UNIVERSIDAD NACIONAL INTERCULTURAL

“Fabiola Salazar Leguía” de Bagua

PRÁCTICA DE BIOQUÍMICA

VISUALIZACIÓN DE ADN BACTERIANO MEDIANTE ELECTROFORESIS EN

GEL DE AGAROSA
Los geles de agarosa proporcionan un método simple para analizar preparaciones de
ADN. Las moléculas de ADN comparten la misma relación carga/masa, lo que imparte
propiedades electroforéticas similares a las moléculas de ADN lineal de longitudes muy
variables. Usaremos "molécula" para referirnos a una pieza lineal de ADN, pero tenga
en cuenta que una sola "molécula" de ADN puede contener las secuencias de múltiples
genes o partes de genes.
INTRODUCCIÓN
La agarosa es un polisacárido purificado de algas rojas o algas marinas. La agarosa está
más purificada (¡y significativamente más cara!) que el agar, que se obtiene de las
mismas algas. Las moléculas de agarosa son polímeros lineales largos de un disacárido
repetitivo D-galactosa y 3,6-anhidro-α-L-galactopiranosa (figura 1). Una molécula de
agarosa típica contiene más de cien subunidades. La agarosa utilizada para la
electroforesis ha sido altamente purificada. El proceso de purificación elimina los
contaminantes que interferirían con las enzimas utilizadas en la clonación molecular,
como las endonucleasas de restricción. El proceso también genera una preparación de
agarosa con propiedades electroforéticas deseables y una mínima fluorescencia de
fondo, lo cual es importante para visualizar moléculas de ADN.

Figura 1: Disacárido repetitivo de D-galactosa y 3,6-anhidro-α-L-galactopiranosa

Las moléculas de agarosa son capaces de formar geles con tamaños de poro
relativamente definidos debido a
las propiedades químicas de las moléculas de agarosa. La agarosa demuestra histéresis:
su temperatura de fusión es mayor que su temperatura de gelificación. Las moléculas
de agarosa se disuelven a aproximadamente 90°C, formando bobinas aleatorias en
solución. Los geles se forman cuando la temperatura cae a aproximadamente 40°C. A
medida que se forma el gel, las moléculas de agarosa primero se ensamblan en fibras
helicoidales, que luego se agregan para formar redes de hélices superenrolladas
estabilizadas por enlaces de hidrógeno. Los tamaños de los poros, que típicamente
oscilan entre 50 y 200 nm, dependen de la concentración de agarosa. A medida que
aumenta la concentración de agarosa, el diámetro promedio del poro disminuye.
Factores que afectan la migración del ADN a través de geles de agarosa
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Debido a la carga negativa de los residuos de fosfato en la cadena principal del ADN, las
moléculas de ADN se mueven hacia el polo positivo (ánodo) del aparato de
electroforesis. La tasa de migración real de las moléculas de ADN en un experimento
particular se ve afectada por múltiples factores.
Algunos de estos factores son intrínsecos a las moléculas de ADN, mientras que otros
factores se relacionan con las condiciones electroforéticas. Los factores intrínsecos
incluyen tanto la longitud como la conformación de las moléculas de ADN que se están
analizando. Dentro de un cierto rango de tamaño dictado por las condiciones del gel, la
tasa de migración de las moléculas lineales de ADN es inversamente proporcional al
log10 del número de pares de bases. La migración de moléculas de ADN más
estructuradas, como los plásmidos superenrollados, es mucho menos predecible. Las
tasas de migración de estos ADN más altamente estructurados están influenciadas por
la densidad de bobinas, la presencia de mellas y otras características estructurales.

Las tasas de migración de las moléculas de ADN en geles de agarosa también se ven
afectadas por la composición del gel. La tasa de migración de una molécula de ADN
disminuye a medida que aumenta la concentración de agarosa en el gel. Los
investigadores suelen ajustar la concentración de agarosa para optimizar la resolución
de las moléculas de ADN dentro de un rango de tamaño particular. Los dos tampones
comúnmente utilizados en laboratorios, TAE (Tris: acetato: EDTA) y TBE (Tris: borato:
EDTA), también afectan las tasas de electroforesis.

Debido a esta variabilidad inherente, los investigadores siempre incluyen un carril de

patrones de ADN con tamaños conocidos en el mismo gel que las muestras que se
analizan. Es importante destacar que estos estándares necesitan tener una estructura
similar (por ejemplo, lineal o superenrollada) y ser sometidos a las mismas
modificaciones químicas que las muestras de ADN que se analizan.
Se utilizan agentes intercalantes fluorescentes para visualizar moléculas de ADN en
geles
Los ácidos nucleicos son visualizados por colorantes fluorescentes que se unen
fuertemente al ADN. Los colorantes son agentes intercalantes que se insertan en la
hélice de ADN y en regiones estructuradas de ácidos nucleicos monocatenarios. La
fluorescencia de estos colorantes aumenta en un orden de magnitud cuando se unen a
los ácidos nucleicos, por lo que la fluorescencia de fondo en los geles de agarosa suele
ser baja. Solía utilizarse bromuro de etidio (EtBr) para visualizar fragmentos de ADN.
EtBr absorbe la luz en el rango ultravioleta (UV) y emite luz naranja. Los geles se ven con
transiluminadores especiales que contienen luces UV. El EtBr es un compuesto sensible
a la luz, por lo que las existencias se almacenan en la oscuridad. Además es un
moderadamente tóxico y carcigógeno por lo que su uso está siendo reemplazado por
colorantes alternativos como el GelRed entre otros.
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Se utilizan estándares para estimar los tamaños de las moléculas de ADN

Un estándar de ADN es una mezcla patentada de
fragmentos de ADN lineales que varían en tamaño de
0.5 a 10 kilobases (kb). La intensidad de tinción de las
bandas en geles de agarosa refleja la cantidad de ADN
en la banda, porque EtBr se intercala de manera
bastante uniforme a lo largo de la longitud de las
moléculas de ADN lineales. Como puede ver, esta
mezcla en particular contiene cantidades similares de
cada fragmento de ADN, con la excepción del
fragmento de 3 kb, que tiene ~2.5 más ADN que los
otros fragmentos. La mayor intensidad del fragmento
de 3 kb sirve como marcador de orientación útil en
situaciones en las que fragmentos más pequeños
podrían haberse escurrido del extremo del gel o
cuando algunos marcadores no están bien resueltos
entre sí. (¡Estas son ocurrencias comunes!)
Tenga en cuenta que las moléculas más cortas en el
gel están más bien separadas entre sí que las
moléculas más largas. Los productos de PCR que
analizará en este laboratorio están en su mayoría en
el rango de 400-1000 pb. Para incrementar la
resolución de estas moléculas, se utilizan geles de
agarosa al 1.25%. (Esto reducirá la resolución de
moléculas de ADN más grandes). Obsérvese también Figura 2: Patrones de tamaño de
que las bandas más pequeñas aparecen más borrosas ADN
en el gel teñido, debido a que se han visto más
afectadas por la difusión aleatoria ya que han migrado a través de la red de polímeros
de agarosa.
PROCEDIMIENTO
1. Preparar un gel de agarosa a una concentración determinada (de 0.7 a 1.5% p/v)
que varía en función del tamaño del ADN que se quiera visualizar. (se puede
añadir el colorante si se requiere) El solvente a utilizar debe ser TBE 1X
2. Colocar el gel en la cubeta de electroforesis, que previamente se ha llenado con
tampón TBE 1X, de manera que el tampón cubra completamente el gel
3. Cargar el gel: Para ello, hay que añadir 1 µl de tampón de carga por cada 5 µl de
ADN (tampón de carga 6X), de manera que la muestra pese suficiente para que
caiga el interior del pocillo y no flote en el tampón TBE. También permite
observar la migración del ADN en el gel de agarosa
4. Colocar la tapa a la cubeta y seleccionar la intensidad de la corriente eléctrica
(entre 75 y 100 V).
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5. Una vez que se observa que el ADN ha migrado hasta un poco antes de alcanzar
el final de la cubeta, detener la corriente y sacar la base con el gel.
6. Separar el gel de agarosa de la base y visualizar en un transiluminador
ultravioleta.
ANEXOS

BUFFER DE CARGA PARA ADN (6X)

El tampón de carga de gel 6X (Omega Bio-Tek) está compuesto de un 0,03% de bromofenol

azul, un 0,03% de xileno cianol FF, 60 mM de EDTA, pH 7,6 y un 60% de glicerol en agua de
calidad para biología molecular
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Buffer TAE (Tris – Acetato- EDTA) (1L): Tris base, 242 g; ácido acético glacial, 57.1 ml; 0.5 M
EDTA pH 8, 100 ml. Ajustar hasta 1 litro con agua destilada o desionizada

Buffer TBE (Tris Borato EDTA) (1L): Tris base, 54 g; ácido bórico, 27.5 g; 0.5 M EDTA pH 8, 20 ml.
Ajustar hasta 1 litro con agua destilada o desionizada

Buffer de carga tipo I (6x): 0.25% azul de bromofenol; 0.25% xileno cianol; 40% sacarosa, en
agua. Almacenar a 4°C.

Buffer de carga tipo II (6x): 0.25% azul de bromofenol; 0.25% xileno cianol; 30% glicerol, en agua.
Almacenar a 4°C.