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CAPÍTULO 12

ADN SEPARACIÓN MÉTODOS:

SLAB ELECTROFORESIS EN GEL Y
CAPILAR

Es un error capital teorizar antes de tener datos. Insensiblemente se empiezan a tergiversar los
hechos para adaptarlos a las teorías, en lugar de que las teorías se adapten a los hechos.
(Sherlock Holmes, Un escándalo en Bohemia)

INTRODUCCIÓN
LA NECESIDAD DE SEPARAR EL ADN

Una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en la que se amplifican los

alelos de las repeticiones cortas en tándem (STR) produce una mezcla de
moléculas de ADN que plantea un problema de separación. Una PCR múltiple
puede producir 20 o más fragmentos de ADN que deben resolverse entre sí.
Además, se requiere una resolución de una sola base para distinguir entre
alelos muy espaciados (por ejemplo, los alelos TH0l 9.3 y 10). El rango típico
de tamaño de separación en el que se necesita esta resolución de una sola base
está entre 100 y 400 pb. Además, es importante que el método de separación
sea reproducible y produzca resultados que puedan compararse entre
laboratorios.
Para distinguir las distintas moléculas entre sí, es necesario un paso de
separación para separar los fragmentos de distinto tamaño. La separación se
realiza normalmente mediante un proceso conocido como electroforesis y se
lleva a cabo en un entorno de placas de gel o capilares. En este capítulo se
tratará la teoría y los antecedentes de los métodos de separación. En el capítulo
13 se explica cómo se generan y detectan las bandas en la electroforesis en gel
y los picos en la electroforesis capilar. En el capítulo 14 se analizarán las
técnicas específicas que utilizan la electroforesis capilar y la electroforesis en
gel de placas, ampliamente utilizadas por los laboratorios de tipificación
forense del ADN.

ELECTROFORESIS

Los productos de la PCR del ADN de repetición corta en tándem deben separarse
de forma que cada alelo pueda distinguirse de los demás. Los alelos heterocigotos
se resuelven de esta manera con un método de separación basado en el tamaño
conocido como elec troforesis. El medio de separación puede tener la forma de un
gel de placas o de un capilar.
314 TIPIFICACIÓN FORENSE DEL ADN

La palabra "electroforesis" procede del griego electron (carga) y del latín phore
(portador). Así, el proceso de electroforesis se refiere a las cargas eléctricas
que llevan las moléculas. En el caso del ADN, los grupos fosfato de la
columna vertebral de la molécula de ADN tienen una carga negativa. Los
ácidos nucleicos son ácidos porque los grupos fosfato ceden fácilmente sus
iones H+, por lo que se cargan negativamente en la mayoría de los sistemas
tampón. Bajo la influencia de un campo eléctrico, las moléculas de ADN
migrarán lejos del electrodo negativo, conocido como cátodo, y se moverán
hacia el electrodo positivo, conocido como ánodo. Cuanto mayor sea el
voltaje, mayor será la fuerza que sentirán las moléculas de ADN y más rápido
se moverá el ADN.
El movimiento de los iones en un campo eléctrico genera calor. Este calor
debe disiparse o será absorbido por el sistema. Un calor excesivo puede hacer
que un gel genere bandas que "sonrían" o, en casos muy graves, el gel puede
literalmente fundirse y desmoronarse. Como se describirá al final del capítulo,
realizar la electroforesis en un capilar es una ventaja porque el calor se puede
disipar más fácilmente del capilar, que tiene una elevada relación superficie-
volumen.

GELES SLAB
Figura 12.1 Los geles en placa consisten en una matriz sólida con una serie de poros y una
Esquema de un sistema de solución tampón a través de la cual pasan las moléculas de ADN durante la
electroforesis en gel. El gel
electroforesis. Los materiales del gel se mezclan y se vierten en un molde para
horizontal se sumerge en un
tanque lleno de tampón de
definir la estructura del gel en placas. Se coloca un "peine" de muestra en el
electroforesis. Las muestras gel de manera que los dientes del peine queden incrustados en la matriz del
de ADN se cargan en los gel. Una vez que el gel se ha solidificado, el peine se retira dejando los pozos
pozos situados en la parte
que se utilizan para cargar las muestras de ADN. El formato básico de un
superior del gel. Estos pozos
se crean mediante un sistema de electroforesis en gel se muestra en la figura 12.1.
"peine" colocado en el gel
mientras se está formando.
Cuando se aplica el voltaje
a través de los dos
electrodos, las moléculas
de ADN se mueven hacia
ánodo
+ Gel
Pozo de
carga cátodo nn
DD DD
T
D

\
Tamp
el ánodo y se separan por ón
tamaño. El número de
I a
carriles disponibles en un
gel depende del número de
dientes del peine utilizado
- ADN
banda
s

para definir los pozos de

carga.
Al menos un carril de
cada gel está ocupado Tensión
\ Carriles
I +
por un estándar de de gel
tamaño de peso
molecular que se utiliza Vista Vista
para estimar los tamaños lateral superior
de las bandas de la
muestra en los otros
carriles.
 MÉTODOS DE SEPARACIÓN DEL ADN 315

TIPOS DE GELES

Hoy en día, en los laboratorios de biología molecular y de ADN forense se

utilizan habitualmente dos tipos de geles para conseguir separaciones de ADN.
Los geles de agarosa tienen un tamaño de poro bastante grande y se utilizan
para separar moléculas de ADN de mayor tamaño, mientras que los geles de
poliacrilo-amida se utilizan para obtener separaciones de alta resolución para
moléculas de ADN más pequeñas, normalmente inferiores a 500 o 1000 pb.
Los métodos de tipificación forense del ADN utilizan ambos tipos de geles. Los
métodos de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)
utilizan geles de agarosa para separar fragmentos de ADN cuyo tamaño oscila
entre ~600 pb y ~23 000 pb. Las moléculas de ADN de bajo peso molecular no se
separan bien con los geles de agarosa. En cambio, los alelos de STR amplificados
por PCR, cuyo tamaño oscila entre ~100 pb y ~400 pb, se separan mejor con geles
de poliacrilamida. En el caso de algunos loci STR que contienen microvariedades,
la capacidad de alta resolución de los geles de poliacrilamida es esencial para
separar moléculas de ADN de tamaño reducido que pueden diferir sólo en un
nucleótido.

GELES DE AGAROSA

La agarosa es básicamente una forma de alga y contiene poros del orden de

2000 angstroms (A) (200 nm) de diámetro. Los geles de agarosa se preparan
fácilmente pesando una cantidad deseada de polvo de agarosa y mezclándolo
con el tampón de electroforesis. Esta mezcla se puede llevar rápidamente a
ebullición mediante microondas, con lo que el polvo de agarosa se disuelve.
Después de que la solución se enfríe ligeramente, se vierte en una caja de gel
para definir la forma y el grosor del gel.
Se añade un peine a la agarosa líquida antes de que se enfríe para formar
pozos con sus dientes en la sustancia gelatinosa que resulta después de que el
gel "se fije". Una vez que la agarosa se ha gelificado, el peine se retira dejando
pequeños pozos que pueden contener de 5 a 10 µl de muestra o más,
dependiendo del tamaño de los dientes y de la profundidad a la que se hayan
colocado en el gel de agarosa. Los dientes del peine definen el número de
muestras que pueden cargarse en el gel, así como la ubicación de los carriles.
Existen principalmente dos tipos de peines: de dientes cuadrados y de dientes
de tiburón.
El tampón de electroforesis se vierte sobre el gel hasta que esté
completamente sumergido. En la electroforesis se suelen utilizar dos tampones:
Tris-acetato-EDTA (TAE) y Tris-borato-EDTA (TBE). Las muestras se
mezclan con un colorante de carga y se pipetean cuidadosamente en cada
pocillo del gel sumergido. Este colorante de carga contiene una mezcla de azul
de bromofenol, un colorante azul oscuro que ayuda a ver la muestra, y sacarosa
para aumentar la viscosidad de la muestra y ayudarla a permanecer en el pozo
antes de encender el voltaje e iniciar la electroforesis.
El número de muestras que pueden ejecutarse en paralelo en el gel viene
definido por el número de dientes del peine que se añaden al gel antes de que
se fije (y, por tanto, el número de pozos que se crearán). Normalmente, entre
ocho y 24 muestras
316 TIPIFICACIÓN FORENSE DEL ADN

se corren a la vez en un gel de agarosa. Los estándares de peso molecular se

ejecutan en algunos de los carriles con el fin de estimar el tamaño de cada
muestra de ADN después de la electroforesis.
Una vez cargadas las muestras, se coloca una tapa sobre la caja de gel que
contiene el gel sumergido y se conectan los electrodos de cada extremo del gel
a una fuente de alimentación. El ánodo (electrodo positivo) se coloca en el
extremo del gel más alejado de los pocillos para arrastrar las moléculas de
ADN a través del material del gel. Normalmente se colocan entre 100 y 600
voltios (V) a través de geles de agarosa de 10 a 40 cm de longitud, lo que crea
intensidades de campo eléctrico de aproximadamente 1 a 10 V/cm.
A medida que las moléculas de ADN son arrastradas por el gel, se separan
por tamaño, y las más pequeñas se mueven más rápida y fácilmente a través de
los poros del gel. Puede ser útil pensar en las moléculas de ADN como si
fueran corredores de maratón con diferentes habilidades. Todas empiezan
juntas al principio y luego se separan durante la "carrera" a través del gel. Las
moléculas de ADN más pequeñas se mueven con más rapidez que las más
Figura 12.2 Ilustración
grandes a través de los obstáculos del "recorrido" del gel y, por lo tanto, son
de la poliacria
más rápidas cuando se apaga el voltaje y se completa la "carrera". Una vez
polimerización del gel de
láminas. El tamaño de los finalizada la separación, el gel se escanea o se fotografía para registrar los
poros de un gel está resultados para su examen y comparación.
controlado por su grado de
reticulación, que depende
de las proporciones de GELES DE POLIACRILAMIDA
acrilamida y bisacrilamida
en el gel. La Los geles de poliacrilamida (PA) tienen tamaños de poro mucho más pequeños (-
polimerización suele ser 100-200 A) que los geles de agarosa (-1500-2000 A). El tamaño medio de los
inducida por los radicales poros de un gel es un factor importante a la hora de determinar la capacidad de un
libres resultantes de la
gel de placas para resolver dos ADN de tamaño similar
descomposición química
del persulfato de amonio. fragmentos. Los poros de los geles de PA se crean químicamente con un proceso
TEMED, un estabilizador de reticulación en el que intervienen la acrilamida y la bisacrilamida (figura 12.2).
de radicales libres;
también se añade a la
mezcla del gel para
estabilizar el proceso de
polimerización.
Se vierte un gel de □■□■■■■□
poliacrilamida entre dos
placas de vidrio que
definen sus dimensiones.
□■□■■□■□
Se coloca un espaciador
entre las placas para
definir el grosor del gel.
El tamaño típico del gel es
■ Monómero
de
acrilamida
de 17cmx 43cmx 0,4cm.
Las moléculas de ADN
fluyen a través de la
□ □ Reticulador
de
bisacrilamid
matriz de gel de a
poliacrilamida a lo largo
del eje z que va a la
página, como si fluyeran a □■■■■□
través de una valla de
eslabones con agujeros de
distintos tamaños.