Extrado de las algas Polisacrido lineal (con peso molecular ~12 000 Da) Repeticin de la unidad bsica, la agarobiosa,

que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6- anhidrogalactosa.

D-galactosa

3,6-anhidro-L-galactosa

% Agarosa 0.75 1.0 1.25 1.5 2.0 2.5

Tamao de ADN (pb) 10000-15000 500-10000 300-5000 200-4000 100-2500 50-1000

Buffer de corrida

Fosfatos que le dan carga negativa a la molcula

Buffer de carga
xylene cyanol FF 1) Migra a aprox 4Kb; Azul de bromofenol 1) Ayuda a visualizar que la muestra este migrando en el gel 2) migra a una velocidad equivalente a si tuviera un peso de 200 a 400 pb DNA (depende del porcentaje de la agarosa) GLICEROL Aade densidad a la muestra

glicerol

Para cuantificar y visualizar el DNA se usan agentes colorantes fluorescentes, los cuales aumentan notablemente su emisin cuando se unen a la doble hlice.

Son agentes intercalantes que se introducen entre las bases del DNA. Generalmente son policclicos aromticos, hidrofobos y planares:

a) BROMURO DE ETIDIO b) SYBR Safe DNA gel staining (invitrogen)

Estos agentes interrumpen la alineacin y emparejamiento de las bases de las cadenas complementarias. La emisin de fluorescencia se da cuando se unen al DNA de cadena doble y depende directamente de la cantidad de ste.

Bromuro de etidio

Generalmente se usa en la deteccin de DNA de doble cadena en PCR en tiempo real. Es estable a un amplio rango de temperaturas. Es 25 veces ms sensible que el bromuro de etidio.

Es el ms utilizado en biologa molecular Teratognico Puede causar metahemoglobinemia

Se trata de reactivos mutagnicos, por lo que se deben trabajar con equipo de seguridad. El material contaminado con ellos generalmente se trata con nitrito sdico y cido hipofosforoso para su degradacin. Tambin son usados en PCR, citometra de flujo y separacin de cidos nucleicos por ultracentrifugacin.

Electroforesis en gel
Utiliza como soporte un gel de poliacrilamida o agarosa. Las molculas se separan de acuerdo con su tamao por su efecto de filtracin por geles, y tambin se separan por su carga. Para teir a las molculas sujetas a separacin se usan a) colorantes, b) autorradiografa o c) Western blot.

En el DNA, las diferencias de carga no son suficientes para determinar una separacin eficaz. ESENCIALMENTE CARGADO NEGATIVAMENTE (FOSTATOS) Electroforesis en gel: la forma y la carga son menos importantes, y la longitud molecular es el determinante crtico de la velocidad de migracin. EN PRESENCIA DE SDS

Gel de agarosa

Gel de poliacrilamida-SDS

Es ms frecuentemente usado para separar cidos nucleicos.

Es ms frecuentemente usado para separar protenas.

Cuando se separa DNA

Gel de agarosa

Gel de poliacrilamida-SDS

En ambos casos, el gel se prepara con distintas concentraciones en funcin del tamao de los fragmentos de DNA que se quieren separar.

Los fragmentos de DNA que puede separar son de hasta 20 kpb (ms grandes).

Se usan para separar fragmentos de ADN ms pequeos (aproximadamente hasta 1000 pb), ya que tienen mayor poder de resolucin.

Cuando se separan protenas

Gel de agarosa

Gel de poliacrilamida-SDS

Separa a la protena nicamente basado en la carga molecular neta. No separa protenas con diferentes tamaos pero con cargas similares.

Separa protenas basado tanto en carga elctrica como en tamao molecular. Separa protenas con diferentes tamaos pero con cargas similares. Mayor resolucin que la que se obtiene en un gel de agarosa.

Gel de agarosa

Gel de poliacrilamida-SDS

Corren en forma horizontal (submarina.)

Suelen emplearse en forma vertical.

Gel de agarosa En muestras de ADN que se someten a un campo elctrico durante cierto tiempo, podemos verlas separadas segn su tamao. Se usan estndares de peso molecular

Gel de poliacrilamida-SDS

Para estimar las masas macromoleculares comparando la muestra con estndares.

Gel de agarosa
Aplicaciones: El anlisis de fragmentos de polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccin. Anlisis de experimentos de DNA recombinante. Purificacin de sondas para ISH. Hibridacin por escisin de fragmentos de DNA de un gel seguidos por purificacin en minicolumna. Anlisis del punto final de PCR. Ensayos RT-PCR (deteccin de patgenos).

Gel de poliacrilamida Aplicaciones: El anlisis de fragmentos del punto final de PCR en el cual el tamao de los fragmentos sea ligeramente diferentes.

Sellar con cinta adhesiva el contorno de la bandeja de gel, colocar el peine.

Pesar 0.42g de agarosa en un matraz Erlenmeyer, aadir 35 mL de buffer TAE 1X. Tapar con algodn y calentar en microondas hasta que la agarosa se disuelva bien o 1 a 3 min.

Una vez que la temperatura sea entre 45 y 60C, aadir 2 L de bromuro de etidio.

Depositar el gel en la bandeja de la cmara y dejar polimerizar.

Quitar la cinta adhesiva y colocar la bandeja en la cmara de electroforesis. Aadir el amortiguador TAE.

Preparacin y cargado de muestras

Etiquetar 4 tubos de microfuga E, P, R1 y R2

Plsmido digerido con una enzima (R1) Plsmido digerido con dos enzimas (R2)

Reactivos

Estndar (E)

Plsmido sin digerir (P)

Muestra
Amortiguador de la muestra -

Centrifugar por 3 seg

Cargado de muestras

Colocar tapa

Aplicar 80 V De 30-40 min

Deteccin de las bandas:

1. Colocar gel sobre un transiluminador, encender la lmpara de UV 2. Visualizar bandas de DNA 3. Tomar fotografa 4. Determinar el peso molecular de las bandas

Std de peso molecular: Lambda HindIII Ladder

HindIII DNA Ladder se preparar por restriccin del fago seguido de la inactivacin de la enzima. Los 7 fragmentos 564 base pairs a 23.13 kilobases. 564, 2027, 2322, 4361, 6557, 9416, 23130 bp

Gel modelo
1.
2. 3. 4. 5.

6 T

6.

Std de peso molecular Sin restringir Sin muestra Restringido con 2 enzimas Restringido con 2 enzimas e incubado toda la noche Restringido 1 enzima

VR

P Inserto

RNA

T= topoismeros; P= plsmido vaco (5310); VR= vector+inserto (6500 pb), Inserto 1190

Bibliografa
Lizcano Losada F.; Fundamentos moleculares en medicina. El manual moderno, Espaa, 2005. p 41-43. Mendoza DF. Practicas de Laboratorio de Biologia Molecular: Su Aplicacin en Genetica Bsica. Editorial de Universidad del Rosario, Colombia, 2010. p 58-62 Luque Cabrera J. Texto ilustrado de biologa molecular e ingeniera gentica. Elsevier, Espaa, 2001. p 138.