Electrophoresis and Genotyping

Electroforesis
-Se hacen en chips
-Hace uso de tecnologías de microfluídica y acción capilar.
-Muy útiles en el campo de diagnóstico médico.
-Gel electrophoresis separates molecules by 4 different characteristics:
o Charge (proteins)
o Size (proteins)
o Conformation (DNA, RNA)
o Length (DNA, RNA)
- Gel electrophoresis
o técnica utilizada para separar fragmentos de ADN (u otras
macromoléculas, como ARN y proteínas)
o ADN tiene una carga negativa, por lo que en presencia de un campo
eléctrico, las moléculas migran en dirección al catodo (carga positiva).
o Emplea el uso de varios componentes:
§ Gel
§ Buffer
§ Tinte
Componentes:
- Gel
o DNA migration speed: porosidad del gel de agarosa
§ % de agarose en el gel à determina porosidad
• Más % à migración más lenta
o Today we are using 1% agarose gel
§ 1 gram (g) of agarose in 100mL of buffer
o También existen otros gels:
§ Polyacrylamide: buena resolución de 10 – 3000 bp
§ Formaldehyde: útil para separar RNA largo
§ Gellan Gum: tiene unas propiedades únicas, como tolerar 120°C.
Su porosidad está determinada por la cantidad de cationes
divalentes en solución. También se usa menos cantidad ->
Environmentally Friendly!
- Buffer
o Para migración de ácidos nucleicos se usan buffers a base de Tris.
o Nosotros vamos a usar TAE:
§ Tris-Acetate-EDTA
§ TAE es más barato, pero menos estable.
§ Sirve bien para separaciones mediante electroforesis cortas y
cuando se desea aislar el material genético de la gel.
o También existe TBE:
§ Tris-Borate-EDTA
 § TBE sirve para electroforesis de productos pequeños (MW < 2000)
en poliacrilamidas o en "slab" gels para separar moléculas por
peso que no requieren mucha resolución.
§ Ojo: Borate reacciona con glycerol, que puede estar presente en
muestras tratadas con polimerasas y/o enzimas de restricción.
o Elementos a considerer cuando se corre electrophoresis en gel
§ Calor
§ Conductividad del buffer
§ Mayor conductividad del buffer, más calor se genera a un voltaje lo
que puede derretir el gel
§ Solución:
• Lithium Acetate
• solución menos conductiva (menos calor), por lo cual se
puede correr a mayor voltaje (más rápido) que TAE (5-
30V/cm as compared to 5-10V/cm).
• Downstream: Southern Blot, aislamiento de material
genético de gel (e.g. plasmids) todo funciona con la misma
eficiencia.
• Para mayor resolución de fragmentos pequeños (<500bp),
es preferible usar Lithium Borate.
- Tinte
o Fast Blast DNA Stain (500X)
§ Safe, convenient, and nontoxic
§ Alternative to ethidium bromide
§ Cationic dye that interact with phosphate group
o Existen otros tintes para visualizar DNA en gel:
§ Ethidium Bromide: agente intercalante (double stranded),
carcinógeno, fluoresce bajo UV.
§ SYBR Gold: puede teñir ssDNA, dsDNA o RNA. Unbound no
fluoresce tanto, pero bound x1000. Penetra geles gruesos y de alto
porcentaje de agarosa, también formaldehído.
§ SYBR Green (I & II): optimizados para distintas aplicaciones.
§ SYBR Safe: demostrado ser más seguro que los anteriores.
§ Eva Green: no inhibe elPCR tanto como los anteriores, útil en
quantitative real time PCR.
Cómo leer una electrophoresis en gel (DNA)
- Length
o Se comparan los fragmentos investigados con la escalera
para determinar el tamaño (relativo).
o La intensidad de las bandas refleja la concentración (relativo).
o Peso molecular: No todas las secuencias del mismo largo
tienen el mismo peso molecular
§ Distintos pares de base tienen distintos pesos
o Visualización
§ Contents of tubes are loaded onto an agarose gel
§ DNA is separated by size using an electric field.
§ PCR products are visible as different “bands”
- Conformation
o Topología
§ Linear plasmid: estado denaturado del plásmido.
Vulnerable a exonucleasas (degradación). Puede
ocurrir si se hace una lisis alcalina prolongada.
§ Circular plasmid: estado relajado que permite a las
polimerasas replicar el material genético. En
transformación este estado se genera mediante el
descongelamiento continuo del plásmido.
§ Supercoiled plasmid: estructura formada a partir de la
acción de DNA Gyrase, un enzima bacteriana que se
encarga de enroscar DNA. Protégé el material genético
pero al mismo tiempo lo hace inaccesible.
• mucho más eficiente de transfectar que las
otras dos estructuras.
o Migración
§ Mientras más compacto, más rápida es la migración
§ Supercoiled > linear > open circular
- Prueba de paternidad mediante DNA (Autosomal)
o Quien comparte más bandas tiene mayor probabilidad de ser
el padre.
Genotyping
- Técnica experimental que identifica diferencias en secuencias de DNA entre
individuos
- Genotipo <--à fenotipo
- Útil y necesario para mantener colonias de animales transgénicos cuando no
hay marcadores fenotípicos aparentes
- Problemas con el genotyping en humanos
o Se presta para discrimen de personas a base de genotipo y posibles
fenotipos.
o Los genes no garantizan el desarrollo de ciertos fenotipos (sean
condiciones poligénicas, monogénicas, SNP, etc.).
o Cuando usted usa un servicio de genealogía, usted compromete la
información genética de su familia inmediata y secundaria (y aveces
tercera).