IBT504-5

Procedimientos de Biología Molecular

Nombre: Geoconda Cañizares

Fecha de entrega: 12/10/2018

Resumen 2
Análisis de DNA

La electroforesis se lleva a cabo en geles de agarosa o poliacrilamida, se usa para la separación,

análisis, identificación y purificación de fragmentos de ADN ya que es una técnica simple y fácil de
realizar, sirve para detectar el ADN y soluciona procesos inadecuados en la purificación de ADN. La
ubicación de las bandas de ADN se detecta a través de tinciones con una baja concentración de
fluorescencia; hasta las cantidades más pequeñas de cadena doble de ADN pueden ser localizadas en
el gel por luz UV. Aunque el gel de agarosa y el de poliacrilamida tengan la misma función se
presentan en varios tamaños, formas y con distintas porosidades. Además, el gel de poliacrilamida
tiene mayor eficiencia en la separación de fragmentos pequeños de ADN, sin embargo, existe mayor
dificultad al momento de prepararlo ya que mantiene un campo constante electrónico en corrida
vertical y si no se lo maneja con cuidado, la muestra podría salirse del gel. Por otro lado, el gel de
agarosa mantiene un campo de corrida eléctrico horizontal y por eso es más confiable.
Electroforesis en Gel de Agarosa.
La velocidad de migración del ADN a través de los geles de Agarosa tiene la influencia de varios
factores como:
La ley de Ohm (V=IR): donde el movimiento depende del voltaje, I es la corriente en amperios y R es
la resistencia en ohms. Como los buffers son ligeramente alcalinos, el ADN se dirige en corriente
negativa hacia el ánodo.
El tamaño molecular del ADN: las moléculas de mayor tamaño migran más lento por la fuerza de
fricción, esto dependerá de la porosidad del gel.
Concentración de agarosa: influye en la movilidad del ADN a través de los poros hacia la carga
positiva; los cuales deberán tener un diámetro efectivo.
Conformación del ADN: el ADN superhelicoidal circular migrará con mayor rapidez, seguido del
circular y lineal.
Presencia de los colorantes en el gel y el buffer de electroforesis: la intercalación de colorantes
disminuye la carga negativa del ADN, retardando la migración en un 15%.
Voltaje aplicado: voltajes bajos afectan al ADN lineal, aunque, al aumentar el campo eléctrico crece la
movilidad de los fragmentos grandes de ADN.
Tipo de agarosa: Temperatura baja o media de fusión
Buffer de electroforesis: Interfieren los iones en la conductividad eléctrica, si es baja el ADN migrará
lento.
Clases de Agarosa y sus propiedades.
Agarosa de algas: es fabricada con Gelidium y Gracilaria las mismas que difieren en la temperatura
de gelificación y fusión entre las dos especies; en la práctica esta puede ser utilizada para el análisis y
aislamiento de fragmentos de ADN en el rango de 1kb a 25 kb.
Agarosa de temperatura baja de gelificación y fusión: su temperatura se encuentra alrededor de los
-65°C, en este tipo de agar se pueden conservar células sin ocasionarles daño.
Agarosa modificada químicamente: se usas especialmente en PCR para la separación de polimerasas,
en esta se ha logrado utilizar poliacrilamida para analizar fragmentos muy pequeños de ADN y ARN.
Ósmosis-electroendo: afecta la rapidez con el que migran los ácidos nucleicos a través del electrodo
positivo en los geles de agarosa. Los fragmentos de ADN pequeños no son afectados, pero si los de
gran tamaño.
Buffer de electroforesis: preferiblemente se utiliza TAE ya que, alarga los periodos de tiempo y
cambia de color cuando su pH disminuye, facilitando la identificación de los fragmentos de ADN.
Buffer de carga en el gel: Emplea bromofenol para que corra el buffer.
Análisis de los Fragmentos de ADN.
Después de la separación por electroforesis de los fragmentos de ADN detectados ya sea en geles de
agarosa o acrilamida, estos son transferidos hacia el soporte sólido que efectúa el sondeo de
fragmentos de ADN que estaban previamente desnaturalizados y su secuencia es identificada por
hibridación de pruebas radioactivas.
Recuperación del ADN de los geles.
Aunque la purificación del ADN en geles de agarosa es un paso esencial, los problemas que están
asociados a los métodos tradicionales están asociados a los inconvenientes producidos en el ligando,
la digestión o el marcaje al recuperar ADN. Además de la ineficiente recuperación de largos
fragmentos de ADN y de las pequeñas cantidades de ADN. Estas dificultades se resuelven al escoger
el mejor protocolo basado en el tipo de muestra, técnica a ser aplicada incluyendo el precio y tiempo
invertido.

Referencias:

Green M.R. y Sambrook J. (2012). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4° Ed.), Cold Spring
Harbor Laboratory Press.