contenedor de la fase móvil y el
inyector para acondicionar la fase móvil.

Una columna de protección entre el


inyector y la columna analítica remueve
partículas y otras impurezas del
disolvente.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Columnas
Control de temperatura de la columna

Se obtienen cromatogramas mejores y más reproducibles cuando la temperatura de la columna se


mantiene constante.

Se pueden adaptar las columnas con sobrecubiertas de agua que son alimentadas desde un baño a
temperatura constante para producir un control preciso de la temperatura.

Para muchos cromatógrafos es esencial el control de la temperatura para obtener separaciones


reproducibles.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Detectores
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Detectores
Requerimientos:

Debe ser sensible a pequeñas concentraciones de analito

Dar una respuesta lineal y no ensanchar los picos del cromatograma.

No debe ser sensible a variaciones de temperatura y de la composición de disolvente.

Para evitar que se ensanchen los picos, el volumen del detector deber ser menor que el 20% del
volumen de la banda cromatográfica.

Las burbujas que puedan existir en el detector producen ruido, y por eso se debe aplicar al detector una
contrapresión, para impedir que se formen burbujas durante la despresurización del eluyente.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Detectores
Detector ultravioleta:

Utiliza una celda de flujo para aprovechar el hecho de que muchos solutos
absorben luz ultravioleta.

Los equipos más simples utilizan la intensa raya de emisión a 254 nm de una
lámpara de mercurio.

Los instrumentos más versátiles tienen lámparas de deuterio, xenón o


wolframio, y un monocromador, con el que se puede elegir la longitud de onda
óptima, de ultravioleta o visible, para detectar los analitos estudiados.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Detectores
Detector Fluorescencia:

Los detectores de fluorescencia excitan el eluato con un láser, y miden la


fluorescencia que se origina.

Estos detectores son muy sensibles, pero responden sólo a analitos que
presentan fluorescencia.

Para aumentar la utilidad de los detectores de fluorescencia y los


electroquímicos, se puede enlazar covalentemente al analito grupos
fluorescentes o electroactivos.

Este proceso de derivatización se puede llevar a cabo en la muestra antes de


hacer la cromatografía, o añadiendo los reactivos al eluato entre la columna y el
detector (llamada derivatización postcolumna).
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Detectores
Detector de Índice de Refracción:

Responde a casi cualquier soluto, pero su límite de detección es


aproximadamente 1000 veces peor que el de un detector de
ultravioleta.

El detector del tipo de deflexión, tiene dos compartimientos


triangulares de 5 a 10 mL, a través de uno pasa disolvente puro, y
a través del otro eluato. Para eliminar la radiación infrarroja (que
calentaría la muestra), se hace pasar luz visible colimada (paralela)
a través de la celda, con disolvente puro en los dos
compartimientos, y se dirige a la fotocélula mediante la placa de
deflexión.

Cuando a la celda entra un soluto de diferente índice de refracción,


el haz se desvía, y la señal dada por la fotocélula varía.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Detectores
Detector de dispersión de luz previa evaporación:

Responde a todos los solutos que son claramente menos volátiles


que la fase móvil.

El eluato entra en este detector por la parte superior. En el


nebulizador, el eluato se mezcla con nitrógeno, y se le fuerza a
pasar por un capilar, a cuya salida forma una fina dispersión de
gotitas.

El nebulizado se fuerza a pasar a través de un tubo caliente, donde


se evapora el disolvente, dejando una nube de finas partículas
sólidas, que entran en la zona de detección situada en el fondo del
tubo.

Las partículas se detectan por la luz que procede de un diodo láser


y que llega al fotodiodo por dispersión.
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC): Instrumentación
Detectores
Detector Electroquímico:

Un detector electroquímico responde a analitos que pueden


oxidarse o reducirse, como fenoles, aminas aromáticas, peróxidos,
mercaptanos, cetonas, aldehídos, nitrilos conjugados, compuestos
halogenados o nitroaromáticos.

Este detector se basa en la oxidación o reducción del eluato en un


electrodo de trabajo. Se mantenía el potencial a un valor
seleccionado, respecto al potencial de un electrodo de referencia
de plata-cloruro de plata, y se medía la corriente que pasaba entre
el electrodo de trabajo y un electrodo auxiliar, de acero inoxidable.

La corriente es proporcional a la concentración del soluto en un


intervalo de seis órdenes de magnitud.
Cromatografía de partición

La fase estacionaria es un segundo líquido que es inmiscible en la fase móvil líquida.

Se puede subdividir en cromatografía líquido-líquido y cromatografía líquido-fase enlazada. La


diferencia entre las dos radica en la manera en que la fase estacionaria se mantiene en las
partículas de soporte del empacamiento.

El líquido permanece en su lugar por medio de adsorción física en la cromatografía líquido-


líquido, mientras que en la cromatografía de fase enlazada se mantiene en su lugar por medio de
enlaces químicos.
Cromatografía de partición: Fase enlazada

Se preparan por medio de una reacción de un


organoclorosilano con los grupos –OH formados en la
superficie de las partículas de sílice mediante la hidrólisis de
ácido clorhídrico diluido caliente. El producto es un
organosiloxano.
Cromatografía de partición

Cromatografía de Fase inversa


• La fase estacionaria es no polar, generalmente un hidrocarburo, y
la fase móvil es un disolvente relativamente polar (como agua,
metano, acetonitrilo o tetrahidrofurano).
• El componente más polar es el primero que eluye, y aumentar la
polaridad de la fase móvil aumenta el tiempo de elución

Cromatografía de Fase Normal


• La fase estacionaria es polar y la fase móvil es no polar.
• El componente menos polar eluye primero; aumentar la polaridad
de la fase móvil disminuye el tiempo de elución

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